Interferon-gamma ELISA

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1 Instrucciones de Uso Interferon-gamma ELISA Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de Interferon-gamma humano (IFN-gamma) en suero y plasma humanos y sobrenadante de cultivo celular. BE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 INFORMACIÓN Y MANUAL DEL PRODUCTO 1. USO PROPUESTO 2 2. RESUMEN 2 3. PRINCIPIO DEL ENSAYO 3 4. REACTIVOS SUMINISTRADOS 4 5. INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO 4 6. TOMA DE LAS MUESTRAS Y INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO 4 7. MATERIAL REQUIRIDO PERO NO SUMINISTRADO 5 8. PRECAUCIONES DE USO 5 9. PREPARACIÓN DE REACTIVOS PROTOCOLO DE ENSAYO CALCULO DE RESULTADOS LÍMITES PRUEBAS FUNCIONALES INFORMACIÓN DE PEDIDOS RESUMEN PREPARACIÓN DE REACTIVOS RESUMEN DEL PROTOCOLO REFERENCIAS SOBRE EL PRODUCTO (24) 1 / 18

3 1. USO PROPUESTO El IFN-gamma humano ELISA es un inmunoensayo enzimático para la detección cuantitativa del IFNgamma humano. El IFN-gamma humano ELISA es para el diagnóstico in vitro. No debe utilizarse en los procedimientos terapéuticos. 2. RESUMEN IFN gamma, también llamado interferón de tipo II, es una glicoproteína homodimérica que contiene subunidades de entre 21 y 24 kd. El gen de IFN gamma humano, situado en el cromosoma 12, contiene el código tres intrones y cuatro exones para un polipéptido de 166 aminoácidos, 20 de los cuales constituyen el péptido de señalización. En contraste con la síntesis de IFN alfa e IFN beta, que puede producirse en cualquier célula, la producción de IFN gamma es una función de los linfocitos T y de los linfocitos citolíticos naturales. Todos los inductores de IFN gamma activan los linfocitos T, ya sea en forma policlonal (mitógenos o anticuerpos) o en forma específica del antígeno, con restricción clonal. IFN gamma se produce durante la infección por linfocitos T citotóxicos/supresores (CD8) y por un subtipo de linfocitos T cooperadores, los linfocitos Th1. Los linfocitos Th1 secretan IL-2, IL-3, TNF beta e IFN gamma, mientras que los linfocitos Th2 producen, principalmente, IL-3, IL-4, IL-5 e IL-10, pero escaso o nulo IFN gamma. Preferentemente, IFN gamma inhibe la proliferación de linfocitos Th2, pero no de linfocitos Th1, lo que indica que la presencia de IFN gamma durante una respuesta inmunitaria tendrá como resultado la proliferación preferencial de linfocitos Th1. IFN de tipo II o IFN gamma es una linfocina que no muestra homología molecular con IFN de tipo I, pero que comparte algunas actividades biológicas importantes. Específicamente, IFN gamma induce un estado antivírico y es antiproliferativo. Además, IFN gamma tiene varias propiedades relacionadas con la inmunorregulación. (1) IFN gamma es un potente activador de los fagocitos mononucleares, por ejemplo, IFN gamma estimula la expresión de Mac-1, aumenta la endocitosis y la fagocitosis por monocitos y activa los macrófagos para eliminar las células tumorales al emitir intermediarios de oxígeno reactivo y TNF alfa. (2) IFN gamma induce o aumenta la expresión de antígenos MHC sobre los macrófagos, los linfocitos T y B, y algunas líneas celulares tumorales. (3) En los linfocitos T y B, IFN gamma promueve la diferenciación. Mejora la proliferación de los linfocitos B activados y puede actuar en forma sinérgica con IL-2 para aumentar la síntesis de cadenas ligeras de inmunoglobulina. IFN gamma es uno de los factores naturales de diferenciación de linfocitos B. (4) Finalmente, IFN gamma activa los neutrófilos, los linfocitos citolíticos naturales y las células endoteliales vasculares. El rol de IFN gramma como un marcador de enfermedades ha quedado demostrado en distintas situaciones patológicas: - Infecciones: IFN gamma se produce durante las infecciones virales. IFN gamma es una herramienta de diagnóstico para distinguir la ascitis tuberculosa de otra no tuberculosa. Los valores de IFN gamma en el líquido pleural son significativamente más altos en pacientes con pleuritis tuberculosa que en aquellos con pleuritis no tuberculosa, con una sensibilidad y una especificidad del 100 %. El alivio de los síntomas clínicos inducidos por el tratamiento (con talidomida) de eritema nudoso leproso se corresponde con los niveles de IFN gamma y de TNF alfa. Los pacientes con lepra tuberculosa muestran una mayor proliferación de linfocitos y una mayor producción de IFN gamma en respuesta a una estimulación con la microbacteria de la lepra, en comparación con los pacientes con lepra lepromatosa y las personas sanas. - Enfermedades autoinmunitarias: las mediciones precisas de la producción celular de citocinas, por ejemplo, IFN gamma es importante en el diseño y la supervisión de la inmunoterapia de la esclerosis múltiple (24) 2 / 18

