MEMORIA DEL CURSO CURSO DE EXTRACCION DE ACIDOS NUCLEICOS (ADN) DE SORGO

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1 MEMORIA DEL CURSO CURSO DE EXTRACCION DE ACIDOS NUCLEICOS (ADN) DE SORGO RÍO BRAVO, TAMAULIPAS DICIEMBRE 06 DEL

2 CONTENIDO INTRODUCCION... 3 ANTECEDENTES... 3 OBJETIVO:... 4 FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LA EXTRACCIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLÉICOS: ADN... 4 EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO VEGETAL... 5 METODOS DE EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ADN... 6 EXTRACCIÓN DEL ADN DE SORGO CON KIT COMERCIAL (NucleoSpin Plant II)... 8 PROTOCOLO DE EXTRACCION DE ADN CON KIT COMERCIAL (Kit NucleoSpin Plant II Mini)... 9 *Preparación de soluciones y reactivos (10 muestras):... 9 Ruptura celular con Nitrógeno líquido... 9 SEPARACION DEL ADN EN GEL DE AGAROSA: EVALUACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN Y CALIDAD DEL ADN GENÓMICO OBTENIDO ANÁLISIS DE BANDAS EN FOTODOCUMENTADOR BIBLIOGRAFIA

3 INTRODUCCION La extracción y purificación de ácidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayoría de los estudios de biología molecular y de todas las técnicas de recombinación de ADN. En este caso, los métodos de extracción permiten obtener ácidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para después realizar análisis específicos de modificaciones genéticas mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La calidad y la pureza de los ácidos nucleicos son dos elementos primordiales en ese tipo de análisis. Si se desea obtener ácidos nucleicos altamente purificados, que no contengan contaminantes inhibidores, es preciso aplicar métodos de extracción adecuados. Dada la gran variedad de métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos existentes, la elección de la técnica más adecuada suele efectuarse conforme a los criterios siguientes: Ácido nucleico blanco Organismo fuente Material inicial (tejido, hoja, semilla, material transformado, etc.) Resultados deseados (rendimiento, pureza, tiempo que requiere la purificación) Uso posterior (PCR, clonación, etiquetado, transferencia, RT-PCR, síntesis de ADNc, etc.). Existen varios métodos de extracción de ADN, por ejemplo por lisis celular por cizallamiento, con métodos comunes de fácil aplicación en el laboratorio, empleando kits comerciales y hasta empleando sistemas automatizados con robots de extracción. Los más comúnmente empleando recientemente, dada la rapidez, eficiencia y calidad del ADN que se obtienen han sido los kits comerciales, sin embargo tienen la desventaja de ser en ocasiones de alto costo. Sin embargo su uso se extiende cada vez más. La finalidad de este curso es realizar extracción de ADN genómico de sorgo empleando un kit comercial, de tal manera que se puedan adquirir los conocimientos teóricos y prácticos sobre la extracción del ADN de este cultivo de gran importancia agrícola en la región. ANTECEDENTES El ADN vegetal se encuentra en el núcleo celular, específicamente dentro de los cromosomas, pero también se encuentra en los cloroplastos, ya que este organelo presenta una molécula de ADN circular y arrollada de tipo procarionte y eso le da cierta autonomía parcial con respecto al Núcleo, es decir puede realizar sus propias síntesis de Proteínas. El ADN de las células vegetal se encuentra dentro del núcleo, pero además 3

