Determinación de proteínas

Transcripción

1 Determinación de proteínas Curso EMA 2013 Ing. Agr. Marta del Puerto

2 Métodos para determinar proteínas Se basan en: a. Propiedad de las proteínas de absorber luz en el UV absorción A=280nm a. Capacidad de unirse a ciertos colorantes Biuret Lowry Acido Bicinconínico BCA Bradford a. Formación de derivados químicos

3 Propiedad de absorber luz en el espectro UV La mayoría de las proteínas muestran una absorción a 280 nm, la cual se atribuye al grupo fenólico de la tirosina y al grupo indólico del triptofano Tiene la ventaja de que no es necesario utilizar reactivos y la muestra no se daña o destruye durante la determinación.

4 Método de absorción UV Se determina la cantidad de luz absorbida una solución proteica. Para el cálculo de la concentración de dicha solución se aplica la ley de Lambert Beer: A = ε c l Donde: A = absorbancia = Coeficiente de extinción molar. l = longitud de la celda. C = concentración

5 - coeficiente de extinción molecular : la cantidad de luz absorbida por unidad de concentración Se utiliza el coeficiente de extinción de la Albúmina de Suero Bovino (BSA) que es de M -1 cm -1

6 Métodos colorimétricos Usan reactivos determinantes de color Miden por colorimetría en espectro luz visible Usa curva de proteína patrón (albumina suero bovino) Métodos donde la muestra se destruye

7 Curva patrón para métodos colorimétricos Curva patrón albumina suero bovino BSA

8 Método de Biuret Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el ion Cu +2 y los grupos NH4 de los enlaces pépticos en medio básico (NaOH o KOH)

9 Consideraciones del método de Biuret Reacción específica Color violeta se lee a 540nm contra curva estándar BSA La intensidad del color es proporcional a la cantidad de proteína Baja sensibilidad alta concentración de proteína

10 Método de Lowry Combina la reacción del Biuret con la reducción del reactivo de FOLIN-CIOCALTEAU por los grupos aromáticos de residuos de tirosina, triptófano, cistina cisteína e histidina. Origina compuesto azul intenso Mide a 750nm

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12 Método del ácido bicinconínico BCA Se basa en que las proteínas reducen los iones cúpricos del reactivo BCA a iones cuprosos en medio básico. Cambio de color del verde (BCA) al morado. OH- proteína + Cu +2 Cu +1 Cu +1 + BCA BCA-Cu +1

13 Método de Bradford Se basa en la unión del reactivo Comassieblue G250 a las proteínas en medio ácido Reconoce los aa arginina, fenilalanina, triptófano y prolina Origina color azul intenso A=595nm

14 Aa que reconoce el reactivo de Bradford

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16 Nitrógeno total o kjeldahl El método Kjeldahl se basa en la transformación del nitrógeno contenido en la muestra en sulfato de amonio mediante la digestión con ácido sulfúrico en presencia de un catalizador. El ion amonio obtenido se transforma en medio básico en amoníaco que se destila y valora con una solución de ácido patrón.

17 DIGESTIÓN n - C -NH 2 + mh 2 SO catalizadores 4 CO 2 + (NH 4 ) 2 SO 4 + SO 2 proteína calor NEUTRALIZACIÓN Y DESTILACIÓN (NH 2 )SO NaOH 2NH 3 + Na 2 SO 4 + 2H 2 O NH 3 + H 3 BO 3 (ácido bórico) NH 4 + H 2 BO 3 - (ión borato) TITULACIÓN H 2 BO 3- + H + H 3 BO 3

18 Tamaño de la muestra IMPORTANTE: homogeneizar la muestra: molido (<1mm) y mezclado Materiales sólidos Muestras liquidas CONT. DE PROTEINA % PESO DE MUESTRA mg Mas de 5% a 30% Menos 30% Conc de N mg/l Menor a Entre 20 y Entre 50 y Vol muestra ml

19 Proceso de digestión Romper los enlaces nitrogenados y liberar el nitrógeno como ion amonio Digestión en medio ácido H 2 SO 4 Catalizador Temperatura Tiempo

20 Cantidad de ácido a agregar muestra Suelo 10.0 Grasa 9.7 ml acido/ g muestra TRIGO PC % CHO % MG % Proteína 4.9 Carbohidratos 4.0 Arcilla 0.6 CALCULO PC = 12.5% * 4.9 ml/g = 0.61 CHO = 66.5% * 4.0 ml/g = 2.66 MG = 3.50% * 9.7 ml/g = 0.34 TOTAL 3.61 ml ácido

21 CATALIZADOR AGENTE REDUCTOR Mejorar la velocidad y eficiencia de la digestión MERCURIO COBRE SELENIO TITANIO MEZCLAS Se usa en algunos compuestos que requieren ser reducidos antes de digerir Sulfato de cromo, zinc, sucrosa, acido salicilico AGENTE OXIDANTE Acelera la descomposición Agente antiespumante H2O2

22 DESTILACION OBJETIVO: Convertir el nitrógeno amoniacal (NH4) en amonio (NH3) mediante el agregado de una álcali (KOH, NaOH) que se recoge en acido bórico (NH) 2 SO 4 + 2NaOH Na 2 SO 4 + 2H 2 O 2NH 3 NH 3 + H 3 BO NH 4 + H 2 BO 3 - ac borico ion borato

23 Titulación y cálculo de %N El ion borato se titula con un ácido débil H 2 BO 3- + HCl H 3 BO 3 Se determina el gasto de HCl para neutralizarlo %N = N HCl x gasto x 14 x 100 peso muestra N normalidad del acido mol/l Gasto ml de HCl 14 g/mol peso atómico del N 100 Factor de corrección Peso muestra gramos

24 Calculo de % proteína Se usa un factor de conversión según al % de N de la muestra En general se usa 6.25 = %N x 6.25 = %PC

25 Factor según la proteína en estudio

26 Ejemplo de determinación muestra Forraje fresco Forraje fresco P muestra fresca Gasto % nitrógeno Factor % PC Avena Hongos n Pupasp512 Base seca