La estereología es un método que en biología celular

Transcripción

1 Patología 2012;50(2):63-71 Revista latioamericaa Artículo origial Revisió de los métodos estereológicos y su aplicació e biología celular Ofelia Pérez-Olvera,* Salvador Arellao Balderas,** Héctor A. Rodríguez Martíez* RESUMEN E medicia u gra úmero de ivestigacioes requiere del aálisis morfométrico de u órgao, tejido o célula y/o del estudio de su composició itera. La estereología es el resultado de razoamietos matemáticos complejos, cocretados e fórmulas aplicables para la obteció de parámetros tales como: desidad de volume, desidad de superficie, desidad umérica y desidad de logitud, a partir de imágees bidimesioales. Los cambios e la fució celular, por ejemplo, frecuetemete se asocia co aumeto o dismiució e el tamaño de células o úcleos, o bie, co cambios e el úmero de determiadas orgaelas celulares ivolucradas e el proceso. Se preseta ua breve revisió de los métodos y los pricipios físico-matemáticos e que se basa los métodos estereológicos comúmete utilizados. Se revisa ua serie de cocepcioes sobre los pricipios estereológicos estudiados a lo largo de varias décadas co el objeto de evitar sub o sobreestimacioes e la valoració de los resultados que el método permite determiar. Actualmete varios programas de cómputo ha simplificado la aplicació de los estudios de morfometría, lo cual ha resultado e grades vetajas para elaborar cuatificacioes a corto plazo. Palabras clave: estereología, desidad de volume, desidad de superficie, desidad umérica. ABSTRACT I Medicie, a large umber of ivestigatios require a morphometric aalysis of a orga, tissue or cell ad/or the study of their iteral compositio. Stereological methods are the result of mathematical reasoig explaied i applicable formulas desiged to determie parameters such as volume desity, surface desity, umerical desity ad legth desity, from bidimesioal images. Chages i cellular fuctio, for example, are frequetly related to variatios i the size of cells ad uclei, or to chages i the umber of specific cellular orgaelles ivolved i the process. A brief review of the physical-mathematical priciples that gave rise to the classic stereological methods is preseted. We commet upo a series of coceptios o stereological priciples over the past few decades i order to prevet uder or overestimatios i the appraisal of the results that the method allows. The stereological methods more frequetly used are also examied. Curretly software developmet simplifies the applicatio of morphometric studies, whose mai advatage is that they allow quatificatios i a short time. Key words: stereology, volume desity, surface desity, umerical desity. * Laboratorio de Ivestigacioes Aatomopatológicas ìroberto Ruíz Obregóî, Departameto de Medicia Experimetal (Facultad de Medicia, UNAM). **Área de Aálisis Matemático y sus Aplicacioes (Uiversidad Autóoma Metropolitaa, Uidad Azcapotzalco). Correspodecia: Biol. Ofelia Pérez Olvera, Hospital Geeral de México, Uidad de Medicia Experimetal, Facultad de Medicia, UNAM. Dr. Balmis, o. 148, col. Doctores, Delegació Cuauhtémoc. Correo electróico: o_perez_olvera@yahoo.com.mx Recibido: mayo Aceptado: eero 2012 Este artículo debe citarse como: Pérez-Olvera O, Arellao Balderas S, Rodríguez Martíez HA. Revisió de los métodos estereológicos y su aplicació e biología celular. Patología Rev Latioam 2012;50(2): La estereología es u método que e biología celular permite, aplicado fórmulas matemáticas basadas e la probabilidad geométrica estadísticamete sigificativa, obteer iformació tridimesioal de células o estructuras tisulares, a partir de cortes microscópicos bidimesioales, seriados, paralelos y equidistates. 1 La descripció morfológica y el aálisis estructural cuatitativo ha cotribuido a la resolució de muchos de los problemas, o solamete de citología sio tambié de patología, fisiología, y bioquímica. La estereología ha bridado los medios ecesarios para la cuatificació. Patología Revista latioamericaa Volume 50, úm. 2, abril-juio,

