Hemicanales formados por conexinas en la regulación del volumen del cardiomiocito expuesto a estrés hiposmótico

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1 Departamento de Bioquímica y Biología Celular Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas Universidad de Chile Hemicanales formados por conexinas en la regulación del volumen del cardiomiocito expuesto a estrés hiposmótico Directores de Memoria: Dr. Juan Carlos Sáez. Facultad Ciencias Biológicas, P. Universidad Católica de Chile Dr. Sergio Lavandero. Facultad Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile. Profesor Patrocinante Dr. Sergio Lavandero Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas Universidad de Chile Memoria para optar al título de Bioquímico Daniela Paz Salas Castro Santiago, 2009

2 DEDICATORIA Dedico esta memoria y todos mis logros académicos a mis padres, Lorena y Claudio, por inculcarme el valor de los estudios y el trabajo constante como herramientas para desarrollarme profesionalmente. Sin su constante apoyo y cariño para superar los momentos difíciles, nada de esto sería posible. 2

3 AGRADECIMIENTOS A mi familia por su apoyo y cariño incondicional. Gracias tías, primos, hermano, sobrinos y padres por alegrarse y disfrutar con mis triunfos y darme palabras de aliento y confianza cuando las cosas se volvían difíciles. Son responsables en gran medida de todos mis logros. A mis directores de tesis, Dres Sergio Lavandero y Juan Carlos Sáez. Por aceptarme en su laboratorio cuando recién comenzaba en mi vida científica y haber confiado en mis capacidades y siempre alentarme y enseñarme que la honestidad y la perseverancia son la clave del éxito. Por su paciencia y por darme la oportunidad de desarrollar mi tesis con libertad. Gracias por hacer del Laboratorio un lugar tan agradable para trabajar. A mis compañeros de Laboratorio por su amistad, alegría y consejos. Muchas gracias por compartir conmigo tan generosamente sus conocimientos y experiencias. Son responsables del ambiente increíble que se vive en el Laboratorio. En especial, muchas gracias Kurt y Jessi por su ayuda en los experimentos y por transmitirme sus conocimientos. A Fidel, Ruth y Gladys por facilitarme las cosas y contribuir a que siempre tuviera todo lo necesario para trabajar. A mis amigas Jessi, Andrea y Vale por su amistad y cariño. Por su apoyo y ayuda. Son responsables en gran medida de la culminación de esta Tesis. Agradezco la oportunidad de haberlas conocido. Finalmente, agradezco a mis padres por todas las enseñanzas y valores que me inculcaron. Por celebrar todos mis logros y siempre apoyarme en mis decisiones. 3

4 FINANCIAMIENTO Esta memoria se realizó en el laboratorio de Transducción de Señales del centro Fondap Estudios Moleculares de la Célula, Facultades de Ciencias Químicas y Farmacéuticas y Medicina, Universidad de Chile y en el Departamento de Fisiología, Facultad de Ciencias Biológicas, Pontificia Universidad Católica de Chile. Esta memoria se financió parcialmente por los proyectos Fondap (SL) y Fondecyt (JCS) 4

5 INDICE GENERAL Página INDICE GENERAL... 5 ABREVIATURAS... 8 RESUMEN SUMMARY INTRODUCCIÓN Mantención del volumen celular Vías de ingreso del agua a las células Mecanismos de regulación del volumen celular Aumento regulado de volumen o RVI Disminución regulada de volumen o RVD Transducción de señales durante la regulación de volumen Isquemia cardiaca y regulación de volumen Cardiomiocitos y regulación de volumen Conexinas Papel de las conexinas en el precondicionamiento isquémico e isquemia/reperfusión Conexinas y regulación del volumen HIPOTESIS OBJETIVO GENERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS MATERIALES Y MÉTODOS Reactivos Modelo animal Aislamiento y cultivo de cardiomiocitos ventriculares de ratas neonatas Modelo experimental de inducción de estrés hiposmótico Determinación del estado funcional de hemicanales formados por conexinas Determinación de niveles de hemicanales en la superficie celular

