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2 Pr o p a g a c i ó n in v i t r o d e v i d v a r i e d a d Globo Rojo Micropropagación de vid variedad Red Globe

3 Universidad Autónoma de Ciudad Juárez Javier Sánchez Carlos Rector David Ramírez Perea Secretario General Hugo Staines Orozco Director del Instituto de Ciencias Biomédicas Martha Patricia Barraza de Anda Coordinadora General de Investigación y Posgrado Servando Pineda Jaimes Director General de Difusión Cultural y Divulgación Científica

4 Universidad Autónoma de Ciudad Juárez Pr o p a g a c i ó n in v i t r o d e v i d v a r i e d a d Globo Rojo Micropropagación de vid variedad Red Globe Pedro Osuna Ávila Carlos Saucedo Ciencias agropecuarias Co o r d i n a c i ó n Ge n e r a l d e In v e s t i g a c i ó n y Po s g r a d o Lisbeily Domínguez Ruvalcaba Coordinadora de la colección

5 Osuna Ávila, Pedro. Propagación in vitro de vid variedad Globo Rojo / Pedro Osuna Ávila, Carlos Saucedo. Ciudad Juárez, Chih. : Universidad Autónoma de Ciudad Juárez, (Colección Textos Universitarios, serie Investigación) 32 p.; 30 cm. Colección Reportes Técnicos de Investigación ISBN: Serie ICB, Vol. 6, ISBN: La fuente de material vegetal para iniciar el proceso de propagación in vitro de vid variedad Globo Rojo, fueron las yemas axilares y apicales, que se sometieron a un proceso de desinfección y a una estimulación de reguladores de crecimiento, para la rápida estimulación del desarrollo de nuevos brotes, donde las características agronómicas serán preservadas. Vid Cultivo in vitro Viticultura SB O D.R Pedro Osuna Ávila, Carlos Saucedo La edición, diseño y producción editorial de este documento estuvo a cargo de la Dirección General de Difusión Cultural y Divulgación Científica, a través de la Subdirección de Publicaciones Corrección: Jorge Hernández Martínez Diagramación: Diana Prado González Diseño de cubierta: Diana Prado González Primera edición, Universidad Autónoma de Ciudad Juárez Av. Plutarco Elías Calles 1210 Fovissste Chamizal, C.P Ciudad Juárez, Chihuahua, México Tel. +52 (656)

6 Ín d i c e Resumen 7 Ab s t r a c t Palabras clave 9 Usuarios potenciales 9 Reconocimientos 9 I. In t r o d u c c i ó n 11 II. Pl a n t e a m i e n t o Marco teórico 13 III. Me t o d o l o g í a Material vegetal 19 Establecimiento aséptico del explante 19 Multiplicación de brotes 20 Enraizamiento de los brotes 20 Etapa de aclimatación 20

7 IV. Re s u l t a d o s Asepsia del explante 21 Selección del explante para la etapa de multiplicación de brotes 21 Evaluación del explante de yema axilar 22 en multiplicación de brotes 22 Enraizamiento de los brotes 23 Aclimatación a condiciones de invernadero 24 V. Co n c l u s i o n e s Bibliografía 27 Anexo 29 Tabla 1. Número de hojas inducidas en el explante de yemas axilares 30 Tabla 2. Longitud de plantas a partir del explante de yemas axilares 31

8 Re s u m e n La fuente de material vegetal para iniciar el proceso de propagación in vitro de vid variedad Globo Rojo, fueron las yemas axilares y apicales, que se sometieron a un proceso de desinfección y a una estimulación de reguladores de crecimiento, para la rápida estimulación del desarrollo de nuevos brotes, donde las características agronómicas serán preservadas. El mejor tratamiento en la desinfección del explante, fue el de cloro al 50% durante 5 minutos, que indica que los explantes, tanto el ápice como las yemas axilares, no sufrieron daños físicos por el desinfectante y estuvieron listos para usarse en los siguientes estudios. Al observar el comportamiento de los tratamientos con benzilaminopurina en desarrollo, tanto del explante de ápices como de yemas axilares, se consideró al de yemas axilares como el explante para usarse en la etapa de la multiplicación de brotes. La comparación de medias de Tukey (α = 0.05), detectó que las mejores concentraciones de benzilaminopurina en la multiplicación de brotes, fue de 3 y 4 µm. Los brotes fueron exitosamente enraizados con el regulador de crecimiento de ácido indolacético. Las plántulas sobrevivieron al transferirse de las condiciones del cultivo in vitro, al sustrato de suelo en condiciones de invernadero. Con base en los resultados, se pudo establecer un protocolo de multiplicación in vitro para la variedad de vid Globo Rojo, que podría diversificar los sistemas de producción en la región de Ciudad Juárez, Chihuahua. 7

