OPTIMIZATION OF BOVINE ARTIFICIAL INSEMINATION BY A NEW PROCEDURE OF FREEZING-UNFREEZING AND RE-DILUTION AT ENVIRONMENTAL TEMPERATURE FROM 0-10 HOURS

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1 OPTIMIZACIÓN DE LA INSEMINACIÓN ARTIFICIAL BOVINA MEDIANTE UN NUEVO PROCEDIMIENTO DE CONGELADO-DESCONGELADO Y REDILUCIÓN A TEMPERATURA AMBIENTE DE 0-10 HORAS O. Duverger, J.J. Hernández, Josefa Martínez, Namibia Díaz, L. Interian, F. Barba Centro de Investigación para el Mejoramiento Animal de la Ganadería Tropical (CIMAGT).Ave 101 No.6214 entre 100 y 62. Reparto Loma de Tierra, Cotorro, La Habana. Cuba. tecnologia@cima-minag.cu RESUMEN Con el objetivo de ahorrar los recipientes criogénicos y el nitrógeno líquido se empleó, como una alternativa, la modalidad de descongelar el semen bovino y rediluirlo, para ser usado en nuestras condiciones ambientales sin perjuicios para la fertilidad óptima. Se analizó la supervivencia espermática del semen bovino congelado en pastillas de 0.1 ml proveniente de 20 toros a los cuales se les estudiaron 5 muestras de 6 eyaculados, descongelados en ODT-bm (glucosa, citrato de sodio, EDTA, bromuro de potasio y glicina) y CIMATO (citrato de sodio y bromuro de potasio) como control, a 18-20, 30, 34 y 37 0 C, estas temperaturas se mantuvieron durante el test de incubación. Las muestras descongeladas a C, fueron además mantenidas en refrigeración (4-5 o C) durante 72 horas. Paralelamente, las muestras de semen descongeladas a diferentes temperaturas (18-20, 30, 34 y 37 0 C) en ODT-bm y CIMATO, fueron depositadas en bolsas refrigerantes que contenían agar y urea, entre horas, se encontraron diferencia de 4.53 y 4.50 puntos entre 12 y 24 horas respectivamente a favor del ODT-bm. Para las diferentes temperaturas se encontraron los siguientes valores: a 37 o C la sobrevivencia espermática se mantuvo por 5 horas con motilidad de 30 %. A 34 o C x 10 horas, a 30 o C por 12 horas, a 20 o C más de 20 horas y en refrigeración (4-5 o C) sobrepasó las 72 horas. Para el trabajo de campo los técnicos inseminadores mantuvieron el semen descongelado en las bolsas refrigerantes, las que garantizaron un ambiente adecuado, menor de 3.93 o C en relación con el medio exterior. Se inseminaron hembras y se gestaron un % en los genotipos trabajados (ganado comercial). Estos resultados fueron mayores que la media nacional. Palabras clave: semen bovino, crioconservación, redilución, inseminación artificial OPTIMIZATION OF BOVINE ARTIFICIAL INSEMINATION BY A NEW PROCEDURE OF FREEZING-UNFREEZING AND RE-DILUTION AT ENVIRONMENTAL TEMPERATURE FROM 0-10 HOURS ABSTRACT With the purpose of saving cryogenic containers and the liquid nitrogen, the method of unfreezing the bovine semen and rediluting it was used as an alternative to be employed under our environmental conditions without damages for optimum fertility. The spermatic survival of the frozen bovine semen in tablets of 0.1 ml was analyzed. They were from 20 bulls to which 5 samples of 6 unfrozen ejaculations in ODT-bm (glucose, sodium citrate, EDTA, potassium bromide and glycine) and CIMATO (sodium citrate and potassium bromide) as control, at 18-20, 30, 34 and 37ºC were studied. These temperatures were maintained during the incubation test. The unfrozen samples at 18-20ºC were also maintained under refrigeration (4-5 C) for 72 hours. In parallel, the unfrozen semen samples at different temperatures (18-20, 30, 34 and 37 C) in ODT-bm and CIMATO were placed in refrigerating bags containing agar and urea, for 12 to 24 hours. There was a difference of 4.53 and 4.50 points between 12 and 24 hours, respectively in favor of ODT-bm. For the different temperatures there were the following values at 37ºC the spermatic survival was maintained