6 5.7. Electroforesis en geles de poliacrilamida Western blot Determinación del volumen celular Expresión de resultados y análisis estadístico RESULTADOS Determinación del estado funcional de los hemicanales formados por conexina durante el estrés hiposmótico Determinación del cambio en el número y/o estado de fosforilación de los hemicanales presentes en la superficie celular frente a estrés hiposmótico Participación de los hemicanales formados por conexinas en la regulación del volumen en cardiomiocitos expuestos a estrés hiposmótico DISCUSIÓN Estrés hiposmótico y estado funcional de los Hcs-Cxs Estrés hiposmótico y cambio en la actividad de los hemicanales: aumento de los Hcs-Cxs en la superficie v/s cambio en el estado de fosforilación Aumento de volumen durante el estrés hiposmótico y su relación con Hcs-Cxs CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA

7 INDICE DE FIGURAS Y TABLAS Página Figura 1. Aumento de volumen en cardiomiocitos expuestos a isquemia y reperfusión Figura 2. Estructura de los hemicanales y las uniones en hendidura formadas por conexinas Figura 3. Análisis representativo de los cardiomiocitos para determinar cinética de captación de Etd Figura 4. Curso temporal del efecto del estrés hiposmótico en la captación del Et por los cardiomiocitos Figura 5 Efecto del estrés hiposmótico sobre la velocidad de captación de Etd relativa en cardiomiocitos Figura 6. Curso temporal del efecto del estrés hiposmótico en la captación del Et por las células HeLa wt Figura 7 Curso temporal del efecto del estrés hiposmótico en la captación del Et por las células HeLa Figura 8 Efecto del estrés hiposmótico sobre la velocidad de captación de Etd relativa en células HeLa Figura 9. Efecto del estrés hiposmótico sobre el número y fosforilación de hemicanales formados por Cx Figura 10. Evaluación de la participación de Hcs-Cx43 en la regulación de volumen del cardiomiocito Tabla 1 Secuencia aminoacídica del péptido Gap26 y Gap26scr 42 7

8 ABREVIATURAS ºC : grados celcius µm : micromolar µl : microlitro ADP : adenosin difosfato AQP(s) : aquaporina (s) AQP1 : aquaporina 1 AM : acetometil ester ATP : adenosin trifosfato BrEt : bromuro de etidio Ca +2 CaCl 2 camp Cl - CO 2 Cx40 Cx43 Cx45 Cxs DME : ion calcio : cloruro de calcio : adenosin monofosfato cíclico : ion cloruro : dióxido de carbono : conexina de 40 kda : conexina de 43 kda : conexina de 45 kda : conexinas : Dulbecco's Modified Eagle's Medium DMEM-F12 : Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 DNA : ácido desoxiribonucleico EDTA : ácido etileno diamino tetracético EROs : especies reactivas del oxígeno Etd : etidio Ez-link NHS-SS-biotin : succinimidil 2-(biotinamido)-etil-1,3' ditiopropionato (biotina utilizada en la biotinilación) FBS : suero fetal de bovino FCS : suero fetal de ternero g : gramo h : hora HCl : ácido clorhídrico 8