4 - Rechazo de trasplantes: la expresión de ARNm de IFN gamma en el injerto se produce en el rechazo agudo activo de un trasplante que precede al rechazo clínico del trasplante, lo que brinda una herramienta de diagnóstico temprano para la detección del rechazo del trasplante. - Alergia: la producción de IFN gamma mediante linfocitos aislados no puede detectarse en pacientes con alergia a la leche de vaca, en comparación con las personas del grupo de referencia. Los recién nacidos que desarrollan atopía producen una cantidad significativamente menor de IFN gamma al momento del nacimiento, en comparación con los niños que no desarrollan atopía. - Diabetes: las células linfomononucleares de la sangre periférica de la diabetes de tipo I recién diagnosticada producen una cantidad significativamente menor de IFN gamma, en comparación con los individuos del grupo de referencia y los pacientes con diabetes de larga evolución. 3. PRINCIPIO DEL ENSAYO Los pocillos de la microplaca son recubiertos con anticuerpos anti-ifn-gamma humano. Figura 1 Micropocillos Recubiertos El IFN-gamma humano presente en la muestra o el estándar se une a los anticuerpos adsorbidos en los micropocillos. Se agrega un anticuerpo anti-ifn-gamma humano conjugado a biotina que se une al IFN-gamma humano capturado por los primeros anticuerpos. Figura 2 Anticuerpo para el Recubrimiento Primera Incubación Después de la incubación se elimina los anticuerpos anti-ifngamma humano conjugados a biotina no unidos mediante una etapa de lavado. Se agrega Estreptavidina-HRP y este se une a los anticuerpos conjugados a biotina anti-ifn-gamma humano. Figura 3 Estándar o Muestra Conjugado de Biotina Segunda Incubación Después de la incubación se elimina la estreptavidina-hrp no unida mediante una etapa de lavado y se agrega una solución de Substrato reactiva a Enzima Peroxidasa a los pocillos. Figura 4 Estreptavidina-HRP - Tercera Incubación Substrato (24) 3 / 18

5 Se forma un producto de color proporcional a la cantidad del IFNgamma humano presente en la muestra o el estándar. La reacción es terminada por la adición de ácido y la absorbancia se mide a 450 nm. Se prepara una curva estándar a partir de 7 diluciones estándar de IFN-gamma humano y se determina la concentración de IFN-gamma humano en la muestra. Figura 5 Substrato Reaccionado 4. Reactivos Suministrados 1 bolsa de aluminio con una Placa de Micropocillos recubiertos con anticuerpos monoclonales IFN-gamma anti-humanos. 1 vial (70 μl) de Conjuguado de Biotina anticuerpo monoclonal anti-ifn-gamma humano 1 vial (150 µl) con Estreptavidina-HRP 2 viales de Estándar IFN-gamma humano liofilizado, 200 ng/ml después de la reconstitución 1 vial (12 ml) Diluyente de Muestras Tenga en cuenta lo siguiente: En algunos casos muy poco frecuentes, se ha observado un precipitado insoluble de proteína estabilizante en la ampolla con diluyente de muestra. Este precipitado no interfiere de ninguna manera con el desarrollo de la prueba y, por lo tanto, puede ignorarse. 1 vial (5 ml) de Solución Buffer de Ensayo Concentrado 20x (PBS con 1 % de Tween 20, BSA al 10 %) 1 frasco (50 ml) de Solución Buffer de Lavado Concentrado 20x (PBS con 1 % de Tween 20) 1 vial (15 ml) de Solución de Substrato (tetrametil-benzidina) 1 vial (15 ml) de Solución de Parada (1M Acido Fosfórico) 4 Tapas para placas, Adhesivas 5. Instrucciones de Almacenamiento Conservar los reactivos del juego de reactivos a una temperatura comprendida entre 2 C y 8 C. Inmediatamente después de utilizarlos deberá volver a conservar los reactivos a dicha temperatura (2 C y 8 C). En las etiquetas figuran las fechas de caducidad del juego de reactivos y de los reactivos. Sólo se podrá garantizar la fecha de caducidad de los componentes del juego de reactivos si se le conservan adecuadamente y si, en caso de uso reiterado de un mismo componente, el reactivo no queda contaminado en la primera manipulación. 6. Toma de las Muestras y Instrucciones de Almacenamiento Sobrenadante de cultivo celular, suero y plasma (EDTA, citrato, heparina) han sido examinado con este ensayo. Otras muestras biológicas pueden ser adecuados para su uso en el ensayo. Eliminar el suero o plasma del coágulo o de las células tan pronto como sea posible después de la coagulación y separación. Las muestras que contienen un precipitado visible deben aclararse antes de su uso en el ensayo. No utilizar muestras altamente hemolizadas o lipémicas. Las muestras deben ser alícuotadas y se debe congelar a -20 C para evitar la pérdida de IFN-gamma humano bioactivo. Si se van a usar las muestras dentro de las 24 horas, se pueden almacenar ente 2 C y 8 C (para la estabilidad de la muestra consulte el cápitulo 13.5). Evite ciclos repetidos de congelación-descongelación. Antes del ensayo, la muestra congelada debe alcanzar lentamente la temperatura ambiente y ser mezclada suavemente (24) 4 / 18

