CURSO DE CULTIVOS CELULARES

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1 1 CURSO DE CULTIVOS CELULARES Coordinadores: Milagros Ramos Gómez Alberto Martínez-Serrano Universidad Autónoma de Madrid Junio Docentes (según calendario): Alberto Martínez Serrano Ignacio Tardieu Juan Rebelles Carmen Punzón Angeles Sánchez José Antonio López Elena Rodríguez Isabel Liste Elena Holguín Miguel Remacha Milagros Ramos

2 2 Contenido: Introducción y normas de trabajo. Cultivo de células de mamíferos: aspectos básicos Funcionamiento y uso de aparatos generales de laboratorio de cultivos Lavado de material, esterilización y preparación de medios de cultivos celulares Microbiología: Medios de cultivo, siembra y observación de microorganismos Virología: Titulación de virus y transducción Células de insectos: Generación de proteínas recombinantes mediante el uso de baculovirus Células de mamíferos: Descongelación de líneas establecidas Cultivos primarios de linfocitos de ratón Células ES Cultivos primarios neuronas de cerebro de ratón Células de plantas Seguridad Biológica

3 3 INTRODUCCIÓN Y NORMAS DE TRABAJO. Alberto Martínez Serrano Normas de trabajo Laboratorio de cultivos Es de extrema importancia lavarse las manos antes, después, y frecuentemente durante el trabajo en cultivos, para evitar contaminaciones en los experimentos, y contaminación del usuario con material biológico, y posible diseminación de éste. Se debe trabajar siempre con material estéril (pipetas, puntas, etc). El material estéril sólo puede abrirse, lógicamente, dentro de la campana de cultivos, o a la llama del mechero. Por defecto, todo aquello de lo que no se esté seguro al 100% de su esterilidad ha de ser considerado como no estéril. Asumir que algo está estéril cuando no lo está supone, sin ninguna duda, contaminar (esto es, destruir) el experimento. Se requiere de todos los asistentes al curso un elevado grado de responsabilidad, para no arruinar el trabajo del grupo. En caso de contaminar algo involuntariamente (o incluso sospechar que ésto ha pasado), se debe poner inmediatamente en conocimiento del profesor, para evitar males mayores. Marcar siempre cualquier tubo o recipiente que contenga algo útil, de la forma más segura posible, por ejemplo tanto en la tapa como en el tubo. Marcar siempre las placas de cultivos en la tapa y en un lateral de la base, de manera distinta para cada placa, para evitar intercambiar tapas. Si se ha de pipetear repetidamente un stock de una solución (p.ej. botella con medio de cultivo) es conveniente sacar de una vez la alícuota que se vaya a usar a una botella o tubo de menor volumen, para disminuir el número de veces que se introducen pipetas en la botella con el stock, y el consiguiente riesgo de contaminación. Si faltasen cabinas de cultivo para llevar a cabo todo el trabajo necesario, algunas partes de los experimentos se harán en la mesa de laboratorio, previamente descontaminada con hipoclorito, y trabajando en el ambiente estéril proporcionado por la llama del mechero. Seguridad biológica Es obligatorio lavarse las manos después del trabajo de laboratorio, para evitar contaminación del usuario con material biológico, y la potencial dispersión de éste. Todo el material biológico, p. ej. células o material que haya estado en contacto con éstas, ha de ser inactivado con hipoclorito antes de tirarlo. Tanto el plástico desechable como el vidrio que haya estado en contacto con material biológico ha de ser inactivado antes de tirarlo, o disponerlo para su lavado y esterilización. Los residuos acumulados en vasos de precipitados han de ser inactivados con hipoclorito antes de tirarlos, y los vasos se dejarán con un poco de hipoclorito hasta su próximo uso. La mesa de trabajo y las campanas se descontaminarán antes y después de trabajar con material biológico. Cualquier material biológico derramado ha de ser descontaminado inmediatamente con hipoclorito, antes de proceder a secar y lavar con jabón la superficie manchada.