9 HCO3 - : ion bicarbonato Hc-Cx43 : hemicanales formados por Cx43 Hcs-Cxs : hemicanales formados por conexinas Hcs-Pxs : hemicanales formados por panexinas Hipo : medio hiposmótico IAM : infarto agudo al miocardio K+ : ion potasio KCl : cloruro de potasio kda : kilo Dalton KH 2 PO 4 : fosfato diácido de potasio L : litro LaCl 3 : cloruro de lantano M : molar m iso m hipo : pendiente de captación obtenida con medio isosmótico : pendiente de captación obtenida con medio hiposmótico m La+3 : pendiente de captación obtenida al agregar LaCl 3 MgCl 2 : cloruro de magnesio MgSO 4 : sulfato de magnesio min : minuto ml : mililitro mm : milímetro mosm : miliosmolar mrna : ácido ribonucleico mensajero Na+ : ion sodio Na 2 HPO 4 : fosfato ácido disódico NaCl : cloruro de sodio NaF : fluoruro de sodio NAD+ : Nicotinamida adenina dinucleótido nm : nanómetros NP-40 : nonidet p40 p38-mapk : proteina quinasa de 38 kda activada por mitógenos PKC : proteina quinasa C PMSF : p-fenilmetilsulfonilfluoruro PVDF : polivinilidenfluoruro 9

10 rpm ROI RVI RVD SDS seg SEM TBS TonEBP V Wt : revoluciones por minuto : region de interés : aumento regulado de volumen : reducción regulada de volume : dodecilsulfato de sodio : segundos : error estándar de la media : amortiguador tris salino : proteína de unión al elemento de respuesta a tonicidad : voltios : tipo silvestre 10

11 RESUMEN El correcto funcionamiento celular requiere condiciones físicas específicas, como ph, temperatura y fuerza iónica. Cualquier alteración de estos parámetros puede producir consecuencias graves para las células. La mantención del volumen celular es otro de los parámetros importantes para la célula ya que regula la fuerza iónica y las concentraciones de osmolitos y segundos mensajeros intracelulares. En patologías como la diabetes o isquémicas como el infarto agudo al miocardio, ocurren alteraciones del volumen celular. Durante la isquemia disminuye el aporte de nutrientes y oxígeno a las células por lo que aumenta el catabolismo de nutrientes para obtener energía. Como consecuencia, aumenta la osmolaridad intracelular y con ello, la entrada de agua a la célula produciéndose un aumento de su volumen. Pero las células han desarrollado mecanismos para regular su volumen y volver a la normalidad frente a cambios en la osmolaridad del medio. En el caso del estrés hiposmótico, la estrategia consiste en sacar iones de la célula, lo que disminuye su contenido de agua. Se ha descrito que los cardiomiocitos no regulan espontáneamente su volumen en condiciones de estrés hiposmótico, lo que se ha asociado a muerte. Este hecho es importante si consideramos que el corazón es uno de los órganos más afectados por enfermedades que incluyen episodios isquémicos. Las conexinas son proteínas de transmembrana que forman hexámeros (hemicanal) y se insertan en la membrana plasmática de las células. Si dos hemicanales de células adyacentes se unen forman un canal de una unión en hendidura, y permiten la comunicación de los citoplasmas de las células vecinas. Se ha propuesto que los hemicanales formados por la conexina 43 (Hcs-Cx43) podrían participar en la regulación de volumen de las células, ya que forman verdaderos poros en la superficie celular que permite el paso de agua e iones por difusión simple. El objetivo de esta tesis consistió en determinar si los hemicanales formados por conexinas participan en la regulación de volumen del cardiomiocito expuesto a estrés hiposmótico. Para este fin cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas se expusieron a estrés hiposmótico y se estudió: 11

12 Si el estrés hiposmótico modifica el estado funcional de los Hcs-Cx43 a través de la técnica de captación de etidio Si los cambios en el estado funcional de los Hcs-Cx obedecen a modificaciones en la cantidad de los Hcs-Cx43 expuestos en la membrana o cambios en su estado de fosforilación, mediante la técnica de biotinilación de proteínas de superficie Si los Hcs-Cx43 participan en la regulación de volumen del cardiomiocito expuesto a estrés hiposmótico, mediante el uso de calceina-am y microscopía confocal como indicador de los cambios de volumen de la célula e interviniendo el sistema con el inhibidor específico de Hcs-Cx43, Gap26. Los resultados muestran que los Hcs-Cx aumentan su estado funcional al exponer las células a estrés hiposmótico, lo que impide la regulación de volumen del cardiomiocito, ya que al inhibirlos con Gap26 recuperan su volumen. Además se sugiere que el aumento funcional de los Hcs-Cx no se podría explicar por cambios en el estado de fosforilación o alteraciones de la cantidad de Hcs-Cx expuestos en la membrana celular. De estos resultados se concluye que los hemicanales formados por conexinas participan en el control del volumen del cardiomiocito 12