for 5 hours with the method of 30%. At 34ºC x 10 hours, at 30 C x 12 hours, at 20ºC more than 20 hours and under refrigeration (4-5ºC) it surpassed 72 hours. For the field work the insemination technicians maintained unfrozen the semen in refrigerating bags which guaranteed an adequate environment, less than 3.93ºC regarding outside temperature. With this method females were inseminated and 40.70% were gestated in the genotypes studied (commercial cattle). These results were higher than throughout the country. Key words: bovine semen, cryogenic conservation, re-dilution, artificial insemination INTRODUCCIÓN El semen en estado fresco fue el primer método utilizado para la introducción de la inseminación artificial (Sorensen 1940). A partir de 1960 cobró fuerza el semen congelado, primero en pequeña escala y luego en forma ascendente en casi todos los países donde se aplicó. El semen líquido, como algunos lo identificaron, fue utilizado a temperaturas adecuadas de refrigeración mediante la adición de trozos de hielo húmedo en el embalaje para 85

2 conseguir un máximo de rendimiento en la conservación. Las primeras técnicas para semen congelado fueron realizadas en baño de hielo seco en alcohol (Parez et al 1953, Jakobsen 1956), posteriormente fueron desarrolladas las técnicas de congelación en vapores de nitrógeno líquido (Adler 1960 y 1961), las cuales han sido modificadas hasta nuestros días, según los requerimientos de los diferentes procesos tecnológicos (Vischwanath y Shannon 1997; Bertolini y Bertolini 2009). Este nivel de desarrollo impuso a los consumidores la obligatoriedad del procesamiento del semen en condiciones de alta tecnología, la que necesita la introducción de los recipientes criogénicos para el almacenamiento y la transportación, que incluye además el gasto del nitrógeno líquido y otros insumos como una condición inherente al nuevo método. Por otra parte, el equipamiento y el suministro de elementos básicos (guantes para I.A, varillas, pajuelas y otros) pueden en ocasiones crear dificultades financieras incluso en países desarrollados (Schuh 1992, Moore y Thatcher 2006). Otras modalidades, que han sido utilizadas en países templados, ofrecen una alternativa de sugerencia en la utilización del semen congelado en forma rediluida, después de haber sido descongelado a temperatura ambiente, con la obtención de índices de fertilidad óptima [método DR (Duverger 2002)]. Aplicarlo en condiciones tropicales, presenta las mayores dificultades por las altas temperaturas del ambiente, y es éste el aspecto más controvertido, pues representa un reto mayor. Por consiguiente, esta investigación tuvo como objetivo: evaluar un procedimiento tecnológico de descongelación y redilución del semen con el fin de ahorrar los recipientes criogénicos y el nitrógeno líquido sin perjuicios para la fertilidad óptima. MATERIALES Y MÉTODOS Se congelaron eyaculados procedentes de 20 toros de diferentes razas (Holstein, Cebú, 5/8 Holstein x Cebú, Charolaise y Mambí), con indicadores seminales aptos según normas vigentes de los centros de IA. Se utilizaron 600 pastillas que fueron descongeladas en ODT-bm (glucosa, citrato de sodio, EDTA [sal disódica], bromuro de potasio, bicarbonato de sodio, 86 cloruro de potasio y glicina), y CIMATO (citrato de sodio y bromuro de potasio) como control, a temperaturas de 20, 30, 34, 37 o C y ambiente (18 o C), estas temperaturas se mantuvieron en el test de incubación, se determinó la sobrevivencia espermática y el porcentaje de la población espermática viva cada 1 hora hasta declinar la viabilidad y motilidad óptima. Las muestras descongeladas a temperatura ambiente, fueron mantenidas a 5 o C en refrigeración hasta las 120 horas, y se determinó la sobrevivencia