ANTICUERPOS ANTINUCLEARES MANEJO CLÍNICO EN LA ENFERMEDAD REUMÁTICA SISTÉMICA
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- Mercedes Figueroa Vargas
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1 ANTICUERPOS ANTINUCLEARES MANEJO CLÍNICO EN LA ENFERMEDAD REUMÁTICA SISTÉMICA
2 Las enfermedades reumáticas sistémicas son un grupo de enfermedades de expresión clínica muy amplia y variada, tienen un curso crónico y se caracterizan por comprometer múltiples órganos y particularmente, al sistema musculoesquelético. En este grupo de enfermedades se encuentran: Lupus eritematoso sistémico LES-. Polidermatomiositis PM/DM Esclerosis sistémica - SSc. Artritis reumatoide AR. Artritis crónica juvenil ACJ. Enfermedad mixta del tejido conectivo EMTC Síndrome de Sjögren SS. El diagnóstico de estas enfermedades es difícil ya que suelen debutar de manera inespecífica con poliartralgias, polimialgias, fiebre de origen desconocido, alteración de origen renal o hepática o hipergammaglobulinemia.
3 Los autoanticuerpos y los ANA en particular, juegan un papel importante en el diagnóstico de estas enfermedades, incluso forman parte de los propios criterios diagnósticos en algunas de ellas, de manera que la determinación de los ANA se ha convertido en una práctica habitual para el estudio de las ERS. Los ANA son autoanticuerpos dirigidos contra componentes de partículas subcelulares localizadas en el núcleo, incluyendo estructuras nucleolares, nucleosomas (DNA, histona, cromatina), proteínas nucleares no histonas (antígenos nucleares extraíbles o ENAS como SSA/Ro, SSB/La, Sm, Scl 70, RNP, Jo-1, centrómero).
4 Métodos de determinación: La técnica mas habitual es la IFI utilizando células HEp-2, que son células de cultivo de epitelioma humano tipo II que permiten el reconocimiento de antígenos en todas las fases de la mitosis. Pueden observarse diversos patrones de fluorescencia que son inespecíficos aunque sugerentes de la presencia de un antígeno determinado: Patrón Nuclear Positivo: Patrón homogéneo: Fluorescencia intensa en el núcleo que lo ocupa por completo de manera homogénea. Células mitóticas positivas. Si ndna negativo puede corresponderse con ac. antihistonas positivos, lo que orienta sobre la existencia de Lupus inducido por fármacos, HCA o CBP. Si ndna positivo orienta sobre un LES, con lo que hay que completar el estudio con los ENAS. Patrón periférico: Si se observa un refuerzo en los bordes nucleares.
5 Patrón Membrana: Aumento de la fluorescencia a nivel de la membrana nuclear, puede confundirse con el patrón periférico, la diferencia entre ambos es que en este caso las células mitóticas son negativas. Su presencia debe orientarnos sobre HCA o CBP. Patrón Nucleolar: Observamos estructuras intranucleares bien definidas (nucleolos) con una fluorescencia que resalta sobre el resto de la célula. No podemos esperar ver los nucleolos aproximadamente tres, con fluorescencia intensa sobre un núcleo negativo, porque hay cierta luminosidad de fondo. Células mitóticas negativas. Completar el estudio con ENAS. Si son positivos orientara hacia un síndrome de Sjöegren o un LES. Si son negativos pensar en la posibilidad de Ac anti SCL-70 (Topoisomerasa I) o bien ac. anti PM-SCL en cuyo caso pensaremos con la posibilidad de una Esclerodermia o Polimiositis respectivamente. Patrón Moteado: Se observa en el interior del núcleo fluorescencia en forma de acúmulos (moteado grueso) o bien con aspecto nevado (moteado fino). Células mitóticas negativas. Debemos examinar los ENAS, si son negativos en general se corresponde con un patrón moteado muy fino lo que orienta hacia HCA, CBP
6 Si los ENAS son positivos, sobre todo a cargo del Sm/RNP, suele corresponderse con un patrón moteado grueso lo que nos orienta hacia EMTC, LES o AR. Si los ENAS positivos son a cargo del SSA/SSB, nos inclinaremos a pensar en un Sind. de Sjöegren o en un LES. Patrón Mitótico: Positivo Patrón Centrómero: Fluorescencia característica en el núcleo, puntos muy intensos de 8 10, siendo el resto del nucleo negativo. Células mitóticas positivas. Confirmar la sospecha de Sind. de Crest (Calcinosis, Raynaud, Esofagitis, Esclerodactilia, Telangiectasias. Patrón Centriolo: Se observan dos puntos fluorescentes, por lo general equidistantes, que reflejan la actividad mitótica de la célula. Se suelen asociar a infecciones post víricas, Epstein-Barr, Micoplasma pneumoniae.