13 SUMMARY Role of connexin hemichannels in the regulation of cardiac myocyte volume by hyposmotic stress The cell homeostasis requires specific physical conditions such as ph, temperature and ionic strength. Any alteration in these parameters may produce serious consequences to the cell. The maintenance of cell volume is key parameter because is involved in the regulation of ionic strength, and concentration of osmolyte and intracellular second messengers. Alterations in cell volume have been described in pathologies such as diabetes, stroke and acute myocardial infarction. During ischemia the nutrients and oxygen availability to the cells diminishes, resulting in an increased catabolism in order to obtain energy. As a consequence, intracellular osmolarity increases leading to water influx into the cell and an increase in cell volume. Cells have developed different compensatory mechanisms to restore their volume when they are exposed to changes in external osmolarity. In the case of hyposmotic stress, ions are pumped out the cell to diminish water content. It has been shown that cardiac myocytes are unable to spontaneously regulate their volume when exposed to osmotic stress, and this event has been associated with increased cell death susceptibility. This is important if we consider that cardiac tissue is one of the most affected organs by ischemic diseases. Connexins are transmembrane proteins forming hexamers (hemichannels) at the cell membrane. When two hemichannels from adjacent cells reach each other, they form a gap junction channel, which allow communication of both cytoplasms. It has been proposed that hemichannels formed by connexin 43 (Hcs-Cx43) may participate in cell volume regulation because they form pores in the cell surface allowing the passage of water and ions by simple diffusion. The aim of this work was to evaluate whether Hcs-Cx43 participates in the volume regulation of cardiac myocytes exposed to hyposmotic stress. To this end, cultured neonatal rat cardiac myocytes were exposed to hyposmotic stress and we study whether: 13

14 Hyposmotic stress modifies the functional state of Hcs-Cx43 assessing the ethidium uptake by the cells Changes in Hcs-Cx functional state are explained by the number of Hcs-Cx43 present in the cell membrane or by changes in their phosphorylation status. Hcs-Cx43 participates in the volume regulation of cardiac myocyte exposed to hyposmotic stress. This was evaluated using calcein-am and confocal microscopy to measure changes in cell volume and Gap26 to inhibit Hcs-Cx43. The results showed that the functional state of Hcs-Cx is enhanced in cells exposed to hyposmotic stress. Such increase in the functional state of Hcs-Cx could not be explained by changes in the phosphorylation state or alterations in the amount of Hcs- Cx exposed in the cell surface. The increase in cardiac myocyte volume induced by hyposmostic stress was inhibited by Gap26. These results collectively show that connexin hemichannels participates in the regulation of cardiac myocyte volume. 14

