ANALIZADORES. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA
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- Gerardo Ramos Redondo
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1 ANALIZADORES 1
2 Analizadores Cuadrupolo (Q) Trampa de iones (IT) Sector magnético-eléctrico (BE) Tiempo de vuelo (TOF) Resonancia iónica ciclotrónica (ICR) 2
3 Analizadores Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) 3
4 Analizadores Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Cuando un ion m/z deja la fuente: mv 2 /2 = z e V = E c El tiempo (t)( ) requerido para volar d es: v = d / t m (d( 2 / t 2 ) / 2 = z e V t 2 = m d 2 t = m d 2 2 z e V z 2 e V 1/2 m / z puede ser calculado a partir de t 4
5 Analizadores Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Ejemplo: V = 2000 v d = 1 m t H = 1.7 µs + t 2500 = 50 µs t = m d 2 z 2 e V 1/2 No tiene límite de m 1/2 t 2 t 1 = d 2 ( m 2 ) 1/2 ( m 1 ) 1/2 z 2 e V fullereno C t 720 = µs C C +. t 721 = µs t = 19 ns Para mejorar la resolución: aumentar el largo del tubo disminuír la dispersión en energías 5
6 Analizadores Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) s 0 s a s d v m/z Detector E t = t 0 + t a + t d 6
7 Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Analizadores E E kin kin v = = = zeu 1 2 s t mv 2 t = t (2s 0 + a + s d ) 2 m zeu m = a + b t 2 7
8 Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Analizadores t = 2 m k / z e V 0 + ε ε D 0 / V 0 + m k / 2 z e L 0 / V 0 + ε ε : energía inicial del ion (ev) D 0 : distancia de extracción L 0 : distancia en la zona de deriva V 0 : voltaje de extracción 8
9 Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Analizadores Problema: Picos anchos (baja resolución). Causa: Iones con la misma masa tienen diferentes velocidades (dispersión de energía) Muestra + matriz Iones de igual masa con diferentes velocidades Para mejorar la resolución: disminuír la dispersión en energías 9
10 Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Problema: Picos anchos (baja resolución). Analizadores a c b d Causas: Iones con la misma masa a- parten a distinto tiempo b- parten de diferentes puntos c- tienen diferente velocidad d- poseen diferente dirección inicial Plano de enfoque espacial Extracción en dos etapas 10
11 Analizadores 11
12 Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Analizadores Cómo compensar la dispersión de energía inicial (y tiempo y espacio) de iones de igual masa? Time-lag focusing TLF Delayed Extraction (DE) Pulse ion extraction (PIE) TOF con Reflectrón 12
13 Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Delayed Extraction (DE) 0 V Iones de igual masa y diferente velocidad Detector Analizadores 1: No se aplica ningún campo eléctrico. Los iones difunden durante el delay time. +20 kv kv 2: Se aplica un campo eléctrico. El gradiente hace que los iones más lentos se aceleren más. 0 V 3: Los iones lentos alcanzan a los rápidos en el detector Placa de muestra Facultad Grid de de Ciencias potencial Exactas y Naturales variable 13
14 Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Potenciales de extracción - DE Analizadores potencial acelerador (15-25) kv Potencial variable (% del potencial acelerador) Ground grid +20 kv +18 kv (90%) Potential Gradient Al tubo de vuelo Región de ionización El gradiente de potencial y el tiempo de demora (delay time) deben ser ajustados para obtener la máxima resolución para un dado rango de masa. 14
15 Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Potenciales de extracción - DE Analizadores Son parámetros interactivos Kompact Maldi IV Shimadzu-Kratos 15