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10 Ab s t r a c t The source of this study began with the axilar buds and shoot apexes. Both explants where submitted into the disinfection process and were cultured on growth regulators to promote de novo shoots where the agronomic characteristics are preserved. The best disinfection treatment of the explants was 50% bleach for 5 minutes. This indicates that both explants (axilar bud and shoot apex) were healthy without any damages caused by the bleach product and were ready to use in the next experiments. The mean comparison, according to Tukey (α = 0.05), detected that the best treatments in the shoot multiplication stage were 3 and 4 µm of benzilaminopurine. The shoots were successfully rooting with the growth regulator of indolacetic acid. The seedlings survived when they were transferred from in vitro culture to soil substrate on green house conditions. According with these results, the micropropagation protocol for grape variety Red Globe established the possibility of diversifying the production systems in the region of Ciudad Juárez, Chihuahua. Cultivo in vitro, uva, Red Globe. Palabras clave: Usuarios potenciales: Fruticultores, agricultores, empresas privadas de producción agropecuaria, procesadores de alimentos, exportadores de productos. Reconocimientos: Se agradece al estudiante Carlos Saucedo, por su participación en el desarrollo del protocolo en el Laboratorio de Cultivo In Vitro de Tejidos Vegetales, así como a la Universidad Autónoma de Ciudad Juárez (UACJ), por instalar en uno de sus espacios este laboratorio. 9

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12 I. In t r o d u c c i ó n En la actualidad, el consumo de uva de mesa, especialmente de Vitis vinifera L. variedad Globo Rojo, tiene una gran demanda a nivel mundial (FAO, 2004). España es el país con el mayor territorio destinado al cultivo de uva, seguido por Italia, Turquía, China y Estados Unidos. La variedad de uva Globo rojo, fue obtenida en 1958 por Olmo y Koyoma en Davis, California, como resultado de una cruza múltiple de los genotipos (Hunisia x Emperor) x (Hunisia x Emperor x Nocera). Los frutos de esta variedad, son esféricos, con un tamaño de 24 a 28 mm de diámetro ecuatorial, y con sabor neutro. Las características de la baya son: colores rojo, rojo vino, rosa o rojo violáceo, pulpa crujiente y piel gruesa, resistente y fácil de desprender. La mayoría de los frutos de otras variedades, son sensibles al manejo y al transporte, ocasionando fuertes pérdidas a la poscosecha. Sin embargo, la uva variedad Globo Rojo tiene características sobresalientes, que no son fáciles de encontrar en otras variedades de uva de mesa. Por ejemplo, el racimo es muy grande, cilíndrico, cónico y de semisuelto a semicompacto. Estas características evitan la pérdida por presión entre las bayas. Además, la vid presenta una buena conservación, tanto en la planta como en condiciones de refrigeración, que le permitiría adaptarse a las condiciones del mercado. La variedad es resistente al manejo y al transporte a largas distancias, que podría extenderse a lo largo del mercado nacional e internacional. Al producir esta variedad en Ciudad Juárez, se lograría bajar los costos de producción y mejores precios del producto al consumidor. Esta variedad de uva es muy atractiva al consumidor, por el tamaño y color de su baya, y está por convertirse en la favorita a nivel mundial; de aquí la importancia de su propagación (Exportadora San Juan, 2007). La propagación comercial de la vid, no ha cambiado radicalmente por siglos, pero los métodos básicos usados hoy, son aquellos de nuestros ancestros. El método principal es mediante el enraizamiento de estacas dormantes de 15 a 20 cm de largo, técnica que ha sobrevivido a lo largo del tiempo. Sin embargo, este método no nos permite un rápido abastecimiento de material vegetativo de uva, para nuevas áreas de siembra en la región. 11