15 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Mantención del volumen celular El mantenimiento del volumen celular es fundamental para el correcto funcionamiento de las células. Pequeñas perturbaciones de la osmolaridad extracelular producen cambios en el contenido de agua de la célula alterando la concentración de mensajeros celulares, el equilibrio iónico y la estructura celular, lo que puede afectar negativamente el funcionamiento de la célula (Ho, 2006). Bajo condiciones fisiológicas el medio extracelular se mantiene relativamente constante. Sin embargo el medio intracelular cambia continuamente debido a la generación de gradientes osmóticos transitorios asociados a la incorporación de nutrientes, exocitosis de moléculas, metabolismo y remodelamiento del citoesqueleto, por lo que la célula constantemente debe poner en marcha mecanismos que permitan regular su volumen (Lang et al., 1998) Vías de ingreso del agua a las células Las membranas celulares son altamente permeables al agua, pudiendo entrar en forma pasiva a través de la membrana plasmática, por canales de proteínas llamadas aquaporinas o solvatando iones que ingresan a la célula a través de canales o transportadores selectivos (Wright y Rees, 1998). A pesar de la naturaleza lipídica de la membrana plasmática, las moléculas de agua pueden difundir a través de ella e incluso hasta el descubrimiento de las aquaporinas, se pensaba que era el principal mecanismo de entrada de agua a las células (Wright y Rees, 1998). Estudios en bicapas lipídicas artificiales mostraron una permeabilidad al agua superior a 50x10-6 ms -1 en ausencia de colesterol y de 10-20x10-6 ms -1 con la incorporación de concentraciones fisiológicas de colesterol (Fettiplace y Haydon, 1980). Pero estos valores no permiten dar cuenta de cambios rápidos de volumen que ocurren en la célula cuando está expuesta por ejemplo a estrés osmótico, para lo cual existirían las aquaporinas. 15

16 Las aquaporinas (AQP) son proteínas integrales de membrana que forman poros en la superficie de las células, permitiendo el paso de agua y algunas sales a favor de su gradiente de concentración. Estas proteínas son especialmente importantes en las células renales, donde cumplen un papel fundamental en la reabsorción de agua (Verkman y Mitra, 2000). Su papel en células cardiacas es controversial por lo que no se puede saber con certeza cuál es su función (Egan et al., 2006), aunque hay trabajos que sugieren que podrían participar en la regulación de volumen, ya que se ha observado aumentos del mrna y expresión de AQP1 en condiciones de estrés hiposmótico (Jonker et al., 2003). El tercer mecanismo que posibilita movimientos de agua entre los medio intra y extracelulares son los iones. La célula tiene un cierto balance iónico que si se rompe activa transportadores que movilizan los iones y, con ello, agua para solvatarlos (Wright y Rees, 1998). Debido a que los iones contribuyen significativamente a la osmolaridad tanto intra como extracelular, se estima que son responsables de aproximadamente 2/3 de la regulación de volumen de la célula (Fisher y Spring, 1984) Mecanismos de regulación del volumen celular Cuando una célula se ve expuesta a cambios en la osmolaridad, se activan mecanismos que contrarrestan las modificaciones en el volumen celular, alterando principalmente la cantidad de osmolitos al interior de la célula y con ello, agua (Lang et al., 1998) Aumento regulado de volumen o RVI Si el medio extracelular tiene una mayor concentración de osmolitos que el intracelular, la célula se enfrenta a un estímulo hiperosmótico y pierde agua, por lo que se encoge y se activa una respuesta que se conoce como Aumento Regulado del Volumen o RVI, por su sigla en inglés (Regulated Volume Increase) que tiene un componente a temprano o corto plazo y otro tardía o de largo plazo (Wright y Rees, 1998). En el primero se activan mecanismos que posibilitan la entrada de iones como K +, Cl - y Na + a través de intercambiadores preexistentes de Na + -K + -2Cl - (Dunham et al., 1990), Na + /H + (Grinstein et 16