6 7. Material Requirido Pero No Suministrado - Pipetas graduadas de 5 ml y 10 ml - Micropipetas ajustables de un solo canal de 5 μl a 1000 μl con puntas desechables - Micropipetas multicanales ajustables de 50 μl a 300 μl con puntas desechables - Depósito para micropipetas multicanales - Vasos de precipitados, matraz, probeta, necesarios para la preparación de reactivos - Frasco lavador, sistema automatizado o semi-automatizado de lavado de placas de microtitulación - Fotómetro para placas de microtitulación capaz de leer absorbancias a 450 nm (opcional: 620 nm longitud de onda de referencia) - Agua bidestilada o deionizada en un recipiente de vidrio - Programa estadístico informático para llevar a cabo un análisis de regresión 8. Precauciones de Uso - Todos los productos químicos deben considerarse potencialmente peligrosos. Por tanto, recomendamos que este producto sea manipulado únicamente por aquellas personas que hayan sido entrenadas en técnicas de laboratorio y que sea usado de acuerdo con los principios de buenas prácticas de laboratorio. - Se debe llevar ropa de protección apropiada como puedan ser las batas de laboratorio, gafas de seguridad y guantes. Se debe trabajar con cuidado para evitar cualquier contacto con piel y ojos. En el caso de que tenga lugar un contacto con piel u ojos, proceder de forma inmediata a lavar la parte afectada con abundante agua. Véase la(s) hoja(s) de seguridad y/o declaraciones de seguridad para recomendaciones específicas. - Los reactivos están destinados para un uso en diagnóstico in vitro y no se deben usar en procedimientos terapéuticos. - No mezclar o sustituir los reactivos por los equivalentes de otros lotes u otras fuentes. - No usar reactivos caducados. - No exponer los reactivos del kit a una luz intensa durante su almacenamiento o incubación. - No pipetear con la boca. - No se recomienda comer o fumar en las zonas donde se manipulen muestras o reactivos. - Evitar el contacto de los reactivos del kit o de las muestras con piel o mucosas. - Se recomienda el uso de guantes desechables de goma o látex durante la manipulación de las muestras y reactivos. - Evitar el contacto de la solución de substrato con agentes oxidantes y metales. - Evitar salpicaduras y la generación de aerosoles. - Con el propósito de evitar una contaminación microbiológica o contaminaciones cruzadas de reactivos y muestras que puedan invalidar el test se recomienda el uso de pipetas y/o puntas de pipetas de un solo uso. - Usar recipientes limpios y específicos de reactivos para la dispensación de reactivos de sustrato. - La exposición a los ácidos inactiva el conjugado. - Se debe usar agua destilada o desionizada en la preparación de los reactivos. - La solución de substrato debe de estar a temperatura ambiente antes de su uso. - Descontaminar y disponer las muestras y todos los materiales potencialmente contaminados como si pudieran contener agentes infecciosos. El método preferente de descontaminación es un autoclavado durante un mínimo de 1 hora a C. - Los residuos líquidos que no contengan ácido y los residuos neutralizados pueden ser mezclados con hipoclorito sódico en volúmenes tales que la mezcla final contenga 1.0 % de hipoclorito sódico. Dejar actuar durante 30 minutos para una efectiva descontaminación. Los residuos líquidos que contengan ácido deben ser neutralizados previamente a la adición de hipoclorito sódico (24) 5 / 18

7 9. Preparación de los Reactivos La Solución de Buffer Concentrada debe de alcanzar la temperatura ambiente y ser diluidas antes de iniciar el procedimiento del test. Si en el concentrado de la Solución de Buffer se han formado cristales, caliente suavemente hasta su completa disolución Solución Buffer de Lavado (1x) Vierta todo el contenido (50 ml) de la Solución Buffer de Lavado Concentrada (20x) en un matraz aforado de 1000 ml limpio. Enrase en matraz con agua destilada o desionizada. Mezcle suavemente para evitar la formación de espuma. Transfiera la solución a un frasco de lavado limpio y consérvela a una temperatura entre 2 C y 25 C. La Solución Buffer de Lavado permanece estable durante 30 días. En función de la cantidad que vaya a necesitar, prepare la Solución Buffer de Lavado de acuerdo a la siguiente tabla: Número de Tiras Solución Buffer de Lavado Concentrada (20x) (ml) Agua Destilada (ml) Solución Buffer de Ensayo (1x) Vierta todo el contenido (5 ml) de la Solución Buffer de Ensayo Concentrado (20x) en un matraz aforado de 100 ml limpio. Enrase en matraz con agua destilada o desionizada. Mezcle suavemente para evitar la formación de espuma. Conservar a 2-8 C. La Solución Buffer de Ensayo (1x) permanece estable durante 30 días. En función de la cantidad que vaya a necesitar, prepare la Solución Buffer de Ensayo (1x) de acuerdo a la siguiente tabla: Número de Tiras Solución Buffer de Ensayo Concentrada (20x) (ml) Agua Destilada (ml) Conjugado de Biotina Utilice el Conjugado de Biotiona antes de transcurridos 30 minutos desde su dilución. Justo antes de utilizar el Conjugado de Biotina, se debe diluir en una proporción de 1:100 con Solución Buffer de Ensayo (1x) en un tubo de ensayo de plástico limpio. Número de Tiras Conjugado de Biotina (ml) Solución Buffer de Ensayo (1x) (ml) Estreptavidina-HRP Utilice la Estreptavidina-HRP antes de transcurridos 30 minutos desde su dilución. Se debe diluir la Estreptavidina-HRP concentrada en una proporción de 1:100.con Solución Buffer de Ensayo (1x) en un tubo de ensayo de plástico limpio. Número de Tiras Estreptavidina-HRP (ml) Solución Buffer de Ensayo (1x) (ml) (24) 6 / 18