4 4 CULTIVO DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS. ASPECTOS BÁSICOS. Plásticos, densidades y medio de cultivo SUPERFICIES DE CULTIVO (*) usadas en este curso Placas multipocillo (multiwell-plates) Nombre común Pocillos Diámetro Area/pocillo Area /placa P mm 0.5 cm 2 48 cm 2 P mm 1 cm 2 48 cm 2 P mm 2 cm 2 48 cm 2 P mm 4 cm 2 48 cm 2 P6 * 6 35 mm 10 cm 2 60 cm 2 placas tipo Petri-dish Nombre común Pocillos Diámetro Area /placa P mm 10 cm 2 P mm 28 cm 2 P100 * mm 78 cm 2 Botellas (flasks) Nombre común Pocillos Diámetro Area/botella T cm 2 T cm 2 DENSIDADES DE CÉLULAS (en millones) Y VOLÚMENES (en ml) millones de células volumen (ml) Nombre común Siembra Confluencia Medio Lavados Trip/EDTA P P P P P6 * millones de células volumen (ml) placas tipo Petri-dish Nombre común Siembra Confluencia Medio Lavados Trip/EDTA P P P100 * millones de células volumen (ml) Botellas (flasks) Nombre común Siembra Confluencia Medio Lavados Trip/EDTA T T

5 5 MEDIO DE CULTIVO (DMEM COMPLETO): DMEM suplementado con suero de ternera al 10%, glutamina 2mM, antibióticos (100 unidades/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina) y aa no esenciales. INACTIVACIÓN de proteínas del complemento del suero ("des-complementación"): Descongelar una botella de suero a 37 o C, aumentar entonces la temperatura del baño (con la botella dentro) hasta 56 o C, incubar a esta temperatura 45min, enfriar la botella en baño de hielo y agua, filtrar (opcional, aunque no recomendable), distribuir en alícuotas (25-50 ml) y guardar a -20 o C. Para preparar medio de cultivo, usar una alícuota recién descongelada. TEMPERATURA de los medios: Los medios y soluciones que entren en contacto con las células han de estar preferiblemente a 37 o C (o, como muy bajo, temperatura ambiente), para no alterar el metabolismo celular. Siempre desinfectar con etanol las botellas que pasen por el baño antes de trabajar con ellas. ALMACENAMIENTO de distintos componentes de medios de cultivo, y otros medios/reactivos. A 4 o C, stock DMEM, PBS, PBS/EDTA, DMEM completo, suero inactivado con DMSO A -20 o C, suero inactivado, tripsina/edta, stocks de tripsina, glutamina, antibióticos, aa. Congelación y siembra de células MEDIO DE CONGELACIÓN. Dependiendo de la disponibilidad de suero, las células se pueden congelar en los siguientes medios: DMEM completo, DMEM con 20% suero, o en 100% suero, en cualquier caso suplementados con 10% di-metil-sulfóxido (DMSO), como agente crioprotector. El DMSO es bastante tóxico a esta concentración, habiendo células que lo soportan peor que otras. En cualquier caso, hay que minimizar el tiempo que las células pasan a temperatura ambiente en presencia de DMSO. Por ello, es conveniente enfriar las células a 4 o C cuando se preparan para congelar. Al descongelar, diluir las células (que están en medio de congelación conteniendo DMSO) con DMEM completo, centrifugar y resuspender en DMEM completo cuanto antes. GRADIENTES DE TEMPERATURA para congelación y descongelación. La congelación de células ha de hacerse partiendo de una suspensión de células en suero 10% DMSO, a una densidad tal que, cuando vayan a ser sembradas adquieran inmediatamente la densidad adecuada para su óptimo crecimiento. Una cifra bastante estándar es una densidad de 1 millón de células / ml, congeladas en alícuotas de 1ml. Tras preparar esta suspensión y separar en alícuotas, las células se enfrían a 4 o C y posteriormente se congelan a -20 o C, 24h, -70 o C, 24h y N 2 l (-170 o C), indefinidamente. Si se dispone de un recipiente aislante, que permite una bajada de temperatura gradual, las células se pueden poner directamente a -70 o C (24h) y después transferir a N 2 l. El almacenamiento en N 2 l es para guardar células indefinidamente. Si se requiere sólo conservar las células unas pocas semanas (1-2 meses), se pueden guardar a -70 o C. Para descongelar células, pasar las células de N 2 l ó -70 o C a un recipiente con hielo seco (-70 o C). Una vez que todo el material y medios estén preparados, descongelar las células transfiriéndolas del hielo seco a un baño a 37 o C, agitando el criotubo en el agua con la mano hasta su completa descongelación. Rociar etanol abundantemente, transferir las células a un tubo con 10 ml medio completo, centrifugar 5 min a 700 rpm (centrífuga de mesa, temperatura ambiente [room temp., RT]), descartar sobrenadante, resuspender células en el