4 tienen dos orgánulos con su propio material genético: las mitocondrias y los cloroplastos, ambos tienen una molécula circular de ADN. Una vez rotas las células, todo el material celular queda libre y, en presencia de detergente, se separan los componentes en base a su solubilidad. El ADN se precipita con alcohol y se separa del resto de los componentes. Independientemente del método que se emplee para extraer el ADN genómico, todos emplean los principios básicos de lisis celular, extracción de los ácidos nucleicos y purificación de los mismos. Para esto se han desarrollado una serie enorme de métodos de extracción y purificación, desde los caseros y comunes, hasta el empleo de kits y de sistemas automatizados de extracción de los ácidos nucleicos. Particularmente en sorgo, se tienen reportes de extracción del ADN por diferentes métodos, sin embargo el más común ha sido el método CTAB con ligeras modificaciones; sin embargo, se pueden probar otros métodos de extracción para llegar a los mismos resultados (ADN puro) que posteriormente se empleará para distintos fines. OBJETIVO: Identificar las etapas indispensables en la extracción del ADN genómico de sorgo y realizar un procedimiento modelo para la obtención del ADN de sorgo. SESIÓN TEORICA EN LABORATORIO FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LA EXTRACCIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLÉICOS: ADN Los ácidos nucleicos son compuestos nitrogenados de elevado peso molecular que se pueden encontrar en las células asociados a proteínas formando complejos llamados núcleo-proteínas. Estas proteínas tienen carácter básico mientras que los ácidos nucleicos son ácidos. Se conocen dos grupos de ácidos nucleicos: RNA (ácido ribonucleico) y el DNA (ácido desoxirribonucleico). La hidrólisis controlada de RNA y DNA produce nucleótidos. Si la hidrólisis continúa se producen nucleósidos y finalmente fosfatos, azúcares y bases púricas y pirimídicas. La función biológica de los ácidos nucleicos es fundamental: el DNA está asociado con el material genético de las células, pudiendo encontrarse como una sola cadena en algunos microorganismos o formando parte de núcleo-proteínas de los cromosomas en organismos superiores. Almacena información genética y sirve de molde para la síntesis de proteínas. Se encuentra mayoritariamente en el núcleo y en muy poca cantidad en mitocondria y cloroplastos. El RNA participa en la síntesis de proteínas y se distribuye en toda la célula, mayormente en citoplasma en forma soluble o formando parte de los ribosomas. 4

5 El protocolo básico de extracción de DNA consiste en el tratamiento del homogeneizado con disolventes orgánicos (fenol, cloroformo o ambos). Para evidenciar la presencia de ácidos nucleicos en extractos celulares vegetales se requiere células en cantidad suficiente y en medio libre de interferencias que puedan causar lisis celular o hidrólisis de los ácidos nucleicos por nucleasas. Una completa extracción de ácidos nucleicos es fundamental para la determinación indirecta. Una hidrólisis ácida remueve todas las bases púricas (hidrólisis de uniones N-glicosídicas entre pentosa y las bases púricas) sin afectar las uniones fosfodiester del esqueleto nucleotídico, por lo tanto obtenemos como producto ácidos nucleicos sin bases púricas. Las desoxipentosas debido a la hidrólisis ácida sufren deshidratación dando aldehídos δ-hidroxi-levulínicos. EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO VEGETAL En vegetales, el método más común para extraer el ADN genómico ha sido el método CTAB (Murray y Thompson, 1980). El método de extracción y purificación con CTAB, bromuro de cetiltrimetil amonio (CTAB) fue elaborado por Murray y Thompson en 1980 (Murray y Thompson, 1980) y publicado posteriormente, en 1987, por Wagner y sus colaboradores (Wagner et al., 1987). El método es adecuado para extraer y purificar ADN de vegetales y alimentos derivados de vegetales y está especialmente indicado para eliminar los polisacáridos y los compuestos polifenólicos, que, de otro modo, alterarían la pureza del ADN y, por tanto, su calidad. Este procedimiento se ha aplicado con frecuencia en genética molecular de los vegetales y ha sido probado en ensayos de validación para detectar OGM (Lipp et al., 1999; 2001). Se han elaborado algunas variantes adicionales para adaptar el método a una amplia gama de matrices de alimentos transformados o sin transformar (Hupfer et al., 1998; Hotzel et al., 1999; Meyer et al., 1997; Poms et al., 2001). Los principios de este método consisten en: lisis, extracción y precipitación de los ácidos nucleicos. Lisis de la membrana celular - La primera etapa de la extracción del ADN es la rotura de la membrana celular y nuclear, para lo cual la muestra homogeneizada se trata primero con el tampón de extracción, que contiene EDTA, Tris-HCl y CTAB. Todas las membranas biológicas presentan la misma estructura general, integrada por moléculas de lípidos y de proteínas, unidas por interacciones no covalentes. Las moléculas lipídicas están ordenadas en una doble capa continua, en la que las moléculas proteínicas están «disueltas». Las moléculas lipídicas están formadas por extremos hidrófilos, denominados «cabezas», y extremos hidrófobos, denominados «colas». En este método, el detergente (CTAB) contenido en el tampón de extracción provoca la lisis de la membrana. Dado que la composición de los lípidos y del detergente es similar, el componente de CTAB del tampón de extracción captura los lípidos que integran la membrana celular y nuclear. Posteriormente se libera el ADN genómico cuando el detergente captura los lípidos y las proteínas al entrar en contacto la membrana celular y el tampón de extracción con CTAB. Con una concentración salina (NaCl) determinada, el detergente forma un complejo insoluble con los ácidos nucleicos. El EDTA es un componente quelante, que se une al magnesio, 5