13 12 Con el éxito de los programas de selección clonal, los virólogos, quienes obtuvieron plantas libres de virus, o los fitomejoradores, que desarrollan nuevas variedades, tienen una gran necesidad de un rápido abastecimiento de especímenes únicos, así que los clones pueden estar disponibles en suficientes cantidades para el establecimiento de viñedos para producción comercial (Chee, et al., 1984). Un método que se propone para cubrir estas demandas de producción comercial, es la llamada multiplicación vegetativa in vitro, que podría abastecer un gran número de clones en un periodo corto de tiempo, sin importar las estaciones del año. La técnica de multiplicación vegetativa in vitro, a partir de yemas axilares y apicales, se refiere a la rápida estimulación del desarrollo de brotes apicales (meristemos), a través de reguladores de crecimiento, donde las características agronómicas son preservadas (Toro, 2003). El presente estudio tiene como finalidad establecer un protocolo de propagación in vitro de vid variedad Globo Rojo, que serviría de base para poder iniciar una producción a mayor escala. Esto podría convertir de nuevo a Ciudad Juárez en una entidad más de producción de uva en el país, con el potencial de diversificar la producción agrícola y abrir nuevas fuentes de empleo en el campo. Propagación in vitro de vid variedad Globo Rojo

14 II. Pl a n t e a m i e n t o La uva variedad Globo Rojo, es frecuente encontrarla en los mercados de consumo a lo largo del año, pero es muy atractiva para consumo en fresco en las épocas de fiesta internacional como la Navidad. Por sus cualidades únicas, es una uva de gran tamaño, de cáscara firme y cuerpo tierno con semillas grandes, y al madurar, se caracteriza por su color rojo oscuro y un brillo ligero. Presenta una buena conservación, tanto en la planta como en condiciones de refrigeración, que le permitiría adaptarse a las condiciones más exigentes del mercado. La fruta es resistente al manejo y al transporte a largas distancias, que podría extenderse a lo largo del mercado nacional e internacional. Al reintroducir esta variedad en Ciudad Juárez, se comercializaría al más alto precio con Estados Unidos, ya que la mayoría de la producción proviene de Argentina y Chile. Es la variedad favorita a nivel mundial y la hace muy atractiva, para capitalizar los productos agrícolas del estado de Chihuahua. La herramienta más viable de abastecer continuamente de material vegetal a nivel comercial en menos tiempo, es la técnica in vitro de cultivo de tejidos vegetales. Marco teórico De acuerdo con el Departamento de Agricultura de Estados Unidos, en 2004 la superficie cultivada para uva de mesa en México fue de hectáreas, de las cuales fueron cosechadas, obteniendo una producción total de toneladas. De acuerdo con la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (Sagarpa) (2003), Sonora cultiva el 90% de la vid de mesa. El crecimiento de la producción de China, lo mantiene como el principal productor de uva de mesa. Se espera que este año las contribuciones de Italia y México, se incrementen en y toneladas, respectivamente (INFOCIR, 2005). Chile es el principal proveedor durante el periodo noviembre-abril, y México, durante los meses de mayo, junio y julio. Otra de las ventajas que le permiten a México 13