2 Pérez Olvera O y col. Los parámetros más comúmete estudiados so: a) desidad de volume (V V ), que es el volume de las orgaelas o estructuras tisulares coteido por uidad de volume; b) desidad de superficie (área) ( ), que es la superficie de las membraas de las orgaelas o estructuras tisulares por uidad de volume, y c) desidad umérica ( N V ), que es el úmero de orgaelas o estructuras tisulares por uidad de volume obteido mediate coteo de putos, iterseccioes o úmero e los perfiles de las estructuras celulares y tisulares a estudiar. El objetivo de este trabajo es hacer ua revisió de los métodos estereológicos más comúmete usados e biología celular e idicar de maera muy geeral las posibilidades de su aplicació para evitar sub o sobreestimacioes e las determiacioes de las desidades de volume, superficie y uméricas. Breve historia y establecimieto de alguos parámetros E 1635, Bueavetura Cavalieri mostró que el volume medio de ua població de objetos de forma irregular se puede estimar a través de la suma de las áreas, a partir de cortes del mismo objeto a itervalos costates. Este pricipio permitió las cuatificacioes morfológicas de volúmees de objetos de ua població basádose e la itegració de áreas de u espacio de referecia defiido. 1 Hay diferetes métodos para estimar las áreas de u objeto por medio de cortes; uo de los más usados e estereología es el método de coteo de putos, que se describe mas adelate. El orige de la estereología propiamete dicha se ubica e 1847 co el pricipio de Auguste Delesse, 2 el cual demuestra que la desidad de volume (V V ), o sea el volume de las orgaelas por uidad de volume de u compoete, es igual a la desidad de área ( A V ), o sea el área de los perfiles del corte: N A = N V / D Delesse toma como modelo para la deducció de su pricipio u cubo de tejido que cotiee sólo u compoete de forma irregular icrustado e ua matriz (Figura 1). Este objeto puede teer cualquier tamaño y forma. 2 Si se poe el cubo detro de u sistema de tres coordeadas X, Y, Z, y se corta el plao X Z e cortes delgados de u grosor dy coocido, el área total de cada corte es igual a a T ; y detro del mismo corte la estructura e estudio cubre u área igual a a. El cubo tiee, por tato, 0 Figura 1. Pérez-Olvera. Modelo del pricipio de Delesse (ver Weibel ER. 1979). cierto volume total V T. De maera aáloga, el volume total de cada corte es v t y el volume de la estructura e estudio detro el corte es v 0, y se puede expresar de la siguiete maera: v T = a T dy ; y v 0 = a 0 dy Ahora, si se suma todas las rebaadas se tiee que: v 0 v = V 0 = V V T V T Dode V V es la desidad de volume de la estructura e estudio. Pero si la relació aterior se expresa de la siguiete maera: v = ( a0dy) ( a dy) dy = A A vt T dy at T a = = A Dode: A 0 = la sumatoria del área que ocupa la estructura e estudio A T = la sumatoria del área de todo el cubo A A = la desidad de área de A 0, coteida e A T Debido a que el grosor del corte es ua costate, se puede sacar fuera de la suma y es igual a 1. Es evidete que ambas ecuacioes so iguales y, por lo tato: V V = A A, 2 Glagoleff, e 1933, 3 y Charkly, e 1943, 4 redujero el sistema de prueba a ua rejilla co putos colocados a ua distacia d coocida y demostraro que la fracció de putos que toca el objeto ( P p ) es igual a la desidad de volume: P p = V V. El razoamieto que siguiero Glagoleff y Charklly de maera idepediete dio lugar al método de la plaimetría A 64 Patología Revista latioamericaa Volume 50, úm. 2, abril-juio, 2012