6 entre otros metales. El magnesio es un cofactor de la desoxirribonucleasa. Al unir el magnesio al EDTA, la actividad de la desoxirribonucleasa presente disminuye. El Tris-HCl confiere a la solución la capacidad de amortiguar el ph (un ph inferior o superior daña el ADN). Es importante señalar que, como los ácidos nucleicos se degradan fácilmente en esta fase de la purificación, debe reducirse al mínimo el tiempo transcurrido entre la homogeneización de la muestra y la adición de la solución tampón con CTAB. Una vez que se han roto las membranas de la célula y de los orgánulos (como los que se encuentran alrededor de las mitocondrias y los cloroplastos), se purifica el ADN. Extracción - En esta etapa, se separan los complejos formados por los ácidos nucleicos y el CTAB de los polisacáridos, los compuestos fenólicos, las proteínas y los demás lisados celulares disueltos en la solución acuosa. Es especialmente importante eliminar los polisacáridos y los compuestos fenólicos, pues pueden inhibir numerosas reacciones enzimáticas. En concentraciones hiposalinas (NaCl < 0,5 M), los contaminantes de los complejos de ácidos nucleicos no precipitan y pueden eliminarse extrayendo la solución acuosa con cloroformo. El cloroformo desnaturaliza las proteínas y facilita la separación de las fases acuosa y orgánica. La fase acuosa suele constituir la fase superior. No obstante, si dicha fase es densa debido a la concentración salina (> 0,5 M), formará la fase inferior. Además, si el ph de la solución acuosa no se ha equilibrado debidamente (ph 7,8 8,0), los ácidos nucleicos tenderán a repartirse en la fase orgánica. Si es preciso, la extracción con cloroformo se realizará dos o tres veces, con objeto de eliminar por completo las impurezas de la capa acuosa. Para perfeccionar la extracción de los ácidos nucleicos, puede retroextraerse la fase orgánica con una solución acuosa, que se añade a continuación al extracto anterior. Una vez purificados los complejos de ácidos nucleicos, puede procederse a la precipitación, última etapa del procedimiento. Precipitación - En esta última etapa se separan los ácidos nucleicos del detergente, para lo cual la solución acuosa se trata primero con una solución de precipitación compuesta por una mezcla de CTAB y NaCl en concentración elevada (NaCl > 0,8 M). Una alta concentración salina es necesaria para que se forme un precipitado de ácidos nucleicos. Puede ser preferible emplear acetato de sodio en lugar de NaCl por su capacidad tampón. En estas condiciones, el detergente, que es más soluble en alcohol que en agua, puede eliminarse por lavado, mientras que los ácidos nucleicos precipitan. El posterior tratamiento con etanol al 70 % permite una mayor purificación o elución de los ácidos nucleicos de la sal residual. METODOS DE EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ADN Para extraer los ácidos nucleicos del material biológico es preciso provocar una lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los ácidos nucleicos de los restos de células. El procedimiento de lisis idóneo suele consistir en un equilibrio de técnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material inicial complejo (un tejido, por ejemplo), pero 6