16 Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Delayed Extraction (DE) vs tiempo Pulse Delay Time Analizadores Pulso láser potencial de aceleración kv potencial variable tiempo delay time de extracción ( ns) 16
17 Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Analizadores Mejoras en la resolución por DE Linear mode Reflector mode delayed extraction R=1,100 continuous extraction R= m/z muestra: mezcla de ADN (36-mer) 17
18 Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Analizadores Reflectrón Es un espejo iónico que somete a los iones a un campo eléctrico uniforme repulsivo, que los refleja. Detector Ion Source Reflectrón (espejo iónico) 18
19 Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) reflectrón Analizadores 19
20 Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Analizadores E E kin kin v = = = zeu 1 2 s t mv 2 reflectrón t = t (2s 0 + a + s d ) 2 m zeu m = a + b t 2 20
21 Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Reflectrón Analizadores + + y x Enfoca los iones 21
22 Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Reflectrón Distancia penetrada por un ion de v ix en el reflectrón : Analizadores x = K / q E K energía cinética del ion E campo en el reflectrón Supongamos dos iones i e i con igual m y K /K = a 2 K = 0.5 m v ix 2 v ix = (2 K / m) 1/2 K = 0.5 m v i x 2 v i x = (2 K / m) 1/2 = (2 K a 2 / m) 1/2 v i x = a v ix 22
23 Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Reflectrón Analizadores El tiempo fuera del reflectrón : v i x = a v ix t = d / v ix t = d / v i x = d / a v ix t = t / a El tiempo dentro del reflectrón : x = K / q E x = K / q E = a 2 K / q E = a 2 x Cuando llega a x: v = 0 v (promedio) = v ix / 2 en el reflectrón t = 2 t 0 = 2 x /(v ix / 2) t r = 4 x / v ix t r = 4 x / v i x = 4 a 2 x/av ix = 4 a x /v ix t r = a t r 23
24 Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Analizadores Reflectrón (K /K = a 2 ) El tiempo total de vuelo : t = t / a t r = a t r t T = t + t r t T = t + t r = t / a + a t Si a > 1 el ion con exceso de Ec tiene un vuelo más corto fuera y más largo dentro del reflectrón Lo opuesto con a < 1 Con los valores adecuados de E, V y d se compensan totalmente 24
25 Analizadores Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Modo lineal Masas altas (> 50 kda) Alta sensibilidad 25
26 Analizadores Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Modo Delayed Extraction (DE) Masas más m s bajas (< 40 kda) Buena resolución Alta sensibilidad 26
27 Analizadores Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Modo reflectrón Masas bajas (< 10 kda) Alta resolución Baja sensibilidad 27
28 Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Analizadores Placa de muestra Extracción grids Atenuador Prisma Laser Selector tiempo de iones Reflector detector Reflector detector Lineal Celda de colisión vacío cámara vacío 28
29 Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) reflectrón Analizadores Kompact Maldi IV Shimadzu-Kratos 29
30 Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Resolución y precisión en la determinación de melitina Analizadores ppm error Resolution = Counts ppm error Resolution = ppm error Resolution = Mass (m/z) 30
31 Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Analizadores delayed extraction R=1,100 Mejoras en la resolución por DE Linear mode Reflector mode Modo lineal continuous extraction R=125 delayed extraction R=11,000 Modo reflectrón continuous extraction R= m/z muestra: mezcla de ADN (36-mer) m/z muestra: mezcla de ADN (20-mer) 31