8 9.5. Estándar IFN-γ Humano Reconstituir el Estándar IFN-gamma humano añadiendo agua destilada. El volumen de reconstitución está indicado en la etiqueta del vial del estándar. Girar o mezclar cuidadosamente para garantizar una solubilización completa y homogénea (concentración del estándar reconstituido = 200 ng/ml). Permitir que el estándar reconstituido se asiente durante minutos. Mezclar bien previamente a realizar las diluciones. Tras su uso los restos del estándar no pueden ser almacenados y deben ser descartados. El estándar IFN-gamma humano concentrado debe diluirse 1:1000 con Solución Buffer de Ensayo (1x) antes de su uso en un tubo de ensayo plástico limpio, de acuerdo con el siguiente esquema de dilución: Dilución 1: 100 μl del estándar IFN-gamma humano concentrado μl de Solución Buffer de Ensayo (1x) (concentración de la dilución 1 = 20 ng/ml). Dilución 2: 10 μl de dilución μl de Solución Buffer de Ensayo (1x) (concentración de dilución 2 = 200 pg/ml). Agitar suavemente para mezclar. Las diluciones estándares pueden ser preparadas directamente en la placa multipocillo (véase 10.c) o alternativamente en tubos (véase 9.5.1) Dilución Estándar Externa Rotular 7 tubos, uno para cada curva estándar. S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7. Acto seguido, preparar diluciones seriadas 1:2 para la curva estándar como se indica a continuación: Pipetear 225 µl de Diluyente de Muestras a todos los tubos. Pipetear 225 µl de estándar reconstituido (concentración del estándar = 200 pg/ml) en el primer tubo, etiquetado como S1, y mezclar (concentración del estándar 1 = 100 pg/ml). Pipetear 225 µl de esta dilución en el segundo tubo, etiquetado como S2, y mezclar completamente antes de la siguiente transferencia. Repetir la serie de diluciones 5 veces más de manera que se obtengan los diferentes puntos de la curva estándar (véase figura 6). El Diluyente de Muestras sirve como blanco. Figura 6 Transferir 225 µl S1 S2 S3 S4 - S7 Estándar IFN-gamma humano 1:1000 diluido Diluyente de Muestras 225 µl Descartar 225 µl (24) 7 / 18

9 10. Protocolo de Ensayo a. Determine el número de tiras necesarias para analizar el número deseado de muestras y además añada las tiras para blancos y estándares (de color). Cada muestra, estándar, blanco y la muestra de control opcional deben ser analizadas por duplicado. Retire del soporte las tiras sobrantes y consérvelas, junto con el desecante suministrado en una bolsa metalizada y cerrada herméticamente, a una temperatura de 2-8 C. b. Lave las tiras 2 veces con aproximadamente 400 µl de Solución Buffer de Lavado por cada pocillo, aspirando completamente el contenido de los pocillos entre cada lavado. Permitir que la Solución Buffer de Lavado permanezca en los pocillos durante segundos antes de su aspiración. Evite rayar la superficie de los pocillos. Tras el último lavado, golpee suavemente las tiras contra un papel absorbente o una toallita de papel para eliminar el exceso de tampón de lavado. Utilice las tiras inmediatamente después de lavadas o bien colóquelas boca abajo sobre un papel absorbente húmedo durante como máximo 15 minutos. No deje secar los pocillos. c. Dilución Estándar en la placa de microtitración (Alternativamente, la dilución estándar puede ser preparada en tubos véase 9.5.1) Añadir 100 µl de Diluyente de Muestras en duplicado a todos los pocillos estándar. Pipetear 100 µl de estándar preparado (véase Preparación del Estándar 9.5, concentración = pg/ml) por duplicado en los pocillos A1 y A2 (véase Tabla 1). Mezclar el contenido de los pocillos A1 y A2 por repetidas aspiraciones y expulsiones del contenido con la pipeta (concentración del estándar 1, S1 = pg/ml), y transferir 100 μl a los pocillos B1 y B2, respectivamente. (véase Figura 7). Cuidar de no rascar la superficie interior de los micropocillos con la punta de la pipeta. Continuar este procedimiento 5 veces, formando dos filas de diluciones estándar del IFN-γ humano ordenadas desde 100 a 1.6 pg/ml. Descartar 100 µl de los contenidos de los últimos micropocillos (G1, G2) usados. Figura 7 Transferir 100 µl S1 S2 S3 S4 - S7 Estándar IFN-gamma Humano 1:1000 diluido Diluyente de Muestras 100 µl Descartar 100 µl (24) 8 / 18

10 En caso de una dilución estándar externa (véase 9.5.1), pipetear 100 µl de estas diluciones estándares (S1-S7) en los pocillos estándares correspondientes de acuerdo con la Tabla 1. Tabla 1 Tabla describiendo un ejemplo de la disposición de los blancos, estándares y muestras en las tiras de los micropocillos A B C D E F G Estándar 1 (100.0 pg/ml) Estándar 2 (50.0 pg/ml) Estándar 3 (25.0 pg/ml) Estándar 4 (12.5 pg/ml) Estándar 5 (6.3 pg/ml) Estándar 6 (3.1 pg/ml) Estándar 7 (1.6 pg/ml) Estándar 1 (100.0 pg/ml) Estándar 2 (50.0 pg/ml) Estándar 3 (25.0 pg/ml) Estándar 4 (12.5 pg/ml) Estándar 5 (6.3 pg/ml) Estándar 6 (3.1 pg/ml) Estándar 7 (1.6 pg/ml) Muestra 1 Muestra 1 Muestra 2 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 4 Muestra 5 Muestra 5 Muestra 6 Muestra 6 Muestra 7 Muestra 7 H Blanco Blanco Muestra 8 Muestra 8 d. Añadir 100 µl de Diluyente de Muestras en duplicado a los pocillos del blanco. e. Añadir 50 µl de Diluyente de Muestras a los pocillos con la muestra. f. Añadir 50 µl de cada muestra en duplicado a los pocillos designados. g. Prepare el Biotin-Conjugate (véase la preparación del Conjugado de Biotina 9.3) h. Añada 50 µl el Conjugado de Biotina a todos los pocillos. i. Cubra la placa con una tapa e incúbela a temperatura ambiente (18-25 C) durante 2 horas en un agitador mecánico a 400 rpm, si es posible. j. Prepare Estreptavidina-HRP (véase la preparación de estreptavidina-hrp 9.4). k. Retire la tapa y vacíe los pocillos. Lavar los micropocillos de las tiras 3 veces de acuerdo al punto b del protocolo del test. Proseguir inmediatamente después al próximo paso. l. Añadir 100 μl de Estreptavidina-HRP diluida a todos los pocillos, incluidos los del blanco. m. Cubra la placa con una tapa e incúbela a temperatura ambiente (18-25 C) durante 1 hora (en un agitador mecánico a 400 rpm, si es posible) n. Retire la tapa y vacíe los pocillos. Lavar los micropocillos de las tiras 3 veces de acuerdo al punto b del protocolo del test. Proseguir inmediatamente después al próximo paso. o. Pipetee 100 μl de Solución de Substrato TMB y viértalos en todos los pocillos (24) 9 / 18