3 Métodos estereológicos y su aplicació e biología celular (Figura 2), que cosiste e trazar pequeños cuadritos de ua área costate y coocida para decidir si los cuadros que se ecuetra e el límite de la estructura está detro o fuera. Comúmete se dice que si por lo meos la mitad del cuadro está adetro de la figura, etoces se cosidera icluida. 3.4 Para simplificar esto, Glagoleff 3 pesó que era más fácil marcar co u puto el cetro del cuadrado para que se pudiera prescidir de los cuadrados y plausiblemete cosiderar que: A A = P p Saltykov, e 1945, 5 itrodujo el parámetro de, y demostró que: a) la orilla (o límite de logitud) de u objeto determiado es proporcioal al área de superficie del mismo objeto; y que b) esta superficie puede ser estimada a partir del úmero de iterseccioes co las líeas paralelas de ua rejilla de prueba colocadas al azar. Smith y Guttma (1953) 6 y Heig (1956) 7 retomaro los coceptos ivolucrados e el pricipio aterior para establecer que: la superficie del objeto e estudio es igual a 2 veces la desidad de iterseccioes del objeto co las líeas de la rejilla de prueba (I L ). = 2I L Dode I L proviee del pricipio del Code Bufó, referido por Weibel, 8 que dice que: hay probabilidad de que ua simple aguja de logitud L e u movimieto aleatorio itercepté ua rejilla de líeas paralelas de distacia d coocida. Wiecksell (1925) 9 fue el primero e estudiar el úmero de partículas coteidas V v e cierto compartimeto y e defiir ua relació etre: a) el tamaño de la partícula e estudio (midiedo e cada corte su diámetro, y tomado dos tipos de forma: elipsoidal y esférica), y b) el úmero de veces que aparece e cada corte. E 1968, 10 y posteriormete e 1981, De Hoff y Rhies 11 demostraro que: N A = N V / D, Dode, N A es la desidad umérica total por uidad de área de la estructura celular e estudio, N v es la desidad umérica del objeto e estudio (el úmero de veces que aparece la estructura celular e estudio por foto o campo), y D es el diámetro promedio del objeto. Métodos estereológicos formulados por Weibel Weibel, 8,12 quie se cosidera el padre de la estereología, formuló la siguiete metodología e dode a las fotografías (de preferecia de tamaño carta), que cotiee la estructura celular e estudio y a la que se desea medir el parámetro estereológico, se les sobrepoe rejillas trasparetes co el sistema de prueba adecuado y por medio de putos, iterseccioes, o cotado el úmero, se aplica las correspodietes fórmulas depediedo del parámetro a estudiar. Desidad de volume (Figura 3). Figura 2. Pérez-Olvera. Método de plaimetría, sistema de coteo de putos. (Ver Weibel ER, 1979). Figura 3. Pérez-Olvera. Sistema de putos para obteció de desidad de volume. Corte e parafia de pácreas, tició de meteamia de Joes. Patología Revista latioamericaa Volume 50, úm. 2, abril-juio,

4 Pérez Olvera O y col. V V = P a P c ( i) ( i) Dode: V v = desidad de volume de la estructura celular e estudio. P a ( i) = la suma de los putos que toca la estructura celular. P c ( i) = la suma de los putos totales de la rejilla. Desidad de superficie (Figura 4). ( i) = 2 i I a L c Dode: S v = desidad de superficie de la estructura celular e estudio. I a ( i) = suma de las iterseccioes etre las líeas de prueba y la estructura celular. L c ( i) = suma del total de las líeas de prueba de la rejilla. ( ) Esta fórmula se aplica co la rejilla de multisistema o bie co las líeas paralelas. Desidad umérica (Figura 5) N A = N V / D Dode: N A = desidad umérica real de la estructura celular e estudio y para la cual se ecesita saber el diámetro promedio de la orgaela e estudio. N V = desidad umérica de los perfiles cuatificados de la estructura celular por uidad de área. D = diámetro promedio de la estructura celular. Esta fórmula aplica para estructuras celulares redodas u ovales. Multisistema: cosiste de ua rejilla trasparete que cotiee u cuadriculado e dode se cooce el tamaño de cada cuadro y el área total de la rejilla. Co este tipo de rejilla se puede realizar todas las pruebas ateriores (Figura 6) Aplicació de los métodos estereológicos La preparació del material biológico, para su posterior aálisis, demada u cuidado especial para que las características morfológicas aturales de la estructura celular y de las estructuras tisulares por medir o sea alteradas por los procesos de fijació, deshidratació, ifiltració, de tal forma que todo el procesamieto de las muestras de tejido Figura 4. Pérez-Olvera. Sistema de iterseccioes para obteció de desidad de superficie. Corte e parafia de pulmó, tició de meteamia de Joes. Figura 5. Pérez-Olvera. Sistema de desidad umérica de elemetos celulares por uidad de área. El recuadro es ua rejilla de u área coocida. Corte e parafia de riñó, tició de meteamia de Joes. 66 Patología Revista latioamericaa Volume 50, úm. 2, abril-juio, 2012