7 suficientemente suave para preservar el ácido nucleico blanco. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes: Ruptura mecánica (trituración, lisis hipotónica, etc.); Tratamiento químico (detergentes, agentes caotrópicos, reducción con tioles, etc.); Digestión enzimática (Proteinasa K, etc.). Es posible romper la membrana celular e inactivar las nucleasas intracelulares al mismo tiempo. Por ejemplo, una misma solución puede contener detergentes que solubilicen las membranas celulares y sales caotrópicas fuertes que inactiven las enzimas intracelulares. Tras la lisis celular y la inactivación de las nucleasas, los restos de células se eliminan fácilmente por filtración o precipitación. Los métodos empleados para purificar los ácidos nucleicos de extractos celulares suelen ser combinaciones de dos o más técnicas de las siguientes: Extracción/precipitación; Cromatografía; Centrifugación; Separación por afinidad. En los párrafos siguientes se describen brevemente estas técnicas (Zimmermann et al., 1998). Extracción/precipitación A menudo se efectúa una extracción con disolventes para eliminar los contaminantes de los ácidos nucleicos. Por ejemplo, suele emplearse una combinación de fenol y cloroformo con objeto de eliminar las proteínas. Para concentrar los ácidos nucleicos suele realizarse una precipitación con isopropanol o etanol. Si la cantidad de ácido nucleico diana es escasa, puede añadirse a la mezcla un portador inerte (como el glucógeno) para favorecer la precipitación. También puede realizarse una precipitación selectiva con concentraciones salinas elevadas (precipitación salina) o una precipitación de las proteínas mediante cambios del ph. Cromatografía Pueden emplearse diversas técnicas cromatográficas de separación: permeación sobre gel, intercambio iónico, adsorción selectiva o unión por afinidad. La permeación sobre gel aprovecha las propiedades de las partículas porosas del gel para tamizar moléculas. Se emplea una matriz con poros de tamaño definido, que dejan pasar las moléculas más pequeñas por difusión, pero no las más grandes, que quedan eluidas en el volumen vacío. Así pues, las moléculas quedan eluidas por orden de tamaño decreciente. La cromatográfica de intercambio iónico es otra técnica, que se basa en la interacción electrostática de la molécula diana o blanco con un grupo funcional de la matriz en columna. Los ácidos nucleicos (polianiones lineales con fuerte carga negativa) pueden eluirse de las columnas de intercambio iónico con simples Tampones salinos. En la cromatografía de adsorción, los ácidos nucleicos se fijan selectivamente en sílice o vidrio, en presencia de determinadas sales (por ejemplo, sales caotrópicas), mientras que otras moléculas biológicas no se 7

8 fijan. A continuación, los ácidos nucleicos pueden eluirse con agua o un tampón hiposalino y se obtiene una muestra que puede emplearse directamente en las aplicaciones posteriores. Centrifugación La centrifugación selectiva constituye un método de purificación eficaz. Así, por ejemplo, la ultracentrifugación en gradientes autogenerados de CsCl con fuerzas g elevadas se lleva empleando mucho tiempo para purificar plásmidos. La centrifugación suele asociarse a otros métodos, como la cromatografía de columna centrifugada, en cuyo caso se combina la permeación sobre gel y la centrifugación para separar el ADN o ARN de contaminantes más pequeños (sales, nucleótidos, etc.), intercambiar tampones o seleccionar según el tamaño. Algunos procedimientos combinan la adsorción selectiva en matriz y la elución por centrifugación para purificar de forma selectiva un tipo de ácido nucleico. Separación por afinidad En los últimos años, cada vez son más los métodos de purificación que combinan la inmovilización por afinidad de ácidos nucleicos y la separación magnética. Por ejemplo, los ARNm poli A + pueden unirse a partículas magnéticas revestidas de estreptavidina mediante oligo dt marcados con biotina, y el complejo de partículas puede eliminarse de la solución (y de los contaminantes libres) con un imán. Esta técnica en fase sólida simplifica la purificación de los ácidos nucleicos, pues permite sustituir las etapas de centrifugación, extracción orgánica y separación de fases por una operación de separación magnética, única y rápida. EXTRACCIÓN DEL ADN DE SORGO CON KIT COMERCIAL (NucleoSpin Plant II) Contenido del Kit de extracción NucleoSpin Plant II mini: Buffer de lisis PL1 Buffer de lisis PL2 Buffer de precipitación PL3 Buffer de ligación PC Buffer de lavado PW1 Buffer de lavado PW2 concentrado Buffer de elución PE RNAasa A (liofilizada) Filtros NucleoSpin violetas Columnas NucleoSpin verdes Colección de tubos (2 ml) 8