11 p. Incube las tiras de microtitración a temperatura ambiente (18-25 C) durante aproximadamente 10 minutos. Evite la exposición directa a la luz intensa. Deben monitorizarse los valores DO de la placa para detener la reacción del substrato (véase el siguiente punto de este protocolo) antes de que deje de ser posible registrar correctamente los pocillos positivos. La determinación del tiempo adecuado para el desarrollo del color, debe realizarse de forma individual para cada ensayo. Se recomienda añadir la solución de parada cuando el estándar más alto presente un color azul oscuro. Alternativamente el desarrollo de color puede ser monitorizado con un lector de placas de ELISA a 620 nm. La reacción del substrato debería ser parada cuando el Estándar 1 alcance una DO entre 0.9 y q. Detenga la reacción enzimática pipeteando rápidamente 100 µl de la Solución de Parada en cada pocillo, incluidos los del blanco. Es importante dispensar la Solución de Parada de forma rápida y uniforme en todos los pocillos para inactivar totalmente la enzima. Los resultados deben leerse inmediatamente después de añadir la solución de parada o, como máximo, en el plazo de 1 hora si las tiras se conservan a una temperatura entre 2-8 C en un lugar oscuro. r. Lea la absorbancia de cada pocillo en un espectrofotómetro utilizando 450 nm como longitud de onda principal (opcionalmente 620 nm como longitud de onda de referencia; los valores comprendidos entre 610 nm y 650 nm son aceptables). Utilizar los pocillos de blanco para medir el blanco del lector de placas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Determine la absorbancia de las muestras y de los estándares. Note: En caso de incubar sin agitar, los valores de D.O. pueden ser inferiores a los indicados más abajo. De todas formas los resultados siguen siendo válidos. 11. CALCULO DE RESULTADOS - Calcular los valores de absorbancia media para cada conjunto de duplicados de los estándares y muestras. Los duplicados deben estar dentro del 20 por ciento del valor medio. - Construir una curva estándar mediante la representación de la absorbancia media obtenido para cada estándar frente a la concentración de IFN-gamma humano con el valor de absorbancia en el eje-y y la concentración en el eje-x. Se logra un buen ajuste con 5 Parameter Logistics. - Para determinar la concentración del IFN-gamma humano circulante para cada muestra, primero encontrar el valor de absorbancia media en la ordenada y extender una línea horizontal a la curva estándar. En el punto de intersección, extender una línea vertical al eje de abscisas y leer la concentración del IFN-gamma humano. - Si se han seguido las instrucciones de este protocolo, se han diluido 1:2 las muestras (50 µl de muestra + 50 μl Diluyente de Muestras), la concentración leída a partir de la curva estándar se debe multiplicar por el factor de dilución (2x). - Cálculo de las muestras con una concentración superior al estándar 1, puede dar lugar a concentraciones incorrectas, bajas en IFN-gamma humano. Estas muestras requieren más predilución externa según los valores esperados de IFN-gamma humano con el Diluyente de Muestras para cuantificar con precisión la concentración real de IFN-gamma humano. - Se recomienda que cada centro de pruebas establece una muestra de control con concentraciones conocidas de IFN-gamma humano y se ejecuta este control adicional con cada ensayo. Si los valores obtenidos no están dentro del intervalo esperado del control, los resultados del análisis pueden ser no válidos. - En la figura 8 se muestra una representativa curva estándar. Esta curva no se puede utilizar para obtener resultados de las pruebas. Cada laboratorio debe preparar una curva estándar por cada grupo de tiras ensayadas (24) 10 / 18

12 Figura 8 Representativa curva estándar para el IFN-gamma humano ELISA. Se diluyó el IFN-gamma humano en serie de 2 etapas en el Diluyente de Muestras. No use esta curva estándar para obtener resultados de las pruebas. Se debe ejecutar una curva estándar para cada grupo de tiras ensayadas. 10 IFN-γ ELISA OD (450 nm) Tabla 2 Datos típicos del IFN-γ Humano ELISA Longitud de onda: 450 nm Longitud de onda de referencia: 620 nm pg/ml Estándar Concentración de IFN-γ Humano (pg/ml) D.O. (450 nm) Blanco D.O. (450 nm) Media C.V. (%) Los valores de DO de la curva estándar pueden variar según las condiciones de la realización del ensayo (por ejemplo empleados del laboratorio, técnica de pipeteo, técnica de lavado o efectos de la temperatura). Por otra parte el almacenamiento del equipo puede afectar la actividad enzimática y por tanto la intensidad de color. Los valores medidos siguen siendo válidas (24) 11 / 18