5 Métodos estereológicos y su aplicació e biología celular de 5 a 10 bloques por caso. Se requiere aproximadamete 200 putos para calcular la desidad de volume y aproximadamete 200 iterseccioes para determiar la desidad de superficie por cada caso de los diferetes compartimetos de iterés. Para calcular la desidad umérica, será suficiete la cuatificació de orgaelas muestreado de 100 a 200 células por 13, 14 espécime. Figura 6. Pérez-Olvera. Multisistema. Corte e parafia de riñó, tició de meteamia de Joes. se realice de la misma maera. Así, los parámetros por medir, icluyedo desde la toma de la muestra del tejido hasta su observació e el microscopio, o so alterados. Especial cuidado deberá teerse e cuato al ajuste de: osmolaridad, ph, tiempos de fijació, deshidratació e ifiltració y tamaño de la muestra por procesar. Cosideracioes sobre los cortes E estereología, u corte se defie como: el producto del deslizamieto del filo de la cuchilla sobre u bloque de parafia o resia que cotiee el objeto e estudio. 8 La vetaja de utilizar cortes es que expoemos el iterior del tejido si alterar su estructura itera. Los cortes debe de hacerse siempre del mismo grosor e el mismo estudio; de esta maera su valor se covertirá e ua costate Muestreo: las medicioes estereológicas se basa e la probabilidad que existe de que la estructura e estudio, presete e u corte, coicida co el apropiado sistema de prueba. 13 E cosecuecia, existe ua demada rigurosa de u adecuado muestreo de los diferetes iveles o subcompartimetos celulares y tisulares. Además, se debe teer especial cuidado al calcular tato el úmero de bloques de tejido que será cortados, así como al seleccioar la zoa represetativa del corte por muestrear. 2. Tamaño de la muestra: cico casos o especímees por grupo puede ser suficietes para la realizació del estudio estereológico. Se recomieda que se utilice Tipo de muestreo a) Muestreo al azar: u corte al azar es aquel que se practica si tomar e cueta igú águlo de orietació etre el plao del corte y el objeto e estudio (órgao, tejido, orgaela). U corte se practica al azar, e el setido estereológico, cuado el objeto e estudio se ecuetra: i) distribuido e todos los iveles y e cualquier direcció del espacio que lo cotiee (órgao o tejido), y ii) si la distribució del objeto es totalmete homogéea, es decir, o tiee periodicidad iherete que pudiera requerir u muestreo especial. 8,13 Si cosideramos u tejido icrustado e u bloque de parafia para microscopía de luz o e u bloque icluido e resia para trabajar microscopia electróica, se podrá costatar que éste puede ser cortado e u úmero casi ilimitado de formas: a diferetes escalas y e diferetes direccioes. E este tipo de muestreo se asume que el objeto e estudio se ecuetra de maera represetativa e todas las posibilidades de orietació del corte y que existe e cada corte co la misma probabilidad. b) Muestreo sistemático: el muestreo sistemático es aquel e el cual la muestra se toma siempre a distacias periódicas e el órgao, tejido o célula, co lo que se evita muestrear repetidas veces e el mismo lugar. Weibel 8 propuso u método de muestreo sistemático para usarlo cuado se tomara fotos e estudios ultraestructurales; por ejemplo, cuado se iicia el coteo, se escoge la misma esquia de los cuadros que compoe la rejilla que sostiee el listó de cortes ultrafios. c) Muestreo e sistemas celulares ordeados: el sistema apropiado de muestreo se hace más difícil cuado el objeto e estudio o se ecuetra distribuido homogéeamete, sio que muestra ua distribució irregular; como ocurre co frecuecia e los sistemas celulares. Weibel 8 clasificó a los arreglos heterogéeos de los sistemas celulares e 5 patroes: Patología Revista latioamericaa Volume 50, úm. 2, abril-juio,