15 14 ubicarse como uno de los principales proveedores del mercado anglosajón, es la cercanía a la principal zona productora en Estados Unidos, lo que le permite reducir costos en fletes y tratamientos poscosecha. En Ciudad Juárez, durante el siglo XVIII, los más importantes lugares con viñedos de esta vasta región, fueron impulsados y privilegiados por la Corona española mediante la exención de impuestos. Tales fueron los casos de Santa María de las Parras, cuya producción llegaba a más de 24 mil arrobas en 1777, y Real Presidio del Paso del Norte (Ciudad Juárez, Chihuahua) (Corona, 2004). En el libro Historias cercanas, se menciona que la gente solía degustar los frutos producidos por los viñedos de Ciudad Juárez, Chihuahua, y revela que esta ciudad tiene una gran historia en el cultivo de la vid, ya que fue una de las regiones más importantes de éste, siendo plasmada en el escudo de Ciudad Juárez (Chávez, 1991; Pérez-López, 2003). La uva tradicionalmente se propaga de manera vegetativa mediante acodos, ya sea aéreos o terrestres, e injertos, aunque las estacas leñosas maduras, se usan con mayor frecuencia para producir estacas arraigadas, para la propagación masiva de árboles femeninos de variedades selectas (Kartman y Kester, 1995). Sin embargo, la herramienta biotecnológica del cultivo in vitro, se basa en el concepto de la totipotencialidad celular, donde cada célula tiene el potencial de producir una planta completa (Margara, 1988). El que cada célula pueda producir un clon, hace de la propagación tradicional una técnica con desventaja. Por ejemplo, Haberlandt (1902), con la idea de la totipotencialidad celular, desarrolla el primer cultivo in vitro de tejidos vegetales. El cultivo de tejidos, como técnica, consiste esencialmente en aislar una porción de la planta (explante) y proporcionarle artificialmente las condiciones físicas y químicas apropiadas, para que las células expresen su potencial intrínseco o inducido y producir un mayor número de copias de la planta usada (Hurtado y Merino, 1991). El medio de cultivo, es la combinación sólida o líquida de nutrientes y agua. Usualmente incluye sales inorgánicas, carbohidratos, vitaminas y aminoácidos. A menudo se denomina medio basal y puede ser suplementado con algún regulador de cremiento, y ocasionalmente con otras sustancias con actividad hormonal. Los nutrientes son esenciales para el crecimiento y desarrollo de una planta, ya que sin agua y nutrientes minerales no puede vivir in vitro ni in vivo. También se deben añadir azúcares al medio de cultivo, ya que las plantas (o sus fragmentos) no son completamente autotróficas cuando se desarrollan en estas condiciones (Aceves y Hernández, 1997; Roca y Santana, 1992). Los reguladores de crecimiento (RC), son esenciales en los medios de cultivo, ya que orientarán al explante a la formación de nuevos brotes. Los RC son sustancias extraídas de algún tejido vegetal o sustancia sintética, que tienen el efecto de regular el crecimiento; de aquí la procedencia de su nombre como regulador del crecimiento vegetal. También se les conoce erróneamente como hormonas del crecimiento, término mal empleado, debido a que estos reguladores no son endógenos del material Propagación in vitro de vid variedad Globo Rojo