espermática y el porcentaje de la población espermática viva cada 24 horas. Paralelamente, se descongeló semen a temperatura ambiente en ODT-bm y CIMATO y se colocó en bolsas refrigerantes de nylon, de doble pared, con una dimensión de 12 cm de largo por 88 cm de ancho, que contenían una solución de agar y urea, que conformaba un recinto biotécnico de acondicionamiento, con el objetivo de prescindir del termo criogénico de trabajo del técnico inseminador, se determinó la motilidad espermática a las 12 y 24 horas. Se realizaron estudios de conservación en dinámica para encontrar las diferencias entre la temperatura exterior y la interior en las bolsas refrigerantes. Análisis Estadístico Para el análisis estadístico de los resultados se calcularon los estadígrafos de dispersión, pruebas de comparación de medias y comparación de proporciones según lo dispuesto en el paquete estadístico de SAS (1996). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Entre las soluciones descongelantes para pastillas, descritas por diferentes autores y que presentan fertilidad óptima, se encuentran el buffer glucosa leche (78.1 %), el Minnessota Go (77.8 %), el Hannover Thawing solutions (HTS) y el Coconut milk glucosa (CMG), que se emplea también para rediluir el semen congelado y utilizarlo a temperatura ambiente, con una cobertura de horas, para tasas de fertilidad óptima. El Caprógeno, que contiene catalasa, descrito por Shannon (1968), es más costoso pero brinda mayor posibilidad (36 horas) y una óptima fertilidad. El ODT-bm, utilizado en este experimento, es un medio de composición electrolítica que por diferentes mecanismos de inhibición del

3 metabolismo espermático, permite una conservación de más de 120 horas para el semen en estado fresco y de horas para el semen descongelado, en condiciones de laboratorio, en temperaturas mantenidas en un rango de entre 20 hasta 34 o C (Figura 1). Figura 1. Comportamiento de la sobrevivencia espermática (test de incubación) en semen descongelado y rediluido en ODT-bm Este método fue empleado previamente por Shannon (1968) con óptima fertilidad en países templados, pero tal vez intereses relacionados con el advenimiento y desarrollo del semen congelado impidieron extender sus posibilidades para la optimización de los recipientes criogénicos y el ahorro del nitrógeno líquido. En nuestras condiciones tropicales el semen fue conservado dentro de bolsas refrigerantes de nylon, de doble pared, con una dimensión de 12 cm de largo por 88 cm de ancho, que contienen una solución de agar y urea. Se encontró una diferencia de hasta 3.93 o C menor en el interior de la bolsa refrigerante (26.54 o C), en relación con el medio exterior (30.47 o C), así como, una menor variación brusca de temperatura. Para una mayor efectividad del método Omer (1971), modificó el Cornell University Extender (CUE) y lo llamó Hannover Thawing Solution (HTS), y le eliminó la yema de huevo y la sulfanilamida, también modificó el Coconut Milk Extender y lo llamó Coconut Milk Glucosa, (CMG) al cual le fueron añadidos la glucosa y el carbonato hidrogenado de sodio y el polymyxin fue omitido para buscar un mayor tiempo de posibilidades en la preservación del semen. Con el HTS, se preserva la motilidad espermática hasta las 48 horas después de descongelar, hasta las 72 horas a 20, 25 y 30 o C, fue mejor en HTS que en CMG y a 15 o C no se observaron diferencias. Parece ser que la óptima motilidad se manifiesta hasta las 48 horas y subsiguientemente se produce una declinación de la motilidad y la viabilidad. Sin dudas, el mecanismo de acción de los medios de dilución juega un papel esencial en el comportamiento biológico relacionado con la motilidad viable. 87