6 Pérez Olvera O y col. i. Estructuras arregladas e capas, como es el caso del cartílago. El tejido cerebral costituye uo de los mejores ejemplos de este tipo. ii. Estructuras arregladas de maera fasciculada; a este tipo perteece las estructuras celulares alargadas co u arreglo más o meos paralelo, por ejemplo: músculo esquelético y tejido ervioso. iii. Estructuras ramificadas: a este tipo perteece el tejido vascular como las arterias, veas y capilares, así como tambié los sistemas de coductos de las gládulas exócrias y el arreglo de las vías aéreas de los pulmoes. iv. Estructuras de tipo polarizado: se preseta pricipalmete cuado los dos lados opuestos de ua estructura so diferetes debido a su fucioalidad. Éste es el caso de estructuras lamiares tales como las superficies epiteliales. Esta polaridad usualmete resulta e la formació de u gradiete de estructuras detro de ua misma bada, de tal forma que las células que se ecuetra e ua de las superficies tiee composició diferete de las del lado opuesto. v. Estructuras periódicas: resulta de u arreglo secuecial de uidades idéticas. U ejemplo claro es el músculo estriado, e el cual las miofibrillas está costruidas por elemetos estrictamete idéticos; las sarcómeras, que preseta simetría bilateral, debido a la itercoexió de actia y miosia, y se ecuetra alieadas de maera periódica. La periodicidad tambié se preseta e estructuras lamiares como e el caso del arreglo del hueso lamelar. vi. E el muestreo de estructuras periódicas se preseta alguos problemas, especialmete si además de la periodicidad se maifiesta tambié la aisotropía (grado de ordeamieto), como e el caso del músculo. El muestreo, los cortes practicados y las fotografías se hará depediedo de la orietació, la periodicidad y el grado de aisotropía. d) Problemas que surge al aplicar los métodos estereológicos e sistemas aisotrópicos: por aturaleza, las células so aisotrópicas, ya que para llevar a cabo sus fucioes requiere de ua cierta orietació co respecto al espacio que ocupa. La cacelació de la aisotropía es u prerrequisito esecial para la aplicació de métodos estereológicos e tejidos biológicos. 15 Si la aisotropía o se elimia de maera atural, como e el caso de las superficies epiteliales y el músculo esquelético, es muy importate la selecció del sistema de prueba. E u sistema isotrópico, todos los águlos co los que se corta u espécime so iguales, mietras que e u sistema aisotrópico el úmero de iterseccioes será pequeño si el águlo es 0 (cortes trasversales) y será mayor cuado el águlo sea de 90 (cortes logitudiales). Esto precisamete puede servir para saber el grado de aisotropía de la estructura e estudio, ya que se puede cotar las iterseccioes paralelas al eje de aisotropía (I L0 ), y las perpediculares (I L90 ). Etre más pequeño sea el valor de la relació I L0 / I L90, será mayor el grado de aisotropía. e) Cortes verticales y el sistema cicloide: E la determiació de la desidad de superficie, se preseta problemas co los tejidos co u alto grado de aisotropía. 16 El grado de aisotropía e estereología se rompe por medio de dos métodos: i) haciedo cortes co u águlo de orietació de 45 co respecto al eje preferecial que muestre el tejido y ii) utilizado cortes verticales (paralelos al eje de orietació) y aplicado el sistema cicloide. U corte vertical se defie como u corte perpedicular al plao horizotal; típicos ejemplos de cortes verticales de estructuras celulares so los siguietes: ai) cortes logitudiales del tejido muscular esquelético; bi) cortes logitudiales de los diferetes epitelios; ci) cortes logitudiales de u órgao tubular (por ejemplo, el itestio). 16 Para hacer u corte vertical, la estructura e estudio debe de teer u eje preferecial e idetificable de orietació. Los típicos sistemas de prueba para este tipo de cortes so rejillas trasparetes que cotiee líeas cicloides co u águlo costate que implica ua orietació de 45 (corte perpedicular) co respecto al eje vertical (Figura 7). 17 ( ) = 2 p / l I i P i E dode: = desidad de superficie 2 2 = costate (p/l) = logitud de las líeas curvas de la rejilla 68 Patología Revista latioamericaa Volume 50, úm. 2, abril-juio, 2012

