V Seminario de Citogenética- Cádiz Análisis citológico y molecular de los cromosomas X y B microdiseccionados en dos especies de saltamontes
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- Catalina Navarrete Araya
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1 V Seminario de Citogenética- Cádiz 2008 Anális citológico y molecular de los cromosomas y microdiseccionados en dos especies de saltamontes Teruel M (1), Cabrero J (1), Acosta MJ (2), Sánchez A (2) (1) Departamento de Genética, Univerdad de Granada, Granada (2) Departamento de iología Experimental, Univerdad de Jaén
2 Introducción Cromosomas Eyprepocnemis plorans 24 ADN satélite ADNr Cabrero et al Locusta migratoria DAPI negativa DAPI potiva DAPI negativa Camacho et al, 1991
3 Objetivo Profundizar en la naturaleza molecular y el origen de los cromosomas de las especies Eyprepocnemis plorans y Locusta migratoria E. plorans: Cromosomas Cromosomas (López-León et al., 1994) 1. Microdisección de los cromosomas y 2. Probar la presencia de varias secuencias de ADN en los microdiseccionados, mediante PCR
4 Material y Métodos Material 2 especies de saltamontes de la familia Acrididae (Orthoptera) portadores de cromosomas - Eyprepocnemis plorans Torrox (Málaga): 24 - Locusta migratoria Las Gabias (Granada): Tejido: Folículos testiculares fijados en etanol: acético (3:1) y guardados a -20ºC en etanol al 70%
5 Método Microdiseccion Manual Microscopio invertido, Zeiss Axiovert 200, acoplado a un micromanipulador electrónico, Eppendorf TransferMan NK 2 Células en meios: diplotene y/o paquitene 24 2 E. plorans L. migratoria
6 Método Microdiseccion Manual Amplificación del ADN cromosómico microdisecciondo GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit (wga4-sigma) Reamplificación del ADN cromosómico microdisecciondo GenomePlex WGA Reamplification Kit (wga3-sigma) Generar Sonda Nick translation Amplificación por PCR de varias secuencias Chromosome Painting Localización Anális de por FISH la secuencias
7 GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit (wga4-sigma) Ventajas - Poca cantidad de ADN inicial - Mayor representación del genoma Inconvenientes -Fragmentación del ADN - Ligación de adaptadores -Tamaño medio de los fragmentos amplificados es de 400pb Gribble et al.,
8 Método Microdiseccion Manual Amplificación del ADN cromosómico microdisecciondo GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit (wga4-sigma) Reamplificación del ADN cromosómico microdisecciondo GenomePlex WGA Reamplification Kit (wga3-sigma) Generar Sonda Nick translation Amplificación por PCR de varias secuencias Chromosome Painting Localización Anális de por FISH la secuencias
9 Amplificación de Secuencias por PCR Secuencias Cebadores Secuencia Oligonucleótidos Tm Tamaño ADNr (ITS-1 e ITS-2) 18S its4 GCT TTT GTA CAC ACC GCC CGT CGC ATA TGC TTA AAT TCA GCG GG 56ºC pb ADN 5S 5S-nRNA.F1 AAC GAC CAT ACC ACG CTG AA 52ºC 90pb 5S-nRNA.R1 AAG CGG TCC CCC ATC TAA GT Histona H3 H3aF ATG GCT CGT ACC AAG CAG ACV GC 48ºC 400pb (Juan J. Pasantes) H3aR ATA TCC TTR GGC ATR ATR GTG AC Histona H4 H4F2s TSC GIG AYA ACA TYC AGG GIA TCA C - - (Pineau et al. 2005) H4F2er CKY TTI AGI GCR TAI ACC ACR TCC AT 210 pb H4F2ir GTI ACI GTC TTS CKY TTG GCG TGC TC 180pb
10 Resultados GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit (wga4-sigma)
11 Chromosome Painting Eyprepocnemis plorans Microdisección de 24 Hibrida con los bloques de heterocromatina de los cromosomas y A
12 Chromosome Painting Eyprepocnemis plorans Microdisección de 24 Hibrida en todo el cromosoma 1 También hibrida con el cromosoma que aparece en la poblaciones de Turquía 1
13 Chromosome Painting Eyprepocnemis plorans Microdisección del 1ª microdisección: región heterocromática de los cromosomas A y No hibrida con el todo cromosoma, solamente con la región paracentromérica