4 En la presente investigación, el re diluyente desarrollado (ODT-bm), posee una fuente principal de energía que la toma de la glucosa, que también es un agente regulador de la presión osmótica. Mientras, el mantenimiento del ph óptimo ( ) está a cargo del citrato de sodio; la oscilación que se experimenta cuando se realiza la dilución se producen como consecuencia de la interrelación bioquímica de EDTA y el bicarbonato de sodio, los cuales son los responsables del mecanismo para la mantención de los niveles óptimos del potencial de hidrógeno e hidróxidos. Finalmente, el bromuro de potasio se comporta como una sal activante que está compensada por un agente depresor, el cloruro de potasio (Duverger 2002). En nuestros estudios el semen fue descongelado a 20, 30, 34 y 37 o C; obviamente el rango de una menor temperatura proporcionará una mayor motilidad y prolongación de la sobrevivencia espermática, un 5 % menor se encontró en el estudio de 20 o C a las 24 horas con respecto al porcentaje inicial de la motilidad. Omer (1971), con el HTS y el CMG, observó que la motilidad espermática fue preservada hasta las 48 horas en todos los rangos estudiados; por lo que elementos importantes pudieron estar contenidos en la composición de estos medios, lo que aporta aún más elementos para la explicación del método DR. En la Figura 2 se observa el comportamiento de la sobrevivencia espermática a 5 o C del semen descongelado a temperatura ambiente (18 o C), en este caso existe un óptimo nivel de sobrevivencia y motilidad hasta más allá de las 120 horas, lo que no significa una relación directa con la tasa de fertilidad. Figura 2. Comportamiento de la sobrevivencia espermática a 5 o C en semen descongelado a temperatura ambiente (18 o C) y rediluido en ODT-bm Los resultados de fertilidad con semen congelado, descongelado y utilizado en forma rediluida en diferentes tiempos de conservación fueron informados por Omer (1971), quien obtuvo 80 % en inseminaciones con 4-6 horas de conservación, igualmente Schuh (1992) alcanzó 77 % en 4-6 horas; 70 % en 24 horas; 59.1 % en horas y 48.6 % en horas. Según Zumilda y Duverger (1986), cuando la inseminación se realiza al momento y se usa descongelación en caliente, digamos 50 o C, la temperatura final de descongelación termina en un rango fisiológico de o C (pastillas de 0.1 ml en 1 ml de solución descongelante), esto contribuye a que se gane en un mayor porcentaje 88 de acrosomas intactos, que luego inician el proceso de capacitación espermática en el tracto genital (Robbins et al. 1972). En estas circunstancias escasa significación debe atribuírsele a la solución descongelante. En el caso del método para congelar y rediluir el semen (Duverger 2002) es preferible la descongelación ambiental con una media de 25 o C para no influir en el proceso de inicio de la capacitación espermática, donde la temperatura final de descongelación es fría 20.3 o C y así contribuye a la prolongación de la sobrevivencia espermática como consecuencia del ahorro de la energía metabólica al evitar el calentamiento y

5 condicionar los espermatozoides a un retorno incluso a 5 o C (temperatura de refrigeración). Así, los espermatozoides que previamente han sido congelados poseen ahora una especial condición para resistir determinadas variaciones de temperatura, por su contacto previo con determinados niveles de crioprotectores endo y exocelulares así como, también proporciones de lipoproteínas contenidas en la yema de huevo que es un componente común en los diluyoconservadores. Al ser rediluido, nuevamente la parte más significativa para el mantenimiento de la sobrevivencia con óptima motilidad y viabilidad es un nuevo recurso energético, al mantenimiento del nivel osmótico y los elementos necesarios para la regulación del potencial