7 Métodos estereológicos y su aplicació e biología celular estudio deberá ser lo más fiel posible, ya que ua omisió podría repercutir e los cálculos fiales. 20 La descripció, hecha por Weibel 8,13 del muestreo e cascada, tomó como modelo multiiveles de hígado (Figura 8). Figura 7. Pérez-Olvera. Corte vertical de colo, tició de PAS, co el sistema de prueba cicloide usado para determiar desidad de superficie e estructuras celulares aisotrópicas (ver Baddeley et al., 1986). I i = putos de itersecció de las líeas curvas co la estructura e estudio P i = putos totales de la rejilla Esta fórmula se aplica sólo cuado se utiliza el sistema cicloide e los cortes verticales. f) Muestreo e cascada o multiiveles: otro tipo de arreglo que preseta tambié alguos problemas e el muestreo es el que se refiere a estructuras ramificadas que además revela u gradiete coforme se bifurca. El gradiete e este tipo de elemetos tubulares geeralmete muestra ua jerarquía que requiere de u muestreo e cascada o multiiveles i. Cuado se desea estimar u parámetro estereológico que se ecuetra defiido e ua fase que requiere de ua amplificació fial alta (por ejemplo, mitocodrias o capilares), se debe hacer u muestreo e multiiveles para crear u gradiete de aumetos, hasta obteer la amplificació fial de iterés. 19 Para llevar a cabo u bue muestreo e cascada es requisito primordial coocer de atemao la estructura geométrica de la estructura celular de iterés, así como escoger correctamete el aumeto al cual se hará las cuatificacioes. Además, la medició del volume del órgao e Los sistemas de cómputo Detro de los sistemas de cómputo utilizados se ecuetra el aalizador de imágees. El pricipio de su fucioamieto fue establecido desde hace ya varias décadas. Cosiste e lo siguiete: u microscopio que tiee adaptada ua cámara de video, coectada a u moitor (co posibilidad de coectarse tambié a ua videograbadora), y ua computadora que cueta co los programas específicos para cada parámetro estereológico por medir. Existe dos maeras por medio de las cuales ua image puede ser procesada: a) trasferir la iformació de la image completa a la memoria y procesar la iformació posteriormete co u software; b) icorporar previamete u programa ad hoc que permita evaluacioes imediatas y futuras de determiadas imágees. La vetaja de utilizar el aalizador de imágees salta a la vista, ya que se puede hacer u úmero muy grade de coteos, co ua gra exactitud y e muy corto tiempo. Depediedo de la calidad del sistema de cómputo utilizado se puede evitar deformacioes de la image que, por ejemplo, la haga más reducida, arrugada, o más agradada. El desarrollo de equipos y programas más rápidos, co u costo meor y accesible, hará más eficaz la automatizació y el aálisis de imágees. Figura 8. Pérez-Olvera. Muestreo e cascada tomado como ejemplo el hígado. (ver Weibel ER, 1979). Patología Revista latioamericaa Volume 50, úm. 2, abril-juio,

8 Pérez Olvera O y col. El método del disector fisico Ua forma de cotar partículas e u corte grueso de tejido (25 a 50 micras), cosiste e utilizar diferetes y sucesivos plaos focales y disecar visualmete las partículas presetes e u área tridimesioal determiada. 8 A este método se le cooce como el disector óptico. La aplicació de este método tiee muchos icoveietes, como so los diferetes tipos de tejidos, y la iexactitud que se puede presetar e las observacioes microscópicas. Si embargo, co el método del disector físico se puede cotar el úmero de partículas coteidas e u corte de tejido para determiar la desidad umérica (N V ). Tiee la vetaja de que e él o es ta importate la orietació del corte y que tampoco importa el tamaño y la forma de las partículas. 