13 12. LÍMITES - Dado que las condiciones exactas pueden variar de un ensayo a otro ensayo, se debe crear una curva estándar para cada prueba. - La contaminación de las muestras o los reactivos por bacterias o hongos, o una contaminación cruzada entre los reactivos puede dar resultados erróneos. - Se debe utilizar preferiblemente puntas de pipeta desechables, matraz de vidrio o frascos de vidrio. Los frascos de vidrio reutilizables deben ser lavados antes de su uso y todos los productos de limpieza ser eliminados por un enjuague minucioso. - Un lavado incorrecto o inadecuado durante cada paso del procedimiento de ensayo puede conducir a resultados erróneos ya sea falsos positivos o falsos negativos. Vaciar los pocillos completamente antes de pipetear la Solución de Lavado fresca. Pipetear la Solución Buffer de Lavado en los pocillos como se especifica para cada ciclo de lavado y no deje que los pocillos estén no cubiertos durante mucho tiempo o que se secan. - Por la aplicación de radioinmunoterapia, el número de pacientes con los anticuerpos humanos IgG antiratón (HAMA) ha aumentado significativamente. HAMA puede interferir en ensayos que utilicen anticuerpos monoclonales murinos, y dar lugar a resultados tantos falsos positivos como falsos negativos. Muestras de suero que contienen anticuerpos contra inmunoglobulinas murinas pueden todavía ser ensayadas en ensayos de este tipo si se añaden inmunoglobulinas murinas (suero, líquido ascítico o anticuerpos monoclonales no específicos) a la muestra. 13. Pruebas Funcionales Sensibilidad El límite de detección de IFN-gamma humano definido como la concentración del analito resultando en una absorción significativamente más alta que la del medio de dilución (media más dos desviaciones estándar), se determinó de ser 0.99 pg/ml (media de 6 ensayos independientes) Recuperación Intra-ensayo La recuperación del intra-ensayo se evaluó en tres experimentos independientes. Cada ensayo se llevó a cabo con 6 repeticiones de 8 muestras de suero que contienen diferentes concentraciones de IFN-gamma humano. Se llevaron a cabo dos curvas de estándar en cada placa. Los datos a continuación muestran la concentración media de IFN-gamma humano y el coeficiente de variación para cada muestra (ver Tabla 3). El calculado coeficiente de variación intra-ensayo total fue del 4.5 % (24) 12 / 18

14 Tabla 3 La concentración media de IFN-gamma humano y el coeficiente de variación para cada muestra: Muestra Experimento Concentración Media de IFN-gamma Humano (pg/ml) Coeficiente de Variación (%) Inter-ensayo La recuperación inter-ensayo dentro de un laboratorio se evaluó en 3 experimentos independientes. Cada ensayo se llevó a cabo con 6 repeticiones de 8 muestras de suero que contienen diferentes concentraciones de IFN-gamma humano. Dos curvas de calibración se realizaron en cada placa. Los datos a continuación muestran la concentración media de IFN-gamma humano y el coeficiente de variación calculado en 18 determinaciones de cada muestra (ver Tabla 4). El coeficiente de variación total calculado de inter-ensayo fue del 5.7 % Tabla 4 La concentración media de IFN-γ humano y el coeficiente de variación para cada muestra Muestra Concentración Media de Coeficiente de IFN-γ Humano (pg/ml) Variación (%) (24) 13 / 18

15 13.3. Recuperación después del Enriquecimiento La recuperación del enriquecimiento fue evaluada enriqueciendo cuatro niveles de IFN-gamma humano en muestras combinadas de suero normal. Las recuperaciones se determinaron en 3 experimentos independientes con 8 repeticiones cada uno. El suero no enriquecido sirvó como blanco en estos experimentos. La recuperación varió entre 88 % a 112 % con una recuperación total media de 97 % Dilución en Paralelo Se analizaron 4 muestras de suero con diferentes concentraciones de IFN-gamma humano mediante 2 diluciones en serie con 4 repeticiones cada uno. La recuperación varió entre 86 % a 114 %, con una recuperación total de 99 % (ver Tabla 5). Tabla 5 Muestra Dilución 1 1:2 1:4 1:8 1:16 2 1:2 1:4 1:8 1:16 3 1:2 1:4 1:8 1:16 4 1:2 1:4 1:8 1:16 Concentración Expectada de IFN-γ Humano (pg/ml) Concentración Observada de IFN-γ Humano (pg/ml) Recuperación de Concentración Expectada de IFN-γ Humano (%) Estabilidad de Muestras Estabilidad Congelación - Descongelación Alícuotas de las muestras de suero y sobrenadantes de cultivos celulares (enriquecidas o no enriquecidas) fueron almacenadas a -20 C y posteriormente descongeladas hasta 5 veces, y se determinó las concentraciones del IFN-gamma humano. Se detectó una disminución significativa de la inmunorreactividad de IFN-gamma humano (30 %) para dos o más ciclos de congelamiento y descongelamiento. Por consiguiente, las muestras deben almacenarse en partes iguales a -20 C y descongelarse solo una vez Estabilidad de Almacenamiento Alícuotas de las muestras de suero y sobrenadantes de cultivos celulares (enriquecidas o no enriquecidas) fueron almacenadas a -20 C, 2-8 C, temperatura ambiente (TA) y a 37 C, y la concentración de IFNgamma humano fue determinada después de las 24 horas. No se detectó una pérdida significativa de la inmunoreactividad del IFN-gamma humano durante el almacenamiento a -20 C, 2-8 C e TA. Se detectó una pérdida significativa de inmunorreactividad de IFN-gamma humano (50 %) durante el almacenamiento a 37 C después de 24 horas (24) 14 / 18