6 6 volumen de medio adecuado y transferir a su placa de cultivo a la densidad adecuada (ver Tabla en página 4-5). Colocar placa en incubador con 95% humedad y 5% CO 2. MEDIDAS ESPECIALES DE ESTERILIDAD al congelar y descongelar células. La manipulación de células durante la congelación y descongelación es un proceso que conlleva riesgo de contaminar las células. Habrá de prestarse especial atención a no tocar las roscas de los tapones de los criotubos, y tras descongelar las células en el baño, es esencial esterilizar el exterior del tubo con abundante etanol, antes de abrirlo y manipularlo. Pases de células CAMBIOS DE MEDIO. MANTENIMIENTO. La mayoría de líneas celulares doblan en cultivo en 24-48h, cuando las condiciones de crecimiento son adecuadas. De esta manera, el número de células se multiplica en cualquier cultivo en unos pocos días, ocupando toda la superficie de la placa (en el caso de células adherentes), y empobreciendo el medio al consumirse los nutrientes y acumularse productos de deshecho en éste. Es por ésto que si se desea mantener una línea en cultivo por más de unos pocos días, de manera periódica hay que reponer nutrientes y eliminar productos de degradación. Como normal general, cuando no se disminuye la densidad de células, se cambian 2/3 del medio cada 2-3 días; al dejar 1/3 del medio antiguo, si bien se arrastran productos de deshecho, también se mantienen sustancias producidas por las células y secretadas al medio que son positivas para su crecimiento (en cierta manera, las células no se sienten solas en el cultivo, como lo harían con un medio completamente nuevo, lo que induciría una parada o retraso en su crecimiento). Los cambios de medio pueden hacerse con una frecuencia ligeramente flexible, aumentando ésta al aumentar la densidad de células. Es fácil observar cómo el ph del medio tiende a acidificarse más rápidamente (se torna naranja-amarillento) cuando la densidad es elevada, al aumentar los productos de deshecho liberados. DILUCIÓN DE LA DENSIDAD (PASE) DE CÉLULAS La mayoría de líneas celulares que crecen adheridas a plástico sufren una parada en su crecimiento a densidades elevadas, impuesta por el proceso de inhibición por contacto. Dependiendo de la morfología y propiedades de cada línea, las células paran de dividirse, bien cuando ocupan toda la superficie de la placa, o bien cuando todas están en contacto con otras (sin necesidad de cubrir completamente el plástico). A este momento, situación (o densidad) se le denomina confluencia del cultivo. Nunca se debe dejar un cultivo en confluencia por periodos prolongados, debiendo reducirse la densidad de células en ése momento, para permitir su crecimiento de forma continuada. Si se quiere mantener la línea dividiéndose en una superficie igual a la usada hasta entonces, se descartarán parte de las células; si lo que se pretende es expandir las células, para aumentar su número total, se distribuirán todas las células a un número mayor de placas, sin tirar ninguna célula. En cualquiera de los dos casos, la densidad de células se reduce en un porcentaje que varía para cada línea, y que suele ser desde un 80% a un 90% (pase 1/5 o 1/10, respectivamente). (Diluciones excesivas o periodos prolongados en confluencia pueden alterar seriamente las propiedades de la línea celular, aspecto que se discutirá en más detalle en clase) Cuando se disminuye un 90% la densidad de células, se dice que las células se pasan 1/10 (la densidad de reduce a 1/10 de la inicial). Si es un 80%, el pase es de 1/5.