de hidrógeno. Estos eventos pudieran explicar los resultados obtenidos. La Tabla 1 muestra el porcentaje de motilidad espermática a las 12 horas conservadas al ambiente en bolsas refrigerantes que establecen 4.53 puntos de porcentaje a favor de ODT-bm y esta ventaja es de 6.50 puntos a las 24 horas. Tabla 1. Porcentaje de la motilidad espermática a las 12 y 24 horas entre el CIMATO y el ODT-bm conservado a temperatura ambiente en bolsas refrigerantes Motilidad (%) 12 horas 24 horas CIMATO ODT-bm CIMATO ODT-bm 26.13a 30.66b 13.7a 20.2b Beneficio 4.53 Beneficio 6.50 Letras diferentes por líneas difieren entre sí P<0.05 El descongelante CIMATO es un diseño de Moya et al. (1985), esta formado por 1.94 g de citrato de sodio y 0.6 g de bromuro de potasio, en un medio totalmente electrolítico, no posee fuente energética ni mecanismo biológico para el bloqueo del metabolismo espermático, es un magnífico activante de la motilidad espermática y muy estable en su ph, y su fertilidad ha sido demostrada. No obstante, presenta una baja protección en condiciones de refrigeración, pues ocurre la depresión espermática rápidamente. Aunque la media de la viabilidad espermática en el test de incubación a o C durante 4 horas fue muy similar, esto hace asumir que el CIMATO podría permitir su uso asociado al método propuesto por Duverger (2002) entre las 2-4 horas después de descongelar. Sin embargo, aún esto no ha podido ser probado en prueba de campo (Tabla 2). Tabla 2. Comportamiento de la viabilidad espermática (%) en el test de incubación o C en 0, 2 y 4 horas Diluyente 0 h 2 h 4 h CIMATO ODT- bm Estudios en la capacidad fertilizante del semen de toro después de la descongelación de 0-2 horas a o C han sido publicados por Hultnes (1984), que demostraron que la fertilidad en los primeros min. fue de 65.6 % en inseminaciones, y la más alta fue entre minutos 69.1 % en inseminaciones. Según nuestros resultados (Tabla 3), este comportamiento podría estar relacionado con un 89 óptimo mejoramiento del proceso de la capacitación espermática previo al depósito del material seminal en el cérvix. La eficiencia técnica de la IA alcanzada nacionalmente en los diferentes genotipos mediante el método tradicional se expone en la Tabla 4. Mediante el uso de la alternativa tecnológica propuesta, la fertilidad varió entre el al % con una media del % (Tabla 4). Estos resultados se encuentran dentro

6 del rango de los hallazgos citados por García et al. (2001). Estos datos sugieren, que el procedimiento tecnológico propuesto con el empleo de ODT-bm puede disminuir los costo de los servicios de IA y resolver la escasez de recipientes criogénicos y la disponibilidad de nitrógeno líquido. Tabla 3. Resultados de fertilidad general obtenidos en Cuba mediante el método DR (Duverger 2002) en diferentes empresas Experimento No. Empresa No. Inseminaciones No. Inseminadores Gestaciones Fertilidad (%) (=) (=) (=) (M) (=) (m) (=) (M) TOTAL (X) (=) Fertilidad igual tanto en bolsas como en termo;(m) Mayor eficiencia con bolsas que con termos;(m) Menor eficiencia para el método de las bolsas Tabla 4. Datos del registro nacional de control pecuario en relación con la fertilidad encontrada en diferentes genotipos Raza No Animales Inseminaciones Gestaciones Fertilidad (%) Holstein Siboney Cebú TOTAL CONCLUSIONES El diseño de tecnología para mantener a los espermatozoides con una óptima viabilidad permite realizar la descongelación y mantención de los mismos desde 0-10 horas en condiciones de temperatura ambiental en un rango que puede oscilar desde o C y realizar la inseminación con una óptima fertilidad. La solución electrolítica ODT-bm puede extenderse con posibilidades de uso en refrigeración (4-5 o C) hasta las 120 horas con óptima