7 Msa-2 o cuerpo medio: Se observa una imagen fluorescente en la zona de contacto entre dos células justo antes de separarse al concluir la mitosis. Se observa en procesos inflamatorios Estos tres patrones mitóticos no son muy frecuentes. Patrón Citoplasmático: Positivo Fibras o filamentos: Se observa fluorescencia citoplasmática de características lineales, filamentosas y hace referencia a la presencia de ac. anti Actina, Vimentina o Citoqueratina. Ante la presencia de este patrón de difícil reconocimiento es rentable la realización en triple tejido para caracterizar posibles ASMA (ac. anti músculo liso, F. actina), que estaría muy relacionado con HCA. Este patrón es posible verlo en AR y procesos inflamatorios crónicos.
8 Mitocondrial: Es uno de los patrones mas típicos. La fluorescencia es citoplasmática de características laminares y se puede acompañar de un moteado perinuclear. Debemos confirmar la presencia de estos anticuerpos con un triple tejido o a un soporte de riñón de rata, donde podemos ver fluorescencia localizada en los túbulos proximales o distales. A mayor aumento la fluorescencuia es moteada granular muy fina, definiendo este patrón. Esto es expresión de ac. anti mitocondriales tipo 2 (M2) localizados en la pared interna de la mitocondria.. Su presencia orienta hacia la presencia de CBP.
9 El título de ANA, aunque no el patrón de IFI, es útil para predecir la existencia de ENAS. De lo dicho se deduce que la IFI no proporciona información sobre el tipo de ANA presente en el suero siendo necesaria la determinación mediante EIA de los anticuerpos anti ENA y dsdna. Se ha comprobado que los ANA pueden ser positivos en personas sanas. La mayoría en diluciones bajas, menos de 1/80, especialmente en las mujeres, llegando a estar entre el % en los mayores de 65 años.
10 Para la determinación por IFI de los ANA se pueden usar distintos sustratos antigénicos: Tejidos de hígado o de riñón de rata. Líneas de células tumorales epiteliales obtenidas de carcinoma de laringe humana como son las células Hep-2. Tanto en los sustratos de tejido de roedor como los cultivos de células los autoantígenos se hallan en su localización nativa, sin desnaturalizar y conservando su estructura. Método de alta sensibilidad y buena especificidad que hoy se puede automatizar la manipulación de los portas. La técnica IFI es subjetiva, difícil de estandarizar y los resultados son semicuantitativos (títulos). Las líneas celulares Hep-2 presentan células idénticas, se obtiene un sustrato estandarizado con una población de células homogéneas
11 Presentan ventajas frente a los tejidos de roedor, mayor sensibilidad, presentan núcleos y nucleolos de mayor tamaño que permiten una mejor visualización de las estructuras y de los patrones de fluorescencia. Tienen capacidad de expresar determinados antígenos presentes en distintas fases del ciclo celular, de aquí la importancia de la presencia de células en mitosis en los preparados celulares. Permiten la posibilidad de detectar anticuerpos específicos frente a antígenos nucleares humanos no presentes en los tejidos de roedor, lo que proporciona una mejor especificidad que los tejidos animales. La diferencia entre estos dos sustratos antigénicos está en la cantidad de antígenos nucleares que contienen y por consiguiente la posibilidad de detectar o no un anticuerpo en el suero de pacientes con ERS. Así en el LES el % de las pruebas realizadas en tejido de roedor son positivas mientras que en Hep-2 el 95 % son positivas.
12 En el total de estudios de grado A revisados en las guías de práctica clínica (GPC) para las distintas ERS se observa que el 43 % de ellos utilizan sustratos de roedor y que el 57 % utilizan líneas celulares Hep-2, no haciendo referencia a la sensibilidad y especificidad relacionada con cada tipo de tejido. Para la visualización de los ANA en los tejidos o células, se utiliza una antiinmunoglobulina conjugada con un compuesto fluorescente como el isocianato de fluoresceina. La inmunoglobulina conjugada puede ser IgA, IgG o IgM, la determinación de los ANA del isotipo IgG debe ser el primer paso en el diagnóstico de laboratorio de las ERS. Hay que tener en cuenta que ciertos anticuerpos frente a antígenos como el SSa/Ro y las t-rna sintetasas (Jo-1) no siempre podrán ser detectadas en sustratos de células Hep-2 debidos a la escasez de dichos antígenos en la célula, a su alta solubilidad o a la posible desnaturalización de los mismos debidos a la fijación. Los sustratos fijados con acetona son preferibles a los fijados con metanol o etanol.