7 7 Como ejemplo, si queremos pasar unas células 1/5 manteniendo el cultivo en una placa de las mismas dimensiones, simplemente hay que descartar el 80% de las células. Si se quiere conservar todas las células, para expandirlas, las células se habrán de distribuir en 5 placas de la misma superficie que la original. En cualquiera de los dos casos, la densidad se reduce a 1/5, las células sufren un pase 1/5, etc. Si las células se dividen cada 24h, se puede predecir que (tras h de parada del crecimiento tras su siembra), al día 2 habrá el doble de células que las sembradas, al día 3, cuatro veces, y así sucesivamente. Como ejemplo, tras un pase 1/10, y asumiendo que las células no se dividen durante las primeras 24h, día 0 densidad= 100%, por lo que las células se pasan dejando densidad 10%. día 1 densidad= 10% día 2 densidad= 20% día 3 densidad= 40% (cambio de medio) día 4 densidad= 80% día 5, las células necesitarán ser pasadas de nuevo TRIPSINIZACIÓN (y otros métodos de pasar células). Para la mayoría de líneas celulares que crecen adheridas a un substrato, la forma más conveniente de levantarlas en una suspensión celular (para poder manejarlas fácilmente en suspensión), es mediante el uso de tripsina (proteasa), que digiere aquéllas proteínas celulares implicadas en la adhesión celular al soporte. [En caso que sea importante preservar proteínas de membrana, se suele desaconsejar este procedimiento, habiendo de recurrirse a procedimientos mecánicos, como el pipeteo repetido, o el barrido/arañado de la superficie de cultivo.] Para que la tripsinización sea efectiva, y para contribuir a debilitar la adherencia de las células al soporte, aparte de tripsina, hay que asegurarse de eliminar el suero del medio (que contiene inhibidor de tripsina), así como cationes divalentes presentes en el medio y que median la interacción célula-sustrato (mediante el uso de EDTA). Para ello, el procedimiento estándar de tripsinización es el siguiente (p. ej. para una placa P100) (para otros tamaños de placa ver la tabla anterior): Materiales: * PBS conteniendo 0.004% EDTA (PBS/EDTA) (Mezclar botella 80ml EDTA al 0.02% con 320ml PBS) * Tripsina 0.05% en EDTA (Trip/EDTA) (Mezclar botella 20ml tripsina 0.25% con 80ml EDTA 0.02%) Procedimiento: - retirar el medio de cultivo - lavar 1x (una vez) con PBS/EDTA. - incubar con 1-2 ml solución de Trip / EDTA, 5 min, RT ó 37 o C (si es posible), hasta que las células se vean redondas bajo el microscopio, señal de que su adherencia está muy desminuida. - diluir la tripsina / EDTA en la placa con 8-9 ml de medio completo (con suero); esto detiene la tripsinación (por el aporte de proteínas del suero, el inhibidor de tripsina presente en el suero, y el aporte de Calcio y Magnesio con el medio y el suero). Además., en el volumen final de 10 ml es fácil pipetear la suspensión para acabar de levantar la células (pipetear arriba y abajo, esparciendo la suspensión por toda la superficie de la placa, unas 5-10 veces, con la energía suficiente (y no más) como para despegar la células). Evitar hacer vacío al pipetear, así como hacer demasiadas burbujas, ya que ambas cosas matan muchas células). - si la tripsinazción ha sido efectiva, todas las células de la placa se encontrarán en los 10ml de suspensión, como células aisladas, no como agregados. Transferir este

8 8 volumen a un tubo estéril, y centrifugar 5min a 700rpm. Descartar sobrenadante (este paso es necesario para eliminar tripsina, y sobre todo el EDTA, ya que si no, no se adherirán de nuevo las células al sembrarlas) - resuspender el sedimento celular en un volumen adecuado de medio de cultivo (dependiendo de si se van a descartar células o no, y del pase elegido) y sembrar en la superficie adecuada. Recuento de células Para mantener unas condiciones de cultivo reproducibles entre pases y experimentos, es recomendable sembrar las células a la misma densidad (ver tabla arriba), lo cual supone la necesidad de conocer el número de células en la suspensión preparada (ver punto anterior). La manera más común de determinar el número de células es contando éstas en un hemocitómetro (ver Figura 1); como la tripsinización y pipeteo de las células siempre conlleva algo de muerte celular, es conveniente teñir de alguna manera las células de forma que se puedan contar células vivas y muertas, y el total. Para sembrar de nuevo las células, habrá que contar, por supuesto, con el número de células vivas. La distinción entre células vivas y muertas se lleva a cabo utilizando colorantes vitales, entre ellos, el más usado es Azul de Tripano (Trypan Blue), cuyo stock está a una concentración del 0.4% en tampón fisiológico (pej. PBS) Continuando con el ejemplo de la tripsinización anterior, tomar 20 µl de células (que al final se van a descartar, o sea que desde este momento no se necesita esterilidad), y mezclar en un tubo eppendorf con 20 µl de solución de trypan blue. Pipetear 10 µl de esta nueva suspensión en cada lado del hemocitómetro. (ver Figura 1). Bajo el microscopio, se observará que el hemocitómetro esta equipado con una cuadrícula de 9 cuadrados grandes cada uno subdividido en otros 16 más pequeños. Debido al diseño de la cámara, el volumen de medio sobre uno de los cuadrados grandes es 0.1 µl. El recuento se lleva a cabo sobre dos cuadrados grandes en cada lado de la cámara, de manera que se tengan cuatro determinaciones del número de células en cuadrado grande, y cuya media será el número de células en 0.1 µl de la suspensión de células en trypan blue. (Para reducir el error de recuento se habrá de contar tantos cuadrados como sean necesarios para al menos acumular un mínimo de 100 células en total; por tanto, preparar una suspensión que resulte en unas 50 células por cuadrado grande es lo más conveniente.). Teniendo en cuenta las diluciones realizadas, es inmediato llegar a saber el número total de células en los 10 ml de suspensión preparados en el apartado anterior. Una manera muy intuitiva de hacer estos cálculos es como sigue: por ejemplo, si se obtiene 50 células por cuadrado grande, habrá 50 células por cada 0.1 µl en el eppendorf, o sea 50x 400= células en el eppendorf, que proceden de 20 µl de la suspensión, o sea x (10.000/20) = 10 x 10 6 células en los 10 ml APARATOS GENERALES DE LABORATORIO DE CULTIVOS Ignacio Tardieu de Chorro