16 vegetal, sino que son agregados al medio de manera exógena, para obtener un mejor desarrollo y crecimiento del material vegetativo. De tal forma que estos reguladores del crecimiento vegetal son, entonces, compuestos orgánicos distintos a los nutrientes, que en cantidades pequeñas aumentan, evitan o cambian de alguna manera el proceso natural y fisiológico en la planta. De acuerdo a sus características y a los efectos que tienen sobre el material vegetal, estos reguladores de crecimiento se dividen en tres grandes grupos (Hurtado y Merino, 1991). Existe una clasificación de los reguladores de crecimiento, de acuerdo al efecto que producen en el material vegetal, y pueden ser promotores de crecimiento, por ejemplo: auxinas, citocininas y giberalinas. Las auxinas son sintetizadas en el tallo y ápices, para luego ser transportadas a lo largo de toda la planta. La acción primaria de éstas, es la elongación de las células. También estimulan la división y diferenciación celular, y en conjunto con las citocininas, regulan procesos de desarrollo muy importantes. En el cultivo de tejidos, son utilizadas conjuntamente con las citocininas para controlar la diferenciación y la morfogénesis. Las citocininas promueven el crecimiento y desarrollo de las células. La primera citocinina en ser identificada, fue la cinetina, la cual fue aislada de muestras de ADN de espermatozoides. Esta citocinina ha sido la encargada de los incrementos en la división celular del cultivo de células de tabaco. Subsecuentemente, la zeatinina fue aislada del maíz. Químicamente, las citocininas son derivadas de la base nitrogenada y son frecuentemente utilizadas en el cultivo de tejidos, y las más usadas son: cinetina, benzilaminopurina, zeatinina y adenina (Evans et al., 2003; Hurtado y Merino, 1991). Las yemas axilares y apicales, son explantes comúnmente usados en la micropropagación de las plantas. Ibáñez et al. (2003) utilizaron varias citocininas, para la obtención de brotes de Vitis vinifera L. cv. Napoleon. De las citocininas ensayadas (6-benziladenina (BAP), kinetina (K), 2-isopenteniladenina (2iP), y tidiazuron (TDZ), BAP fue la que produjo mejor respuesta morfogénica. Las mejores concentraciones de 6.67 y 8.9 µm de BAP, promovieron un 100% de proliferación de brotes. Mesa (2001) realizó un ensayo, a fin de implementar una metodología de propagación in vitro, para un nuevo cultivo de uva de mesa (Vitis vinifera L.). Se utilizaron brotes en activo crecimiento de 40 cm de longitud desarrollados al aire libre. Se obtuvieron segmentos nodales de las regiones apical, media y basal, de 25 mm de longitud, las cuales fueron reducidas a microestacas de mm con un nudo cada una. El medio de cultivo utilizado fue el de Murashige y Skoog (1962) en todas las etapas, suplementado con 0.4 mg/i de tiamina, 100 mg/i de inositol, 170 mg/i de NaH2- PO4 y sacarosa al 3%, para las etapas de establecimiento y proliferación. En la etapa de establecimiento, se consideraron las siguientes variantes: 2 mg/i de BAP, 1 g/i de gelrite y 1.8 g/i de agar Merck. Para la fase de proliferación, se usaron: 1.1 mg/i de BAP, 80 mg/i de sulfato de adenina y 2 g/i de gelrite más 0.5 g/i de agar Merck. 15 II. Pl a n t e a m i e n t o