17 al., 1983) y Cl - /HCO3 - (Hebert, 1986) para que aumente la concentración de osmolitos en la célula e ingrese agua para recuperar el volumen. Como consecuencia se producen cambios en el ph intracelular y aumenta la fuerza iónica, afectando a largo plazo principalmente a las proteínas (Lang et al., 1998). Si se trata de un estímulo sostenido en el tiempo, se pone en marcha la respuesta adaptativa, que consiste en cambiar los iones por osmolitos orgánicos como sorbitol, taurina y betaína, que son moléculas osmóticamente activas pero que carecen de carga, con lo que se consigue mantener el agua al interior de la célula sin cambiar la fuerza iónica (Ho, 2006). Con este fin se activan genes para aumentar la producción o el transporte de estos osmolitos orgánicos, en su mayoría bajo el control del factor de transcripción de respuesta a estrés osmótico TonEBP (Handler y Kwon, 2001) Disminución regulada de volumen o RVD En el caso del estrés hiposmótico, la célula aumenta de volumen debido a que existe una mayor concentración de osmolitos al interior de la célula respecto al medio extracelular, por lo que ingresa agua a favor de su gradiente de concentración. En condiciones fisiológicas esto ocurre durante el metabolismo, en que aumenta el número de moléculas en el medio intracelular y se produce un pequeño gradiente osmótico (Pasantes-Morales et al., 2006). Para contrarrestar este evento se activa la respuesta de Disminución Regulada del Volumen o RVD por su sigla en inglés (Regulated Volume Decrease), que consiste en eliminar K + y Cl - de la célula para expulsar agua y recuperar el volumen. Para ello se activan en forma paralela transportadores o co-transportadores de K + y Cl -, dependiendo del tipo celular, y de osmolitos como sorbitol e inositol, para eliminarlos de la célula, además de activarse la degradación de osmolitos en algunos tipos celulares (Lang et al., 1998). El objetivo de la activación de estos mecanismos es conseguir la reducción de la concentración de osmolitos intracelulares para que se produzca reducción del volumen de la célula. 17

18 1.3. Transducción de señales durante la regulación de volumen Aún no está claro si en los cambios de volumen de la célula y la activación de las vías de señalización involucradas participa un tipo de molécula o una variedad de ellas que interactúan para detectar dichos cambios. Se ha propuesto la participación de diversas moléculas como integrinas (vom Dahl et al., 2003), receptores de factores de crecimiento (Franco et al., 2004), proteínas G (Davis et al., 1992), canales sensibles a estiramiento (Sackin, 1995) y cambios en el citoesqueleto (Pedersen et al., 2001) como sensores de los cambios de volumen, ya que se ha demostrado su activación durante distintos estímulos osmóticos (Pasantes-Morales et al., 2006; Wright y Rees, 1998). Se ha demostrado que el aumento en la concentración de Ca +2 intracelular es fundamental para el RVD de múltiples tipos celulares, mientras que cambios en la concentración de camp, pareciera ser fundamental para el RVI, relacionados ambos con el funcionamiento de canales iónicos (McCarty y O Neil, 1992). El Ca +2 también se ha vinculado al funcionamiento de proteínas quinasas, como PKC, las que podrían activar canales iónicos a través de su fosforilación durante la RVI (Grinstein et al., 1986). Por otro lado, se ha sugerido que durante la RVD la desfosforilación sería el evento predominante ya que se correlaciona con la salida de K + y Cl - de la célula (Jennings y Schulz, 1991). Son múltiples las proteínas que se activan río debajo de las respuestas de RVI y RVD, encontrándose diferencias según el tipo celular de que se trate. A pesar de que existe consenso en algunos mecanismos que operan en las células, hasta la fecha no se ha podido encontrar un mecanismo universal que de cuenta de la regulación de volumen (Lang et al., 1998). Los cambios de volumen producto tanto del estrés hiposmótico e hiperosmótico producen graves consecuencias en la célula debido a que se altera la concentración de moléculas intracelulares como iones y segundos mensajeros que pueden derivar en una alteración de la homeostasis celular e incluso la muerte. Dentro de las condiciones patológicas que producen cambios de volumen en la célula, la isquemia es una de las más importantes debido al daño que produce y por la alta frecuencia con que se presenta en la población. 18