9 9 Qué es y de qué consta un laboratorio de cultivos celulares? Un laboratorio de cultivos celulares debe contar con una infraestructura básica de áreas independientes para: Preparación de Medios de Cultivo. Esterilización de Medios y Reactivos. Lavado, esterilización y preparación de materiales. Aparataje de un Laboratorio de Cultivos. Funcionamiento y uso. Y trabajo con cultivos celulares. Preparación de Medios y Reactivos. En este caso utilizaremos como ejemplo el sistema de trabajo que se realiza en el CBMSO. En este ejemplo, existen una serie de Técnicos dedicados enteramente a la preparación de Medios y Reactivos para uso común de los usuarios del laboratorio de cultivos. Estos Técnicos se encargan enteramente de los stocks de medios y demás reactivos para un funcionamiento más productivo de los trabajos realizados con los diferentes tipos de cultivos celulares. Un buen apoyo Técnico por parte de estas personas ayuda a una mayor comodidad y un mayor rendimiento, puesto que los usuarios no tienen que preocuparse de la preparación de Medios y Reactivos. Esterilización de Medios, Reactivos. Desde el punto de vista de los sistemas de esterilización se pueden citar los siguientes: Calor Húmedo: Mediante el empleo de autoclaves los cuales proporcionan una temperatura de 121 o C y una presión de 15 lb. Utilizados para la esterilización de soluciones cuyos componentes no se degradan por éste método, material plástico y de vidrio y equipos de filtración. Calor Seco: lo constituye el uso de hornos a temperatura de 200 o C por espacio de 3 horas. Es empleado para la esterilización de material de vidrio particularmente. Filtración: A través del uso de equipos con membrana de nitrocelulosa o acetato de celulosa con poro de 0.22 ó 0.1 u de diámetro, mediante la aplicación de presión positiva o negativa. Por éste sistema se esterilizan la mayor parte de los medios de cultivo, suero, solución de antibióticoantimicótico y suplementos Equipos de filtración. En la actualidad se dispone de unidades de filtración estéril (por ej. Millipore, Gelman,...), muy recomendables para el trabajo rutinario. Sin embargo, su elevado

10 10 coste por unidad hace que en muchos casos aún se empleen unidades reutilizables como pueden ser las unidades Swimmex de Millipore. Estos equipos de filtración constan o bien de una fuente de vacio conectada a un kitasato dotado de una unidad de filtración esterilizada por autoclavado, o bien de una bomba peristáltica que fuerza el flujo de solución a través de una unidad de filtración hermética (por ejemplo las ya citadas Swimmex de la empresa Millipore). En ambos casos la esterilización se produce al atravesar la solución un filtro de poro 0.22 um. Autoclave. Un autoclave es un instrumento que permite la esterilización por calor tanto de sólidos como de líquidos. La esterilización se realiza habitualmente a 121 ºC, 1 atmósfera de sobre presión durante un tiempo superior a 20 min. Un autoclave de uso normal en el laboratorio de cultivo de tejidos suele disponer de temporizador y regulador de presión, y en algunos casos de un ciclo de secado para permitir secar el material sólido (material de vidrio, instrumentos quirúrgicos, tubos,...). Lavado, esterilización y preparación de materiales. Los Materiales más comunes en un laboratorio de cultivos son: Vidrio: Prácticamente todos los Medios se preparan y esterilizan para su almacenamiento y clasificación, en botellas de vidrio. También utilizaremos diferentes tipos de pipetas de cristal, probetas, vasos y matraces para el trabajo rutinario del Laboratorio. Plástico: Todo el trabajo que se desarrolla en un Laboratorio de cultivos se hace en plástico. Todos los cultivos se hacen en diferentes modelos de placas de plástico y en botellas.

11 11 MODELOS DE DIFERENTES PLACAS Y BOTELLAS PARA CULTIVOS CELULARES Contamos también con una gran variedad de tubos de ensayo para el desarrollo de una forma efectiva de diferentes técnicas y rutinas dentro del laboratorio. Cada tipo de material se utiliza para diferentes funciones, así como todos los materiales de cristal se utilizaran para la preparación y almacenamiento de medios y reactivos, todo el plástico nos servirá para la preparación de alícuotas de los diferentes reactivos y con esto conseguiremos realizar diferentes stocks para una rápida preparación de medios y reactivos utilizados en las rutinas de un Laboratorio.