17 16 Manzur (2005) para el medio de establecimiento de los ápices, utilizó MS al 50% de su concentración (2.2 g/l), adicionando sacarosa (30 g/l), hidrolizado de caseína (100 mg/l), BAP (0.6 mg/l), ácido ascórbico (50 mg/l), gelificantes con agar (Midesa) (3 g/l) y Phytagel (2 g/l). Para estimular el crecimiento de los ápices, utilizó MS completo (4.43 g/l), adicionando sacarosa (15 g/l), hidrolizado de caseína (100 mg/l), BAP (0.4 mg/l), hidroxiquinoleína (1.25 mg/l), PVP-40 (1 g/l), glicina (2 mg/l) y glutamina (600 mg/l). También usó gelificantes con agar (Midesa) (3.5 g/l) y Phytagel (2 g/l). Para el enraizamiento de los brotes, generalmente son usadas las auxinas como reguladores de crecimiento. Ibáñez et al. (2003), en la fase de enraizamiento, utilizaron 0.4 mg/i de tiamina, 25 mg/i de inositol, 0.2 mg/i de AIA, sacarosa al 1%, 150 mg/i de NaH2PO4 y 1.5 g/i de gelrite más 0.5 g/i de agar Merck. En primer término, evaluaron el efecto del origen del explante en el establecimiento in vitro de Vitis vinifera L. Los mejores resultados los obtuvieron en microestacas de origen apical, ya que consiguieron un mayor número de hojas y una alta tasa de proliferación potencial. También evaluaron el comportamiento in vitro en función del medio de proliferación y el origen del explante. Los mejores resultados del mayor crecimiento en número de hojas y número de raíces, los obtuvieron con concentraciones de 0.2 mg/i de AIA, usando microestacas apicales y estacas disectadas en las partes medias de las plantas. Manzur (2005) promovió el enraizamiento, al utilizar el medio de Murashige y Skoog, adicionando sacarosa (15 g/l), hidrolizado de caseína (100 mg/l), AIB (0.5 mg/l), hidroxiquinoleína (1.25 mg/l), PVP-40 (1 g/l), glicina (2 mg/l), glutamina (600 mg/l) y gelificantes (3.5 g/l de Midesa y 2 g/l de Phytagel). Durante todo el cultivo in vitro, las condiciones en la cámara de crecimiento fueron de 16 horas luz (5000 lux) y 8 horas de oscuridad, y temperatura de 22 ± 5º C. Se utilizaron frascos de vidrio de 15 cm de largo y 2.5 cm de diámetro con un volumen total de 60 ml, pero únicamente con 10 ml de medio, cubiertos con papel de aluminio. Saffie y Dominique (2002) realizaron el enraizamiento in vitro, utilizando el medio de Murashige y Skoog (1962), con macro y micronutrientes al 100% y 50%, pero sin reguladores de crecimiento. Las plantas enraizadas deben de transferirse a suelo, bajo condiciones de invernadero, para que realicen su actividad normal de autótrofas. Saffie y Dominique (2002) realizaron dos ensayos, entre abril de 2001 y marzo de 2002, con el fin de aclimatar plantas de vid propagadas in vitro. En el ensayo 1, se comparó el efecto de la preaclimatación y del enraizamiento in vitro versus ex vitro de plantas de vid propagadas in vitro en su respuesta a la aclimatación. Usaron microestacas de 3 cm de largo, con tres a cuatro hojas verdaderas. Los tubos que se preaclimataron, los taparon con papel filtro y sobre éste se colocó papel aluminio, al cual se le hizo un orificio de 3 mm, aproximadamente, y luego los sellaron con parafilm. Los tubos que no se preaclimataron, se taparon solamente con papel aluminio y se sellaron con parafilm. Se demostró en plantas de vid enraizadas in vitro, que preaclimatando se logran tasas de sobrevivencia más altas. Sin embargo, Propagación in vitro de vid variedad Globo Rojo

18 con respecto a la sobrevivencia de las plantas ya aclimatadas, no influye el tipo de enraizamiento, la preaclimatación ni el sustrato. Manzur (2005) llevó a cabo la aclimatación de explantes con al menos dos raíces primarias bien formadas y cuando éstas alcanzaron un tamaño superior a 3 cm, se extrajeron de los frascos de cultivo y se eliminaron los restos de agar de las raíces con chorro de agua corriente. Las plantas limpias se sumergieron en una solución de Ridomil (0.5 g/l) o Captan (2.5 g/l) y se establecieron en bandejas de poliuretano (para 40 plantas en espacios de 7 x 7 x 8 cm). El sustrato fue una mezcla (2:1) de turba/perlita estériles. La aclimatación fue en una cámara con condiciones ambientales (90% HR, 24 ºC, fotoperiodo de 12 horas luz [3000 lux]). En esta cámara, las plantas permanecieron hasta que se presentó una hoja nueva desplegada (alrededor de tres semanas). Durante la primera semana, se abrió paulatinamente la tapa de la bandeja y luego se removió completamente. Las plantas se regaron dos veces por semana con 5 ml de solución nutritiva MS y agua destilada. Los cortes vegetativos, se pasaron a otra cámara climatizada (60% HR, 22 ºC, fotoperiodo de 16 horas luz [3000 lux]) hasta que alcanzaron un tamaño de 12 cm y de dos a tres hojas desplegadas (3-4 semanas). Estas plantas se encontraron en condiciones para ser trasplantadas a sustrato (tierra) y llevadas a un invernadero con un 90% de sobrevivencia. Con este marco de referencia, se inició el experimento para establecer un protocolo de micropropagación de vid variedad Globo Rojo para la región de Ciudad Juárez, Chihuahua. 17 II. Pl a n t e a m i e n t o