13 La fluorescencia fijada en el sustrato correspondiente se observa en un microscopio de fluorescencia, dando lugar los autoanticuerpos a imágenes características según los distintos antígenos implicados, conociéndose como patrones de fluorescencia, los cuales sugieren la presencia de un autoanticuerpo específico que se asocia a diferentes ERS. Los patrones descritos en los tejidos de roedor no son los mismos que se pueden observar en las células Hep-2. Un determinado patrón orientará hacia determinados anticuerpos específicos frente a antígenos extraíbles del núcleo o ENAS y otros anticuerpos distintos a los ANA como los anticuerpos anti-mitocondriales que orientan hacia patologías de interés para el diagnóstico del paciente autoinmune. La concentración de autoanticuerpos se obtiene diluyendo el suero con una solución tampón a ph fisiológico y se obtiene en forma de título.
14 Es muy importante realizar diluciones seriadas, pues un patrón de fuerte intensidad puede ocultar otras especificidades que aparecerán una vez diluida la muestra de suero. La determinación de los ANA tiene una alta variabilidad metodológica y dificulta la estandarización. Los resultados de los ANA varían ampliamente dependiendo de múltiples factores, entre ellos están la diversidad de los sustratos, los tipos de fijación y los métodos utilizados para su detección. Esta variabilidad viene además condicionada por otros factores tales como las características del conjugado de fluoresceína utilizado, la intensidad de fluorescencia de la lámpara del microscopio y por la interpretación subjetiva del observador. Se ha descrito una variabilidad de la determinación de los ANA para un título 1/40 del 16 % intra-laboratorios y del 51 % interlaboratorios.
15 Determinación de los ANA por ELISA Ser ha incorporado este método a la práctica diaria como alternativa al método IFI. Es un método rápido, sencillo y sensible que permite detectar autoanticuerpos específicos frente a distintos antígenos de manera objetiva y automatizada. La utilización de este método se ha ido incrementando en los últimos tiempos como prueba de cribado, para seleccionar aquellos sueros positivos para ANA en los cuales se determinará posteriormente otros autoanticuerpos específicos. Si comparamos este método con la IFI, este método no permite detectar ciertos ANA atípicos, ni obtener información sobre los distintos patrones de fluorescencia. Los resultados son semicuantitativos y las unidades arbitrarias.
16 En las técnicas de ELISA la cuestión mas importante es la calidad de los antígenos. Es fundamental que la secuencia y conformación del antígeno utilizado sea idéntica a los antígenos humanos. Para evitar falsos positivos debido al fondo proteico del extracto antigénico deberá estar purificado de la mejor forma posible. Deberá manipularse con muchísimo cuidado para evitar que se altere su estructura original y tener una elevada estabilidad en el proceso de recubrimiento Si los antígenos se obtienen de tejidos animales, hay que tener en cuenta que la proteína no es idéntica a la humana. La mayor dificultad es la purificación del antígeno para que no disminuya su especificidad. La obtención de antígenos recombinantes humanos mediante la producción en cultivos de bacterias o células eucariotas, soluciona alguno de estos inconvenientes.
17 Los equipos de ELISA pueden contener: Escasa variedad de antígenos Mezclas de antígenos purificados, recombinantes, extractos antigénicos procedentes de preparaciones de células completas. Extractos enriquecidos con ciertos autoantígenos mas escasos en la célula Se pueden encontrar falsos negativos debido a la ausencia de determinados antígenos en las mezclas antigénicas incorporadas a la pared del pocillo. También influye si los conjugados son de tipo IgG o conjugados polivalentes.
18 UTILIDAD CLÍNICA Se detectan ANAS + en la mayoría de los pacientes con ERS. También se detectan ANAS + en otras enfermedades no reumáticas como HAI, esclerosis múltiple, púrpura trombocitopénica idiopática, tiroidiopatias autoinmunitarias, la fibromialgia, enfermedades infecciosas, CBP, colangitis esclerosante primaria, tumores sólidos, linfomas y melanomas. En estos casos su determinación no es útil para el diagnóstico, pronostico ni seguimiento de estas enfermedades. Los ANA son muy útiles para el diagnóstico de LES y esclerodermia y algo menos para el diagnóstico del síndrome de Sjögren y la Polimiositis/Dermatomiositis. Son muy útiles para el control de la evolución y el pronostico de la artritis crónica juvenil y el fenómeno de Raynaud. Son criterio diagnóstico en el lupus asociado a fármacos, el LES y la EMTC. No son útiles para el diagnóstico, el pronóstico, ni el seguimiento de la artritis reumatoide y las vasculitis.
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