12 12 El lavado, preparación y esterilización de dicho material será hecho en los cuartos destinados a dicho fin. Aparataje de un Laboratorio de Cultivos. Funcionamiento y uso. Los aparatos más comunes dentro de un Laboratorio de cultivos son: Cabinas de Flujo Su función es la de mantener un área libre de partículas, especialmente de posibles contaminantes (bacterias, levaduras,...) que puedan acceder al cultivo. Esto se consigue mediante un dispositivo mecánico que fuerza el paso del aire a través de un filtro de gran superficie (filtro HEPA) situado o bien en el techo (flujo vertical) o en la pared frontal (flujo horizontal) y que con una eficiencia del % retiene las partículas por debajo de un cierto calibre que es en general de 0.2 um. En la Figura 2.1 se representa una sección de filtro HEPA. El flujo del aire es laminar, sin turbulencias en las que puedan quedar retenidas partículas contaminantes. El flujo laminar se asegura tanto por la gran superficie del filtro HEPA como por la velocidad constante del aire, como por la ausencia de fuentes intensas de calor (mecheros bunsen) en el interior de las cabinas, generadores de intensas corrientes de convección. Tal como ya se ha indicado, las cabinas de flujo laminar pueden ser de dos tipos: flujo vertical y flujo horizontal, dependiendo de la posición del filtro HEPA y por ello de la dirección del flujo laminar (ver figura 2.2). Los diferentes tipos de cabinas de flujo laminar se diseñan con diferentes propósitos: a. Protección personal: protección del personal de los posibles agentes dañinos del interior de la cabina. b. Protección del producto, experimento o cultivo que se encuentra en el interior de la cabina de los contaminantes exteriores o de la contaminación cruzada con otros productos o cultivos situados en la misma cabina. c. Protección medioambiental: evitar la salida al medio ambiente de productos o agentes contaminantes. Las cabinas de flujo laminar horizontal son muy adecuadas para una buena protección del producto, pero no son adecuadas para el trabajo con materiales peligrosos o con algún tipo de riesgo pues el operador queda completamente expuesto. En las cabinas de flujo vertical, más sofisticadas, se segura una buena protección del producto, y, dependiendo de su diseño se puede asegurar una protección total del operador. Son por ello más adecuadas para el trabajo con agentes

13 13 peligrosos. Dependiendo de la importancia que se le conceda a cada uno de estos factores en el diseño de la cabina se trata de cabinas de clase I, II o III. 1. Cabina de clase I. Se trata de una unidad de contención parcial adecuada para la manipulación de agentes de bajo riesgo, donde existe una necesidad de protección del operario y del medio pero no del producto. Este es el tipo de cabinas normalmente denominadas "de gases", y no son de uso común en el laboratorio de cultivo de tejidos. Figure de "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories", 3rd edit, CDC (Center for Disease Control) / NIH (National Institutes of Health), p Cabina de clase II. Este tipo de cabinas protegen el producto, al personal y al medio ambiente. En general las cabinas de clase II se describen como un equipo de protección con un panel frontal de acceso y que mantienen un flujo laminar estable en el interior, con una filtración HEPA para el aire recircularizado en cada ciclo y una filtración HEPA del aire exhausto (de salida al medio). Los sucesivos diseños que se han realizado para cubrir necesidades diferentes permiten clasificar asimismo las cabinas de tipo II en tres subclases : a. Tipo A. En este tipo (figura 2.3.B) el 30 % del aire es eliminado en cada ciclo y el 70 % es recircularizado. El escape al medio de los agentes potencialmente peligrosos se previene mediante una corriente de aire entrante en una rejilla frontal. b. Tipo B. Se trata de una cabina de flujo laminar para uso general (figura 2.3.C), y en ella se recirculariza sólo el 30 % del aire en cada ciclo, eliminándose el 70 % del aire restante. c. Tipo 100 % exhausto. Se trata de una cabina en la que el 100 % del aire de cada ciclo es eliminado hacia dispositivos que puedan retener los posibles agentes peligrosos (figura 2.3.D). Este tipo de cabinas se emplean fundamentalmente en laboratorios de toxicología en los que se requieren áreas de contención limpias y eliminación del aire posiblemente contaminado. Las diferencias entre estos tres subtipos se refieren especialmente a la protección del usuario, superior en el caso del tipo A, y a la eliminación de la cabina de posibles contaminaciones de tipo aerosol, no retenibles por el filtro HEPA. La tipo A, que es la más adecuada para el trabajo con agentes patógenos particulados (filtrables) es la menos adecuada para el trabajo con vapores o aerosoles peligrosos. Asimismo se ha de tener en cuenta que el funcionamiento correcto para la protección del producto y del personal depende de una correcta calibración del instrumento, especialmente de las velocidades respectivas de entrada de aire en el sistema y de flujo vertical. El punto de calibración o ajuste es