19 1.4. Isquemia cardiaca y regulación de volumen Las enfermedades cardiovasculares constituyen una de las principales causas de muerte en el mundo (Kannel, 2000), por lo que el estudio de los mecanismos moleculares implicados en estas patologías, resulta de vital importancia. Dentro de ellas, las de tipo isquémico, como infarto agudo al miocardio (IAM), son las más prevalentes. La isquemia se caracteriza por la interrupción del flujo sanguíneo, disminuyendo el aporte de oxígeno (hipoxia) y de nutrientes a las células (Cokkinos, 2006) y el lavado de productos metabólicos o de desecho celular. Una de las consecuencias de la isquemia es el aumento de la osmolaridad intracelular, producto del catabolismo de los nutrientes almacenados (ej. ATP se convierte en ADP y fósforo inorgánico) y del aumento en la producción de lactato debido a que la falta de suministro de oxígeno produce un cambio de metabolismo de oxidativo a glicolítico (Reimer et al., 1981). Debido al aumento en la cantidad de osmolitos intracelulares, la célula experimenta estrés hiposmótico, por lo que el agua ingresa a la célula siendo impulsada por el gradiente de concentración de los solutos y se produce un aumento en el volumen de la célula, produciendo consecuencias deletéreas como acortamiento del potencial de acción en el caso de cardiomiocitos (Vandenberg et al., 1996). En un experimento realizado por Tranum-Jensen et al (1981), se determinó los cambios en la osmolaridad en corazones de cerdo aislados sometidos a isquemia regional por oclusión (ver Figura 1). Se observó que luego de 50 min de isquemia, la osmolaridad promedio de la célula aumenta en aproximadamente 40 mosm, lo que se correlaciona con un discreto aumento del volumen celular de aproximadamente 16%. El hecho de que la célula prácticamente no aumente de volumen durante la isquemia a pesar del aumento en la osmolaridad intracelular, es bien documentado en la literatura (Vandenberg et al., 1996) y se puede atribuir principalmente a la rápida salida de moléculas permeables a la membrana celular y al rápido transporte del lactato fuera de la célula a través de transportadores específicos (Poole y Halestrap, 1993), por lo que la osmolaridad intracelular se equilibraría rápidamente con la extracelular, aliviando el estrés osmótico. 19

20 Al reestablecerse el flujo sanguíneo ingresa sangre normotónica al sitio isquémico, desplazando el medio extracelular circundante ligeramente hipertónico. Debido a que estas células presentan alta osmolaridad, el gradiente osmolar generado en estas condiciones es mayor al que ocurre durante la isquemia, lo que induce un mayor aumento del volumen celular (Jennings et al., 1985), ya que la célula no alcanza a equilibrar su osmolaridad con la del medio extracelular. A este segundo aumento de volumen se ha asociado la mayor parte del daño celular, correlacionándose con arritmias y en general, un mayor grado de disfunción cardiaca (Tranum-Jensen et al., 1981). Esto se sustenta en la evidencia de que al reperfundir con medio ligeramente hipertónico (con una osmolaridad similar a la que se alcanza durante la isquemia), los parámetros cardiacos mejoran notablemente (García-Dorado y Oliveras, 1993), revelando la importancia de la osmolaridad en la regulación de volumen en la patología isquémica. (a) Isquemia PCr Cr + Pi Mg-ATP (ADP,AMP) + Mg 2+ + Pi triglicéridos acetil-coa glicógeno lactato + H + (b) Reperfusión PCr Cr + Pi Mg-ATP (ADP,AMP) + Mg 2+ + Pi trigliceridos acetil-coa glicógeno lactato + H mosm Kg mosm Kg-1 K + Capilar lactato + H mosm Kg-1 Sangre Normotónica H 2 O Capilar 290 mosm Kg-1 Figura 1. Aumento de volumen en cardiomiocitos expuestos a isquemia y reperfusión. (a) Se esquematiza cómo la isquemia afecta la osmolaridad intracelular y el rápido equilibrio que existiría con el medio extracelular al no existir flujo de sangre, por lo que no se producen cambios importantes de volumen. (b) Cuando ocurre la reperfusión con sangre normotónica, las células, cuya osmolaridad interior está aumentada, experimentan un brusco estrés hiposmótico al enfrentarse a la osmolaridad de la sangre. Como no pueden equilibrar su osmolaridad con el medio extracelular debido a que éste se recambia continuamente, ocurre un brusco aumento de volumen. Adaptado de Vandenberg et al.,