32 Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Analizadores Características generales: Límite de m/z: ilimitada Resolución: relativa s/lineal o reflectrón (10000) Se puede acoplar a otros analizadores (TOF, Q, LT, BE) y a pocas fuentes de ionización (MALDI) Lím. detección: 1-10 pg Velocidad de scaneo: muy rápida (> 10 6 u/s) Más difícil realizar EM/EM sin otros analizadores Requerimiento de vacío: 10-7 torr (mín) API Reflectrón Símbolo Lineal 32
33 Analizadores Espectrometría a de masa tándem con un Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) PSD (post-source source decay) Prompt fragmentation : indistinguible en tiempo y espacio del evento de la ionización. Fragmentación metaestable (cuando ocurre en la zona de aceleración es perjudicial) Fragmentación post-fuente (Post-source fragmentation) 33
34 Analizadores Espectrometría a de masa tándem con un Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) TOF-TOF 34
35 Tandem Híbridos Q-TOF 35
36 Tandem Híbridos Q-TOF Removeable Sample cone Extraction cone Z-Spray Ion source Transfer optics Quadrupole (resolving) Hexapole (collision cell) Waters-Micromass Reflectron modo V 36
37 Tandem Híbridos Q-TOF Waters-Micromass modo W 37
38 Tandem P u s h e r Ions in Híbridos Q-TOF V2 V1 V1 > V2 W Mirror MCP 38
39 Tandem Híbridos Q-TOF peptideo HR argentina2 69 (3.182) M3 [Ev ,It50,En1] (0.050,200.00,0.200, ,2,Cmp); Cm (60:77) TOF MS ES+ 3.47e4 Espectro ESI de una mezcla de péptidos % mass 39
40 Tandem Híbridos Q-TOF peptideo CID950 argentina5 MaxEnt 3 7 [Ev-82828,It50,En1] (0.050,200.00,0.200, ,2,Cmp) : TOF MSMS ES+ Espectro ESI MS/MS del ion m/z 1900 % (M+H) M/z 40
41 MS/MS en un TOF Tandem TOF - Modo reflectrón (ReTOF) 41
42 Post-Source Decay (PSD) MS/MS en un TOF [M+H] + Tandem t/m MALDI target DE Iones PSD de masas bajas Detector Ion gate Iones PSD de masas altas Ion molecular Precursor Uacc Up U1 U2 Región libre de campo 42
43 MS/MS en un TOF Post-Source Decay (PSD) Tandem Selección de precursor ( Ion gating ) 43
44 MS/MS en un TOF Post-Source Decay (PSD) Tandem (m p H) + (m 1 H) + + m 2 (m p H) v = (m 1 H) v + m 2 v en modo lineal llegan a igual tiempo E 0 = 0.5 (m p H) v 2 v 2 = 2 E 0 / (m p H) E 1 = 0.5 (m 1 H) v 2 E 1 = E 0 m 1 H/ m p H en modo reflectrón se diferencia m p H + de sus fragmentos Inconveniente: no se enfocan convenientemente 44
45 MS/MS en un TOF Post-Source Decay (PSD) Tandem Espejo PSD R = 1.00 MH + (PM 1000) enfocado ---- AH + (PM 700) no enfocado... BH + (PM 300) no enfocado Espejo PSD R = 0.7 MH + (PM 1000) no enfocado ---- AH + (PM 700) enfocado... BH + (PM 300) no enfocado Espejo PSD R = 0.3 MH + (PM 1000) no enfocado ---- AH + (PM 700) no enfocado... BH + (PM 300) enfocado 45
46 MS/MS en un TOF Tandem Post-Source Decay (PSD) 46
47 MS/MS en un TOF Post-Source Decay (PSD) Tandem Reflectrón de campo curvo: permite obtener el espectro completo de fragmentos 47
48 MS/MS en un TOF Tandem PSD P R G F S PF R Bradykinin, MW Sequence: NH 2 -PRGFSPFR-COOH y b Counts P 70.2 R b F y1 b b y b y3 b y y y b Facultad de 400 Ciencias Exactas 500 y Naturales Mass (m/z) 48
49 Bibliografía -Time-of-Flight Mass Spectrometry. Instrumentation and Applications in Biological Research. R. J. Cotter ACS - Time-of-Flight Mass Spectrometry and its Applications. Ed. E. W. Schlag Elsevier - Mass Spectrometry. Principles and Applications. De Hoffmann, E., Charette, J. y Stroobant, V John Wiley & sons Ltd. - Mass Spectrometry. J. H. Gross Springer - Practical Organic Mass Spectrometry. Chapman J. R John Wiley & sons Ltd - Manuales Voyager y Kompact MALDI IV 49
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