14 14 dependiente del instrumento y debe ser realizado por personal especializado cada 6 a 9 meses de funcionamiento para asegurar la protección al usuario. Figure de "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories", 3rd edit, CDC (Center for Disease Control) / NIH (National Institutes of Health), p Cabina de clase III. Se trata de una cabina de seguridad, estanca, para el trabajo con agentes biológicos de alto riesgo. Permite mantener al agente patógeno en un ambiente completamente estanco. Permiten controlar tanto los contaminantes particulados como aerosoles y contaminantes gaseosos mediante sistemas de filtración y disolución de éstos. Figure de "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories", 3rd edit, CDC (Center for Disease Control) / NIH (National Institutes of Health), p Incubadores de CO 2. El mantenimiento de la temperatura en una atmósfera con una tensión controlada de CO2 y adicionalmente de humedad elevada es el objetivo del incubador de CO2. Un incubador moderno dispone de : 1. dispositivos de control de temperatura, con un termostato de seguridad que desconecta la función en caso de anomalía. La estabilidad de la temperatura es una característica esencial del incubador, y por ello suelen estar equipados con camisas de agua ('water jacketed') que incrementan notablemente la inercia térmica. Como consecuencia la estabilización de un incubador puede tardar varios días. 2. dispositivo de inyección de una mezcla de aire y CO2, en la proporción deseada, entre el 4 y el 7 %. El CO2 de elevada pureza se suministra en botellas presurizadas, y se mezcla en el dispositivo de inyección. El control de la mezcla se realiza fundamentalmente mediante un dispositivo IRGA ("infra-red gas analyzer"). En incubadores modernos este dispositivo analiza constantemente el porcentaje de CO2 presente en la cámara de incubación, y realiza las correcciones necesarias. Un problema usual del dispositivo de medida de CO2 es la pérdida de calibración que se produce periódicamente. para evitarlo algunos fabricantes dotan al sistema de un mecanismo de autocalibración periódica (basado en la toma de una muestra de aire exterior que se considera tiene un valor x de CO2). 3. dispositivo de control de la humedad ambiente. Para mantener el cultivo se requiere una humedad ambiente elevada, a fin de reducir la evaporación de

15 15 agua del medio de cultivo. En los incubadores menos sofisticados esto se consigue mediante bandejas de agua en el fondo del incubador. Este recurso es peligroso pues son una fuente importante de contaminaciones al convertirse a los pocos días en caldos de cultivo. En los instrumentos más modernos se dispone de dispositivos que controlan la humedad atmosférica, inyectando agua estéril y filtrada. 4. dispositivo de recircularización de aire. Es importante una recirculación del aire en el interior del incubador, a fin de homogeneizar la temperatura en su interior. Si además en el circuito de circulación de aire se intercala un filtro HEPA se consiguen eliminar las posibles partículas contaminantes, y se asegura la esterilidad del ambiente. Las condiciones del cultivo: temperatura, humedad atmosférica y niveles de CO2 son característicos de cada línea celular. El nivel de CO2 se establece para mantener el equilibrio carbonato-bicarbonato en el medio de cultivo, habitualmente al 5%. Puedes encontrar información de actualidad en los sitios Web de las empresas que fabrican estos incubadores: Forma, Revco, Jouan,... Microscopios. El control morfológico del cultivo se realiza mediante el uso de un microscopio. El hecho de que las muestras a observar se encuentren en recipientes de un cierto grosor (más de 3 cm. en el caso de frascos de Roux de 250 ml) hace que un microscopio convencional no sea adecuado (por su pequeña distancia frontal), por lo que se han desarrollado microscopios de diseño original, en los cuales la fuente de iluminación y los objetivos se encuentran invertidos respecto a la platina de un microscopio óptico convencional (figura 2.5). La segunda característica que condiciona el instrumento óptico es su ausencia de color, es decir se trata de muestras vivas y con poco contraste. El microscopio se equipa con el dispositivo de contraste de fases (diafragmas anulares a nivel del condensador y placa de fases entre las lentes del objetivo). De esta forma el contraste de la imagen aumenta y la calidad obtenida es muy superior. Es de gran utilidad disponer asimismo de un dispositivo de captación de imágenes, fotográfico o de video acoplado al microscopio a fin de documentar el estado de los cultivos. Congeladores e instalación de criogenia (depósito de N2 líquido)