9 SESIÓN PRÁCTICA EN LABORATORIO PROTOCOLO DE EXTRACCION DE ADN CON KIT COMERCIAL (Kit NucleoSpin Plant II Mini) El material vegetal a emplear es tejido de hoja de sorgo. Se emplearán 10 genotipos de sorgo realizando 2 repeticiones por genotipo: *Preparación de soluciones y reactivos (10 muestras): Buffer PL2: Incubar previamente a 37 C y mezclar bien antes de usar. RNaseA: Disolver 1.5 mg en 150 ul de agua MilliQ Wash Buffer PW2: Preparar 30 ml. 6ml Buffer PW ml etanol Buffer de elución PE: Precalentar a 65 C hasta su uso 1.- Pesar 100g de tejido vegetal de sorgo. Ruptura celular con Nitrógeno líquido 2.- Colocar la muestra en mortero y macerar con Nitrógeno Líquido (LN 2 ). *Observaciones: Llenar el mortero a la mitad con LN 2, macerar la muestra vigorosamente hasta obtener polvo fino. Sumergir en LN 2 la espátula y el tubo e introducir la muestra rápidamente dentro de tubo evitando formar una pasta. 3.- Agregar 300 ul de Buffer PL2* y 10 ul de RNaseA*(concentración 15 mg/ul) y mezclar cuidadosamente. 4.- Incubar (baño maría) a 65 C durante 15 min. 5.- Agregar 75 ul Buffer PL3. Mezclar e incubar en hielo durante 5 min. 6.- Trasferir la mezcla a tubo de filtrado/clarificación (tubo violeta) previamente montado sobre tubo recolector (2ml). 7.- Centrifugar a 12,500 rpm, 4 C durante 2 min. 8.- Se descarta el filtro (violeta). Si se presenta un pellet, trasferir el sobrenadante a un nuevo tubo colector. 9.- Agregar 450 ul de Buffer PC. Centrifugar 12,500 rpm, 4 C durante 1 min. 9

10 10.- Transferir la mezcla al tubo de membrana (tubo verde) previamente montado sobre tubo recolector (2ml). Centrifugar 12,500 rpm, 4 C durante 1 min Se desecha el sobrenadante y colocar nuevamente el filtro en el mismo tubo recolector Agregar 400 ul de Buffer PW1. Centrifugar 12,500 rpm, 4 C durante 1 min. Desechar el sobrenadante Colocar el filtro. Agregar 700 ul de Buffer Pw2. Centrifugar 12,500 rpm, 4 C durante 1 min. Desechar el sobrenadante Colocar el filtro. Agregar 200 ul de Buffer Pw2. Centrifugar 12,500 rpm, 4 C durante 2 min Colocar el filtro en un nuevo tubo colector Al eluido: 17.-Agregar 50 ul de Buffer PE (previamente calentado) Incubar (baño maría) a 65 C durante 5 min. Centrifugar durante 1 min Repetir pasos 17 y 18 agregando otros 50 ul de Buffer PE(65 C) y eluir en el mismo tubo. Al final se juntan las 10 muestras con su repetición. Obteniendo un volumen total de 750 ul. SEPARACION DEL ADN EN GEL DE AGAROSA: Preparación del gel: 1.8 g de Agarosa ml de Buffer TAE (1X): 10 ml Buffer TAE (25X) ml Agua MilliQ Calentar la mezcla por pausas de 30 seg. hasta quedar clara y sin grumos. Preparación de Buffer para correr el gel: Para 800 ml de Buffer: 32 ml Buffer TAE (1X) ml Agua MilliQ. Preparación de Buffer TAE (50X) para 500ml: 1. Preparar 100 ml de EDTA 0.5 M, ph8.0. Tomar solo 50 ml 2. Pesar 121 g Tris- Base 3. Tomar 28.5 ml Ac. Acético. 10