8 Es muy importate y ecesario coocer el grosor del corte. Para poer e práctica el método del disector físico se requiere utilizar dos plaos paralelos, los cuales se puede obteer, por ejemplo, de dos cortes adyacetes de u bloque de parafia (Figura 9); a uo de los cortes se le cooce como plao de referecia y al corte opuesto o complemetario como look up plae. E el corte que se seleccioe como plao de referecia se delimita u cuadrado o u rectágulo, marco de coteo, cuya área (A) debe ser medida. La figura geométrica que se seleccioe utilizar se debe trazar co dos lados co raya cotiua y dos lados cotralaterales co raya iterrumpida. Es muy importate determiar la distacia d que separa a ambos cortes para poder calcular el úmero de partículas que se ecuetra coteido etre ellos. E la práctica se tiee que seguir los siguietes lieamietos: a) solamete se cuatifica aquellas partículas que está presetes e el plao de referecia si que lo esté e el plao look up; b) solamete se cueta aquellas partículas que se ecuetre coteidas detro de los límites del marco de coteo; c) se cueta úicamete las Figura 9. Pérez-Olvera. Bloque de parafia dividido e seis cortes paralelos y sistemáticos. Para aplicar el disector físico se toma 2 cortes adyacetes, 1 y 2. Al corte o.1 se le toma como plao de referecia y se le delimita el marco de coteo. Al corte o. 2 se le cosidera como plao look up. partículas que toca la raya iterrumpida; d) o se puede cotar las partículas que toca la raya cotiua, o sea la líea prohibida; e) para determiar el úmero de partículas, se aplica la siguiete fórmula: 21 Dode: N V = desidad úmérica Q -1 = úmero de veces e que aparece la estructura e estudio A = área del marco de coteo t = grosor del corte AGRADECIMIENTOS Los autores agradece por su colaboració e dar formato al escrito a Ricardo Eloi Arellao Pérez y a Agélica Leticia Serrao Ahumada. REFERENCIAS 1. Cruz-Orive LM. Avaces recietes e estereología y su aplicació e biología celular. Actas del II Cogreso de la Sociedad Española de Biología Celular. E-Barceloa 1987;2: Delesse MA. Procedé mécaique pour détermier la compositio des roches. C,R, Hebd Séa Acad Sci Paris,1847;25: Glagoleff AA. O the geometrical methods of quatitative mieralogic aalysis of rocks. Trudy Ist Prikl Mier Metall 1933;59: Charlkley HW. Methods for the quatitative morphologic aalysis of tissues. J Nat Cacer Ist 1943;4: Saltikov SA. Stereometrische Metallographie.Leipzig. VEB Deutscher Verlag 1945; Smith CS Guttma L. Measuremet of iteral boudaries i three dimesioal structures by radom sectioig. Tras Metall Soc AIME 1953; Heig A. Bestimug der oberfläche beliebig geformeter körper mit besoderer awedug auf körperhaufe im mikroskopische bereich. Microskopie 1956;11: Weibel ER. Stereological Methods. Practical Methods for Biological Morphometry. Vol.1. Lodres, Academic Press, 1979; Wicksell SD. The corpuscle problem I. Biometrika 1925; De Hoff RT, Rhies FN. Quatitative Microscopy. Nueva York, McGraw-Hill, 1968; De Hoff RT, Rhies FN. Determiatio of umber of particles per uit volume from measuremets made o radom plae sectios: the geeral cylider ad the ellipsoid. Tras Metall Soc AIME 1981;221: Wicksell SD. The corpuscle problem II. Biometrika 1926; Weibel ER. Stereological Methods. Theoretical Foudatios Vol.2. Lodres, Academic Press, 1980; Patología Revista latioamericaa Volume 50, úm. 2, abril-juio, 2012

9 Métodos estereológicos y su aplicació e biología celular 14. Cruz-Orive LM, Weibel ER. Samplig desigs for stereology. J Microsc 1981;122: Cruz-Orive LM, Huziker EB. Stereology for aisotropic cells: applicatio to growth cartilage. J Microsc 1986;143: Baddeley AI, Guderse HJG, Cruz-Orive LM. Estimatio of surface area from vertical sectios. J. Microsc 1986;142: Phylofsky EM Hilliard JE. The measuremet of the orietatio distributio of lieal ad areal arrays. Quart. J Appl Math 1969;27: Hyde DM, Buss DD. Morphometry of the coroay microvasculature of the caie left vetricle. Am J Aat 1986;177: Huziker EB, Cruz-Orive LM. Cosistet ad efficiet delieatio of referece space for light microscopical stereology usig a laser microbeam system. J Microsc 1986;142:1, Scherle WF. A simple method for volumetry of orgas i quatitative stereology. Mikroskopie 1970; Mayhew T.M., Guderse HJG. If you assume, you ca make a ass out of u ad me : a decade of the dissector for stereological coutig of particles i 3D space. J. Aat 1996;1-15. Patología Revista latioamericaa Volume 50, úm. 2, abril-juio,