16 16 Es recomendable que los congeladores y la instalación de criogenia estén en recintos separados a la unidad de cultivo propiamente dicha pues los ventiladores y compresores son una fuente importante de turbulencias y suciedad en el laboratorio. Es preciso el almacenamiento de soluciones y células a diferentes temperaturas, para lo que se requiere: 1. neveras (4 ºC) para el almacenamiento de medios, PBS, congeladores de -20 ºC para el almacenamiento de suero, aditivos (glutamina, antibióticos) y soluciones enzimáticas (tripsina, colagenasa,...). 3. congeladores de -80 ºC para el almacenamiento a largo plazo de los aditivos del medio (suero, glutamina, antibióticos,...) y de sustancias especialmente sensibles (factores de crecimiento, mitogenos, inductores,...). 4. unidad de almacenamiento en nitrógeno líquido (-196 ºC), para el almacenamiento de las líneas celulares. Otros instrumentos : centrífugas, contador de células electrónico ("cell counter"), equipo de purificación de agua, balanzas, ph-metro, pipeteadores... Además del equipo antes citado el laboratorio de cultivo de tejidos deberá estar equipado con otros instrumentos que, o bien no son imprescindibles para un laboratorio de tamaño pequeño (por ej. el contador electrónico de células), o bien son instrumentos que forman parte de un laboratorio de uso más general (centrífugas, equipo de purificación de agua, balanzas, ph-metro, pipeteadores...). Centrífugas. En el laboratorio de cultivo de tejidos es necesario disponer de una centrífuga refrigerada, preferentemente con posibilidades de usar en ella desde tubos de pequeño volumen (1 a 2 ml) a botellas de gran capacidad (250 a 500 ml). Normalmente, para la mayor parte de las aplicaciones bastará con un instrumento que desarrolle hasta 2000 xg.

17 17 La centrífuga se ha de instalar dentro de lo posible alejada de las cabinas de flujo laminar, para evitar las turbulencias de aire que genera. Contador electrónico de células ("cell counter"). Un contador electrónico de células es un instrumento capaz de contar y medir partículas en suspensión. Este instrumento fue comercializado por Coulter Electronics, y a pesar que posteriormente se han desarrollado métodos alternativos es aún hoy en dia el mecanismo más empleado. El sistema está formado por los siguientes elementos : 1. dos electrodos, uno en el interior de un tubo con un pequeño orificio que se introduce en la suspensión de partículas a contar, y un segundo electrodo que se introduce directamente en dicha suspensión. El tubo con el orificio está conectado a un manómetro de mercurio y a una bomba. El manómetro controla mediante el desplazamiento del mercurio la conexión y desconexión de los electrodos. 2. un amplificador electrónico de la señal, un analizador de altura de los pulsos, y una escala, conectados a los electrodos. Cuando la válvula que controla el manómetro se abre 0.5 ml de la suspensión entran en el interior del tubo por el pequeño orificio. Durante ese tiempo los electrodos están conectados y registran y transmiten al equipo de amplificación y análisis de la señal las oscilaciones de resistencia que detectan. Cada vez que una célula atraviesa el orificio se produce una variación de la resistencia proporcional al tamaño. Estos datos se registran y se analizan. Cámara de Neubauer.

18 18 La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos lineas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada L corresponde a 1 milimetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro. Equipo de purificación de agua. Es de gran importancia en la preparación de los medios, de los aditivos, o en cualquier solución que pueda estar en contacto con el cultivo, una absoluta esterilidad y ausencia de sustancias que puedan provocar alguna alteración al cultivo. Por ello se utiliza siempre agua de la máxima calidad (tipo MilliQ, Millipore) obtenida mediante equipos de doble destilación o de intercambio iónico y filtración. Es muy importante la eliminación de apirógenos, y restos de materia orgánica. Pipeteadores y Micropipetas

19 19 Se trata de dispositivos o instrumentos para el trasvase o medición de fluidos. Los de uso común en el laboratorio como las pipetas automáticas y las pipetas, pero con la salvedad del uso de bombas acopladas a la pipeta, manuales o eléctricas que permiten la aspiración mecánica del fluido. Importante para mantener la asepsia y al mismo tiempo para la protección del operador. El aire bombeado es filtrado previamente. LAVADO, ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES DE CULTIVOS, PREPARCIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS, MANTENIMIENTO DE STOCKS, GESTIÓN DE TODO EL TRABAJO.

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