16 13.6. Comparación de Suero y Plasma Se obtuvieron muestras de suero así como plasma EDTA, citrato y heparina al mismo tiempo de dos donantes y se ensayó la concentración de IFN-gamma humano. Las concentraciones no fueron significativamente diferentes y por tanto todas estas fluidos corporales son adecuadas para su uso en este ensayo. Sin embargo, se recomienda asegurar la uniformidad de los preparaciones de sangre Especificidad La interferencia de factores circulantes del sistema inmune fue evaluada por enriquecer estas proteínas a concentraciones fisiológicamente relevantes en un suero positivo de IFN-gamma humano. No se ha detectado reactividad cruzada Valores Esperados Un panel de 40 muestras de suero así como plasma EDTA, citrato y heparina procedentes de donantes aparentement sanos seleccionados al azar (hombres y mujeres ) fue probado por IFN-gamma humano. Los niveles elevados de IFN-gamma humano dependen del tipo de trastorno inmunológico. Los niveles medidos pueden variar con la colección de la muestra utilizada. Los niveles de IFN-gamma humano detectados se detallan en la Tabla 6. Tabla 6 Matriz de Muestra Número de Muestras Rango Evaluadas (pg/ml) % Detectable Siero 40 n.d* Plasma (EDTA) 40 n.d* Plasma (Citrato 40 n.d* Plasma (Heparina) 40 n.d* Media de Detectable (pg/ml) *n.d. = non-detectable (no detectable), muestras medidas por debajo del punto estándar más bajo se consideran no detectables Calibración El inmunoensayo es calibrado con recombinante IFN-gamma humano altamente purificada, que ha sido evaluado según el estándar de referencia internacional NIBSC 82/587 y se ha demostrado que son equivalentes. NIBSC 82/587 se cuantifica en unidades internacionales (UI) de una IU que corresponde a 50 pg del IFN-gamma humano. 14. INFORMACIÓN DE PEDIDOS Para los pedidos póngase en contacto con: Para preguntas técnicas comuníquese con: Véase la última página (24) 15 / 18

17 15. Resumen: Preparación de Reactivos Solución Buffer de Lavado (1x) Añadir 50 ml de la Solución Buffer de Lavado Concentrado (20x) a 950 ml de agua destilada. Número de Tiras Solución Buffer de Lavado Concentrada (ml) Agua Destilada (ml) Solución Buffer de Ensayo (1x) Añadir 5 ml Solución Buffer de Ensayo Concentrada (20x) a 95 ml de agua destilada. Número de Tiras Solución Buffer de Ensayo Concentrada (ml) Agua Destilada (ml) Conjugado de Biotina Hacer una dilución 1:100 del Conjugado de Biotina en la Solución Buffer de Ensayo (1x): Número de Tiras Conjugado de Biotina (ml) Solución Buffer de Ensayo (1x) (ml) Estreptavidina-HRP Hacer una dilución 1:100 dilution de la Estreptavidina-HRP en la Solución Buffer de Ensayo (1x): Número de Tiras Estreptavidina-HRP (ml) Solución Buffer de Ensayo (1x) (ml) Estándar IFN-gamma Humano Reconstituir el Estándar liofilizado IFN-gamma humano con agua destilada. (El volumen de reconstitución se indica en la etiqueta del frasco estándar.) El estándar IFN-gamma humano concentrado tiene que ser diluído 1:1000 con Solución Buffer de Ensayo (1x) (24) 16 / 18

18 16. Resumen de Protocolo de Ensayo 1. Determinar el número requirido de tiras de la placa de microtitulación. 2. Lavar las tiras de la placa de microtitulación dos veces con Solución Buffer de Lavado. 3. Dilución estándar en la placa de microtitración: Añadir 100 µl de Diluyente de Muestras, por duplicado, a todos los pocillos estándar. Pipetear 100 µl de estándar preparado en los primeros pocillos y crear diluciones estándar mediante la transferencia de 100 µl de pocillo a pocillo. Deseche 100 µl de los últimos pocillos. Alternativamente dilución estándar externa en tubos (ver 9.5.1): Pipetear 100 µl de estas diluciones estándares en las tiras de los micropocillos. 4. Añadir 100 μl de Diluyente de Muestras, por duplicado, a los pocillos blancos. 5. Añadir 50 μl de Diluyente de Muestras a los pocillos de muestra. 6. Añadir 50 μl de muestras por duplicado a los pocillos respectivos. 7. Preparar el Conjugado de Biotina. 8. Añadir 50 μl de Conjugado de Biotina a todos los pocillos. 9. Cubrir las tiras e incubar 2 horas a temperatura ambiente (18-25 C). 10. Preparar Estreptavidina-HRP. 11. Vaciar y lavar los pocillos 3 veces con Solución Buffer de Lavado. 12. Añadir 100 µl de la Estreptavidina-HRP diluída a todos los pocillos. 13. Cubrir las tiras e incubar 1 hora a temperatura ambiente (18-25 C). 14. Vaciar y lavar los pocillos 3 veces con Solución Buffer de Lavado. 15. Añadir 100 μl de Solución Substrato TMB a todos los pocillos. 16. Incubar las tiras para approximadamente 10 minutos a temperatura ambiante (18-25 C). 17. Añadir 100 μl de Solución de Parada a todos los pocillos. 18. Ajustar el fotómetro y medir la absorbancia a 450 nm. Nota: Si han seguido las instrucciones en este protocolo las muestras han sido diluidas 1:2 (50 μl de muestra, 50 μl de Diluyente de Muestras), la concentración leída de la curva estándar debe ser multiplicada por el factor de dilución (x 2) (24) 17 / 18