motilidad. Se diseñó un método de acondicionamiento en bolsas refrigerantes y aislantes que conforman el sustituto del termo de trabajo del inseminador. El método en su forma integral podría ser aplicado en el país ya sea al descongelar el semen y utilizarlo a temperatura ambiente o en estado fresco con la introducción de formas novedosas de aplicación. RECOMENDACIONES Implantar de forma progresiva en el país el método de utilizar el semen congeladodescongelado a temperatura ambiente y rediluido (DR) en la solución ODT-bm; en el período de tiempo de 0-10 horas. Implantar de forma localizada la inseminación con semen fresco en regiones que por sus características particulares, este método pudiera tener un mayor impacto en la reproducción ya que cuenta con formas novedosas para su 90

7 implantación que pudieran ser provechosas. Implantar de manera alternativa en las formas localizadas la inseminación con semen descongelado y refrigerado. Para condiciones que así lo requieran utilizar el modo integral biotécnico concebido en bolsa refrigerante o termos plásticos. REFERENCIAS Adler, H.C. Deep-Freezing of bovine semen in cellophane straw and storage in liquid air (summary). En: Arberetmimg, DEM kgc Vet. Og hamsbohojkmohes sterile tets forska p Adler, H.C. Freezing of bovine semen in straw with coldgas generator and storage in liquid air. En: IV Inter. Congr. Anim. Reprod. Artif. Insem., The Hague, 1960a. p. 947 Bertolini, M., Bertolini, L.R. Advances in reproductive technologies in cattle: from artificial insemination to cloning. Rev. Med. Vet. Zoot. 56: , Duverger, O. Manual técnico para usar semen de toro congelado en pastillas, descongelado y diluido (DR) a temperatura ambiente. Archivo Biblioteca noviembre, García, M.W.J., Goodger, T., Bennet, B.M.A. Perera, O Use of a standardized protocol to identify factors affecting the efficiency of artificial insemination servicie for cattle through progesterone measurement in fourteen countries. En: IAEA-TECDOC- 1220, P Hultnes, C. The use of artificial insemination in developing countries. En: Proc. X Int. Congr. Anim. Reprod. Artif. Insem., Urbana, Illinois USA, p Jakobsen, F.K. Forseg med dybfrysning of tyresed. Beretning fra forsags laboratoriet. Kobenhsvn. 292, Moore, K., Thatcher, W.W. Major advances associated with reproduction in dairy cattle. J Dairy Sci. 89:1254, Moya, A; Hernández,J.J., Duverger, O. Nuevo descongelante para semen bovino. En: Resumen VII Jornada Científica Centro Investigaciones para el. Mejoramiento Animal. La Habana, Cuba, p. 43 Omer, E.I. Possibilities of preservation of thawed bull semen (pallet) in different media ranges of temperature. Thesis Hannnover. In German, Parez, M., Vanhsecky, Y., Tabari, M. Congelation a 79 o C des spermatozoïdes des bovines. Élev. et Insem. (19):67, Robbins, R.K., Gerber, L.E., Saacke, R.C. Influence of thaw rate on maintenance of the acrosomal cap. J. Anim. Sci. 35:252 (Abstr.), SAS System for Windows released SAS Institute Inc. USA Schuh, H. Comparison between liquid and deepfrozen semen for artificial insemination in developing and developed countries. Revista Mundial de Zootecnia (1-2):44, Shannon, P. Advances in semen dilution. Proc. N.Z. Soc. Anim. Prod. 28:21, Sorensen, E. Overforing of gelatineret sperma: parafinerede cellophanror. Medlemsbldanske Dyrlaegeforen 23:166, Vischwanath, R., Shannon, P. Do sperm cells age? A review of the physiological changes in sperm during storage at ambient temperature. Reprod Fertil Dev. 9:321, Zumilda, L., Duverger, O. Influencia de la temperatura y otros factores en la descongelación de semen bovino. Trabajo de Diploma. Instituto Superior. Ciencias Agropecuarias. Facultad Pecuaria. La Habana, Cuba, Recibido 7 mayo de 2012 Aceptado 27 de diciembre de