21 1.5. Cardiomiocitos y regulación de volumen Existe controversia respecto de si las células cardiacas son capaces o no de regular su volumen en forma espontánea cuando se enfrentan a un medio anisosmótico. Distintos investigadores señalan que los cardiomiocitos no ponen en marcha los mecanismos de RVI o RVD (Drewnowska y Baumgarten, 1991; Wang et al., 1997), pero en algunos tipos celulares como cardiomiocitos de pollo presentan RVD (Zhang et al., 1993). En nuestro Laboratorio hemos demostrado que en cardiomiocitos de rata neonata no existe RVD espontáneo, lo que sería inhibido por las especies reactivas del oxígeno (EROs), que se producen durante el estrés hiposmótico (Diaz-Elizondo et al., 2006). Aún no se conocen en detalle los mecanismos que gobiernan el RVD. Se ha descrito un sinnúmero de moléculas y proteínas que podrían participar en este proceso, siendo los hemicanales formados por la conexina 43 (Hcs-Cx43) uno de los últimos candidatos atractivos para participar en regulación de volumen debido a su capacidad para formar verdaderos poros en las células, dejando pasar agua e iones (Schulz y Heusch, 2004) Conexinas La familia de las conexinas está formada por 20 integrantes en humano, siendo la conexina-43 (Cx43) la más ubicua (Laird, 2006). El corazón es especialmente rico en conexinas, y expresa las conexinas 40, 45 y 43 (John et al., 2003). Las conexinas (Cxs) son proteínas que participan en la formación de uniones en hendidura (o gap junctions), que comunican el citoplasma de dos células adyacentes. Luego de la síntesis, las conexinas oligomerizan en el retículo endoplásmico para formar hexámeros (hemicanal o conexón), los cuales son posteriormente exportados hacia la membrana plasmática para insertarse en ella. Una vez que un hemicanal se inserta en la membrana, difunde hasta encontrar el conexón de una célula vecina, dando origen a la unión en hendidura y con ello la comunicación entre las células (ver Figura 2). Los canales intercelulares se agregan formando diferenciaciones de la membrana denominadas placas de unión (Laird, 2006). En el corazón, tales canales cumplen un rol 21

22 fundamental en la transmisión de señales eléctricas, permitiendo la propagación de ondas de calcio que coordinan la contracción (Jalife et al., 1999). Durante mucho tiempo se pensó que los hemicanales sólo eran el paso previo a la formación de uniones en hendidura, pero en los últimos años se ha demostrado que los hemicanales pueden permanecer en la membrana citoplasmática sin participar en la unión intercelular (Goodenough y Paul, 2003) y formar poros poco selectivos que permiten el paso de iones y moléculas de hasta ~1 kda, en función de su gradiente de concentración, con el consiguiente movimiento de agua (John et al., 2003). Se ha demostrado que a través de estos hemicanales pueden pasar moléculas como ATP, glutamato, prostaglandina E 2 y NAD+, que actúan como mensajeros paracrinos (Sáez et al., 2003; Jiang y Cherian, 2003). Debido a su baja selectividad y gran diámetro de poro, en células en reposo los hemicanales presentan baja probabilidad de apertura pero ésta aumenta con la desfosforilación (Hcs-Cx43), baja concentración de Ca 2+ externo, estímulos mecánicos, potencial de membrana positivos y disminución del potencial redox de la célula (Hcs-Cx43) (Sáez et al., 2005). También, estímulos patológicos, como la inhibición metabólica e isquemia/reperfusión aumentan la permeabilidad de la membrana celular a través de los hemicanales (John et al., 2003). 22

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