11 4. Aforar a 500 ml con Agua MilliQ. Para cargar las muestras al gel de agarosa se utilizó: 3 ul Orange G Buffer de carga 1 ul SYBER Gold 2 ul ADN Diluciones: 1uL, 2uL, 3uL - Fago λ digerido con Hind III Cargar al gel: Carril 1 Carril 2 Carril 3 Carril 4 Carril 5 Carril 6 Carril 7 Carril 8 Carril 9 Carril 10 Carril 11 Carril 12 Carril 13 Fago λ (100 ng/ul) colocar 1uL Fago λ (200 ng/ul) colocar 2uL Fago λ (300 ng/ul) colocar 3uL M1: 2uL DNA + 4 ul Buffer de carga M2: 2uL DNA + 4 ul Buffer de carga M3: 2uL DNA + 4 ul Buffer de carga M4: 2uL DNA + 4 ul Buffer de carga M5: 2uL DNA + 4 ul Buffer de carga M6: 2uL DNA + 4 ul Buffer de carga M7: 2uL DNA + 4 ul Buffer de carga M8: 2uL DNA + 4 ul Buffer de carga M9: 2uL DNA + 4 ul Buffer de carga M10: 2uL DNA + 4 ul Buffer de carga EVALUACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN Y CALIDAD DEL ADN GENÓMICO OBTENIDO El ADN, el ARN, los oligonucleótidos e incluso los mononucleótidos pueden cuantificarse directamente en soluciones acuosas, en forma diluida o sin diluir, midiendo la absorbancia A (o densidad óptica, DO) de luz ultravioleta (también puede hacerse en el intervalo visible). Si la muestra es pura, es decir, no contiene cantidades significativas de contaminantes como proteínas, fenol o agarosa, la medición espectrofotométrica de la irradiación ultravioleta absorbida por las bases es sencilla y exacta. En este método, los tampones acuosos con escasa concentración iónica (por ejemplo, tampón TE) resultan idóneos. La concentración de ácidos nucleicos suele determinarse midiendo a 260 nm y comparando con un blanco. La interferencia de contaminantes puede determinarse calculando un «coeficiente». Dado que las proteínas absorben a 280 nm, se emplea el cociente A260/A280 para calcular la pureza de los ácidos nucleicos. Los cocientes respectivos del ADN y el ARN puros son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Una absorción a 230 nm significa que la muestra está contaminada con hidratos de carbono, péptidos, fenoles, compuestos aromáticos u otras sustancias. El cociente A260/A230 de las muestras puras es de 2,2 aproximadamente. Cuando la cantidad disponible de ácidos nucleicos es escasa, puede emplearse el método de la placa de agarosa con bromuro de etidio. Permite calcular la cantidad de ácidos nucleicos a partir de la intensidad de la fluorescencia emitida por el bromuro de etidio irradiado con luz UV, comparándola con unos patrones de concentración. Otros compuestos más modernos 11

12 para cuantificar el ADN, diferentes del Bromuro de Etidio, pueden ser el Orange G con SYBR Gold, SYBR Green, Rojo escarlata, entre varios otros. Los ácidos nucleicos absorben la luz en el intervalo ultravioleta, a longitudes de onda comprendidas entre los 210 y los 300 nm. La absorbancia máxima de las soluciones de ADN corresponde a 260 nm, el coeficiente de los valores obtenidos a 260 nm y a 280 nm (A260/A280) proporciona una estimación del grado de pureza de los ácidos nucleicos. Los coeficientes A260 del ADN son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Con un paso de luz de 10 mm y una longitud de onda de 260 nm, una absorbancia A = 1 corresponde aproximadamente a 50 µg/ml de ADN. Para efectos de este curso, se empleará el SYBR Gold, con el cual cuantificaremos la concentración y calidad del ADN genómico obtenido con el Kit comercial NucleoSpin Plant II. Una vez cargados al gel y corrida la muestra a 120 voltios de carga, se evaluará la concentración de los ácidos nucleicos en el fotodocumentador. ANÁLISIS DE BANDAS EN FOTODOCUMENTADOR El análisis de las bandas obtenidas se realizará en la computadora empleando el Software ImageLab del equipo Fotodocumentador XR+ de Bio-Rad. Se colocará el gel en la charola del equipo, se realizará una toma de foto a diferentes tiempos de exposición del gel de agarosa, para evaluar la concentración del ADN obtenido y su calidad respectiva. La concentración será conocida empleando como referencia las bandas que genere el producto separado en el gel proveniente de la digestión con el fago lambda. Finalmente, el gel se deposita en basura especial y se realiza la limpieza de los materiales y equipos empleados. BIBLIOGRAFIA - Murray, M.G. y Thompson, W.F. (1980). Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research 8, Poms, R.E., Glössl, J. y Foissy, H. (2001). Increased sensitivity for detection of specific target DNA in milk by concentration in milk fat. European Food Research Technology 213, Zimmermann, A., Lüthy, J. y Pauli, U. (1998). Quantitative and qualitative evaluation of nine different extraction methods for nucleic acids on soya bean food samples. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A 207,