14 Chromosome Painting Eyprepocnemis plorans Cromosoma 2ª microdisección: igual resultado, que en el caso anterior. Pinta el brazo corto del
15 Amplificación de secuencias Eyprepocnemis plorans Ribosómico ITS-1 ITS-2 18S 5,8S 28S
16 E. plorans ADN Ribosómico amplificado a partir del microdiseccionado Señal de FISH (NORs primarias) ADNr μ región paracentromérica S región distal S9, S10, S11 banda paracentromérica S 9 S 9 S 11 S 11 S
17 Amplificación de secuencias Eyprepocnemis plorans ADN 5S
18 E. plorans ADN 5S Señal de FISH n señal 24 n señal L1, L2, L3 n señal M4, M5 banda intersticial M7 n señal M6, M8, S9, S10, S11 banda proximal 24
19 Amplificación de secuencias Eyprepocnemis plorans Genes de las histonas: H3 y H4 Cluster de los genes de las histonas en Drosophila melanogaster: h2b h2a h4 h3 h1 Los genes de las histonas H3 y H4 son las más conservadas
20 E. plorans Histonas Colocalización de H3 y H4 Señal de FISH: n señal 24 n señal L2 región distal H3 H L2
21 Amplificación de secuencias Resultados Eyprepocnemis plorans Genes ADNr PCR gdna 956 FISH As S9, S10, S11 (a) Homología ADNr Chorthippus parallellus ADN 5S H3 H4 er no M4, M5, M6, S9, S10, S11 L2 no no no no no no ADN 5S Mytilus edulis H3 Locusta migratoria μ H3 Graphocephala atropunctata H4 Mus musculus H4 ir 180 L2 no no a NORs primarias
22 Chromosome Painting Locusta migratoria Microdiseccionado del Pinta los cromosomas y la región paracentromérica del y de algunos As
23 Chromosome Painting Locusta migratoria Microdiseccionado del Pinta la región paracentromérica del y los cromosomas
24 Amplificación de secuencias Locusta migratoria ADNr ADNr 5S
25 L. migratoria ADNr amplificado a partir de microdiseccionado Señal de FISH: n señal L2, M6 región distal n señal S9 región paracentromérica L 2 M 6 M 6 S 9 S 9 L 2
26 L. migratoria ADN 5S Señal de FISH: n señal M4 región intersticial S9, S11 región proximal n señal M8 región proximal
27 Amplificación de secuencias Locusta migratoria Genes de las histonas: H3 y H4
28 L. migratoria Histonas: H3 M8
29 L. migratoria Histonas: H3 y H4 Colocalización de la H3 y H4 Señal de FISH: n señal con señal M8 señal proximal H3 H4
30 Amplificación de secuencias Resultados Locusta migratoria Genes ADNr PCR gdna 956 FISH As L2, M6, S9 (a) no no Homología ADNr Chorthippus parallellus ADN 5S 90 no no aun no secuenciado H3 H4 er no M8 no H3 Locusta migratoria μ H3 Graphocephala atropunctata H4 Mus musculus H4 ir 180 M8 no H4 Mus musculus a NORs primarias
31 Concluones Eyprepocnemis plorans Chromosome painting - El cromosoma y el 24 comparten secuencias de ADN entre ellos y con la mayoría de los autosomas (ADNsat y ADNr) Amplificación de secuencias: - En el cromosoma y 24 están presentes los genes ADNr 45S, y también el gen 5S y los genes para las histonas aunque estos dos tipos génicos no se observan por FISH. Por tanto no podemos descartar la hipótes inicial del origen intraespecifíco del a partir del. Esperamos que el anális comparativo de las secuencias amplificadas a partir de los microdisecionados y proporcionen información mas deciva para esclarecer el origen del.
32 Concluones Locusta migratoria Chromosome painting: - y comparten secuencias repetidas que también están presentes en muchos de los autosomas. Amplificación de secuencias: - Los cromosoma y parecen contener secuencias de los genes ADNr 45S y 5S, así como genes para las histonas H3 y H4, aunque en este caso las H3 y H4 se observan por FISH en el cromosoma pero no en el. - La presencia mayoritaria de H3 y H4 en los cromosomas 8 y postula a este autosoma como poble origen del.
33 Grupo de Genética Evolutiva. UGR Gracias por su atención
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