19 17. REFERENCIAS SOBRE EL PRODUCTO 1. Cunningham, A. L.; Nelson, P. A.; Fathman, C. G.; Merigan, T. C.. Interferon gamma production by herpes simplex virus antigen-specific T cell clones from patients with recurrent herpes labialis. J.Gen.Virol. 1985; 66 ( Pt 2): Sidman, C. L.; Marshall, J. D.; Shultz, L. D.; Gray, P. W.; Johnson, H. M.. Gamma-interferon is one of several direct B cell-maturing lymphokines. Nature 1984; 309: Nast, C. C.; Zuo, X. J.; Prehn, J.; Danovitch, G. M.; Wilkinson, A.; Jordan, S. C.. Gamma-interferon gene expression in human renal allograft fine-needle aspirates. Transplantation 1994; 57: Mosmann, T. R.; Cherwinski, H.; Bond, M. W.; Giedlin, M. A.; Coffman, R. L.. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J.Immunol. 1986; 136: Suomalainen, H.; Soppi, E.; Laine, S.; Isolauri, E.. Immunologic disturbances in cow's milk allergy, 2: Evidence for defective interferon-gamma generation. Pediatr.Allergy Immunol. 1993; 4: Davidson, P. M.; Creati, L.; Wood, P. R.; Roberton, D. M.; Hosking, C. S.. Lymphocyte production of gamma-interferon as a test for non-tuberculous mycobacterial lymphadenitis in childhood. Eur.J.Pediatr. 1993; 152: Naylor, S. L.; Sakaguchi, A. Y.; Shows, T. B.; Law, M. L.; Goeddel, D. V.; Gray, P. W.. Human immune interferon gene is located on chromosome 12. J.Exp.Med. 1983; 157: Tang, M. L.; Kemp, A. S.; Thorburn, J.; Hill, D. J.. Reduced interferon-gamma secretion in neonates and subsequent atopy. Lancet 1994; 344: Aoki, Y.; Katoh, O.; Nakanishi, Y.; Kuroki, S.; Yamada, H.. A comparison study of IFN-gamma, ADA, and CA125 as the diagnostic parameters in tuberculous pleuritis. Respir.Med. 1994; 88: Ciampolillo, A.; Guastamacchia, E.; Caragiulo, L.; Lollino, G.; De, Robertis O.; Lattanzi, V.; Giorgino, R.. In vitro secretion of interleukin-1 beta and interferon-gamma by peripheral blood lymphomononuclear cells in diabetic patients. Diabetes Res.Clin.Pract. 1993; 21: Olsson, T.. Multiple sclerosis:cerebrospinal fluid. Ann.Neurol. 1994; 36 Suppl:S100-S Shinde, S. R.; Chiplunkar, S. V.; Butlin, R.; Samson, P. D.; Deo, M. G.; Gangal, S. G.. Lymphocyte proliferation, IFN-gamma production and limiting dilution analysis of T-cell responses to ICRC and Mycobacterium leprae antigens in leprosy patients. Int.J.Lepr.Other Mycobact.Dis. 1993; 61: Capobianchi, M. R.; Ameglio, F.; Tosi, R.; Dolei, A.. Differences in the expression and release of DR, BR, and DQ molecules in human cells treated with recombinant interferon gamma: comparison to other interferons. Hum.Immunol. 1985; 13: Edwards, B. S.; Merritt, J. A.; Fuhlbrigge, R. C.; Borden, E. C.. Low doses of interferon alpha result in more effective clinical natural killer cell activation. J.Clin.Invest 1985; 75: Le,thi Bich-Thuy; Queen, C.; Fauci, A. S.. Interferon-gamma induces light chain synthesis in interleukin 2 stimulated human B cells. Eur.J.Immunol. 1986; 16: Fitch, F. W.; McKisic, M. D.; Lancki, D. W.; Gajewski, T. F.. Differential regulation of murine T lymphocyte subsets 40. Annu.Rev.Immunol. 1993; 11: Sampaio, E. P.; Kaplan, G.; Miranda, A.; Nery, J. A.; Miguel, C. P.; Viana, S. M.; Sarno, E. N.. The influence of thalidomide on the clinical and immunologic manifestation of erythema nodosum leprosum. J.Infect.Dis. 1993; 168: Urban, J. L.; Shepard, H. M.; Rothstein, J. L.; Sugarman, B. J.; Schreiber, H.. Tumor necrosis factor: a potent effector molecule for tumor cell killing by activated macrophages. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1986; 83: Sastre, L.; Roman, J. M.; Teplow, D. B.; Dreyer, W. J.; Gee, C. E.; Larson, R. S.; Roberts,T.M.; Springer, T. A.. A partial genomic DNA clone for the alpha subunit of the mouse complement receptor type 3 and cellular adhesion molecule Mac-1. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1986; 83: Soliman, A. A.; el-aggan, H. A.; el-hefnawy, A. M.; Mahmoud, S. A.; bo Deya, S. H.. The value of ascites adenosine deaminase activity and interferon gamma level in discriminating tuberculous from non-tuberculous ascites. J.Egypt.Soc.Parasitol. 1994; (24) 18 / 18

20 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: WEB: Tel.: +1 (416) Fax: WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /

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