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20 III. Me t o d o l o g í a El trabajo de investigación fue realizado en el Laboratorio de Cultivo In Vitro de Tejidos Vegetales de la UACJ. Las instalaciones de la UACJ cuentan con un invernadero de 10 x 20 m, con temperatura y humedad controlada, condiciones ideales para este estudio. Material vegetal Fueron donados sarmientos (segmentos de tallos) de uva de mesa variedad Globo Rojo, por el doctor Estéfano de la Universidad Autónoma de Baja California, y colectados de viñedos del estado de California, EU. Las fuentes de explantes para realizar este estudio, fueron plantas de seis meses de edad crecidas bajo condición de invernadero en macetas de plástico (12 x 20 cm), conteniendo una mezcla de peat moss con arena, con una proporción de 1:1. Asimismo, fueron realizados riegos periódicos con agua corriente durante tres veces por semana. Las plantas fueron fertilizadas dos veces con urea (3 g/planta). Establecimiento aséptico del explante Fueron seleccionados esquejes de 1.5 cm de longitud en yemas axilares y ápices de 1 cm de longitud con el domo apical. Ambos explantes fueron disectados de plantas crecidas bajo condiciones de invernadero. Las hojas fueron eliminadas de los esquejes para yemas axilares. Los explantes fueron tratados con una solución de cloro comercial al 50% durante 5, 7 y 9 minutos, y se enjuagaron dos veces con agua destilada, para eliminar residuos 19

21 20 de cloro. Las yemas axilares y ápices, se colocaron en frascos (2.5 x 18 cm) con el medio de cultivo de Murashige y Skoog (1962) al 100%. Dos explantes fueron cultivados por frasco, que representa la unidad experimental. Cuatro repeticiones fueron usadas por tratamiento y el porcentaje de contaminación, fue evaluado. Multiplicación de brotes Una vez realizado el tratamiento aséptico, las yemas axilares de 1.5 cm de longitud y ápices de 1 cm de longitud, fueron colocados en frascos (2.5 x 18 cm) con el medio de cultivo de Murashige y Skoog (1962), el cual fue suplementado con 3, 4, 5, 6 y 7 µm/l de BAP, con cuatro repeticiones por tratamiento. El número de nudos y hojas, fueron contados, y la longitud de la planta, fue medida en centímetros. Los datos fueron analizados mediante un análisis de varianza (ANOVA), y se usó Tukey para determinar la comparación de medias. Enraizamiento de los brotes Para la etapa de enraizamiento, fueron seleccionados brotes de 10 cm de longitud, los cuales fueron disectados 2 mm debajo de su nudo basal y trasplantados verticalmente dentro del medio hasta aquél. Un brote fue plantado por frasco (5 x 18 cm) con el medio de cultivo de Murashige y Skoog (1962), y suplementado con 0.2, 0.4 y 0.6 mg/ml de ácido indolacético (AIA). Fueron utilizadas dos repeticiones por tratamiento. El número de raíz y la longitud de la planta, fueron medidos en centímetros. Los datos fueron analizados mediante un análisis de varianza (ANOVA), y se usó Tukey para determinar la comparación de medias. Etapa de aclimatación Fueron trasladadas plantas enraizadas hacia el invernadero, donde se destaparon los frascos y se removió el agar de las raíces con agua corriente. Las plántulas fueron transferidas a vasos de poliestireno (12 oz), conteniendo un sustrato húmedo de peat moss. Las plántulas trasplantadas, se cubrieron con frascos de vidrio transparente y a los siete días, se removió el frasco para su aclimatación al nuevo medio ambiente del invernadero. La aclimatación, se evaluó en el porcentaje de supervivencia y el desarrollo de las plantas. Propagación in vitro de vid variedad Globo Rojo

22 IV. Re s u l t a d o s Asepsia del explante La asepsia de los explantes y las condiciones de esterilidad, donde se desarrolla el proceso de establecimiento del material vegetal in vitro, es de vital importancia para el éxito de la técnica de cultivo de tejidos vegetales en vid. Para mantener los explantes libres de contaminantes, se sometieron las yemas axilares y ápices de vid a 50% de cloro comercial, a tiempos de 5, 7 y 9 minutos. Estos tres tratamientos mantuvieron a los explantes libres de contaminantes, que previnieron el crecimiento de hongos y bacterias, que destruirían los tejidos vegetales. Al evaluar el porcentaje de contaminación en los explantes, se observó que el tratamiento con tiempo de exposición de 5 minutos, fue superior a los demás. Esto indica que los explantes, tanto el ápice como las yemas axilares, estuvieron en un 100% libres de contaminantes y que, a la vez, no sufrieron daños físicos por el desinfectante. Sin embargo, cuando los explantes fueron expuestos a mayor tiempo (7 minutos), presentaban daños por quemaduras, que necrosaban la parte basal del tejido. El peor tratamiento fue con tiempo de 9 minutos, donde sufrió una necrosis total conllevando a la muerte del explante. Toro (2003) utilizó fungicidas antes del tratamiento de cloro. En contraste, Ponce (2007) utilizó etanol, seguido del cloro al 15%, por 20 minutos. Selección del explante para la etapa de multiplicación de brotes Para definir el mejor explante en la etapa de la multiplicación de brotes, se evaluó el efecto de la citocinina de benzilaminopurina (BAP). Fueron cultivados explantes asépticos de ápices y yemas axilares en un medio de cultivo de Murashige y Skoog (1962), sumplementado con el RC BAP, a concentraciones de 3, 4, 5, 6 y 7 µm. 21

23 22 Las concentraciones del RC, tuvieron un efecto positivo en la formación de nuevas yemas en ambos explantes El análisis de varianza, detectó que hay diferencias significativas dentro de los tratamientos de la categoría de número de nuevas yemas inducidas, tanto en el explante de ápices como de yemas axilares. La comparación de medias de Tukey (α = 0.05), nos indica que los tratamientos de 3 y 4 µm de BAP fueron superiores y consistentes, al promover y para yemas axilares, y y para ápices de nuevas yemas, respectivamente. La inducción de yemas es potencial para la formación de brotes. La figura 1 muestra la imagen de la inducción de nuevas yemas, a partir del mejor tratamiento de 3 µm de BAP. Los nudos son muy visibles donde es inducido un nuevo brote, porque en condiciones naturales estas yemas son inactivadas por la dominancia apical. Las hojas desplegadas muestran la similitud con las formas verdaderas de una planta de uva crecida en el campo. En contraste, en las concentraciones a 5 µm, los brotes presentan una apariencia arrocetada, donde uno de los tallos se observa engrosado, lo cual se podría deber a un desorden hormonal. Es común que los explantes respondan a la aplicación de RC exógenos, con incremento de volumen de tallos y una reducción del tamaño de las hojas, debido a que se desconoce la concentración hormonal endógena, y una aplicación exógena de RC, trae como consecuencia anormalidades en la arquitectura de los brotes. Al observar el comportamiento en desarrollo, tanto del explante de ápices como de yemas axilares, se consideró al de yemas axilares como el explante para usarse en la etapa de la multiplicación de brotes, debido a que el explante de ápices es un meristemo, que, por su dominancia apical, indujo más elongación que inducir nuevos brotes laterales, tal como fue observado en el explante de yemas axilares. Por lo tanto, el explante de yemas axilares se evaluará en la multiplicación de brotes, donde se evaluarán diferentes variables. Evaluación del explante de yema axilar en multiplicación de brotes Con el objetivo de determinar la consistencia, confiabilidad y repetitividad del protocolo de micropropagación in vitro de la vid, se determinó usar el mejor explante del ensayo anterior, que fue el de yema axilar. Una vez determinado que el explante de yema axilar, será incluido en el establecimiento del protocolo de la multiplicación in vitro de la vid, se procedió a evaluar su respuesta a las mismas concentraciones de BAP (3, 4, 5 y 7 µm) con las siguientes variables: número de hojas, número de nudos y altura de la planta. Respecto a la variable de número de hojas, el análisis de varianza indicó diferencias altamente significativas entre los tratamientos (tabla 1). La comparación de medias de Tukey (α = 0.05), mostró que las concentraciones de 3 y 4 µm de BAP fueron Propagación in vitro de vid variedad Globo Rojo

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