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1 Memoria de Prácticas 1º curso Grado de Biología USC

2 Curso Coordinadores: Óscar J. Cordero, Ana Viñas, Jaime Gómez-Márquez Autores: Emilia Rebolledo, Rosa Ana Sueiro, Francisco de la Torre, María Teresa Herrera, Javier Sampedro, Fátima Adrio, Francisco Salgado, Jesús Aboal, Carmen Leirós, Carmen Bermejo

3 ÍNDICE DE CONTENIDOS 1. MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIONES, Y BIENESTAR ANIMAL TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS TÉCNICAS DE CROMATOGRAFÍA Y ESPECTROFOTOMETRÍA TÉCNICAS HISTOLÓGICAS Y MICROSCOPIA TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN Y ELECTROFORESIS MEDIO FÍSICO Y TÉCNICAS DE CARTOGRAFÍA MÉTODO CIENTÍFICO Y TÉCNICAS DE MUESTREO CONTENIDOS DE BIBLIOTECA

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5 1. MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIONES, Y BIENESTAR ANIMAL (código calendario de prácticas: FA)

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7 MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIONES, INSTRUMENTOS BÁSICOS DE MEDIDA BALANZAS DE LABORATORIO Y PIPETAS 1. Objetivo 1.1 Consideraciones prácticas y manejo de una balanza de precisión de calibración externa. 1.2 Consideraciones prácticas y manejo de pipetas. Pipetas automáticas, fijas y variables. Pipetas repetitivas 2. Introducción La fisiología y otras ramas de la biología son ciencias cuantitativas que requieren de un sistema de medición estandarizado (SI: sistema internacional de unidades) e instrumentos de medición precisa. 2.1 Balanzas de laboratorio Uno de los instrumentos de medida más usados en el laboratorio es la balanza, utilizada para medir cantidades pequeñas de masa. La masa, propiedad característica de los cuerpos, es la cantidad de materia de una sustancia o material. Concepto diferente al de peso: fuerza de la atracción gravitatoria que la Tierra ejerce sobre la materia. La balanza compara la masa desconocida de una sustancia con la masa de un patrón o patrones de referencia (internos o externos), sometidas ambas a la misma aceleración debida a la gravedad. Al proceso de comparar masas se denomina pesada. El rasgo que define a las balanzas de laboratorio es el de la precisión junto al de alta resolución. Una vez calibradas, tienen también un alto grado de exactitud. 3

8 MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIONES, Exactitud: grado de concordancia entre el valor real y el valor medido. Precisión: capacidad de dar el mismo resultado en mediciones diferentes realizadas en las mismas condiciones. Grado de concordancia o repetitividad de un resultado. Una balanza será precisa cuando diferentes medidas de una misma magnitud sean muy parecidas. Una medida común de la variabilidad es la desviación estándar de las mediciones. Resolución: incremento de peso más pequeño que permite diferenciar una medida de otra Legibilidad: división más pequeña en la pantalla de la balanza Tipos de balanzas Las balanzas de laboratorio varían en su capacidad máxima de carga y en su legibilidad, y se clasifican como 1. Microbalanzas: capacidad de 0,5-3 g; legibilidad de 0,001 mg 2. Balanzas semimicro: capacidad g, según la casa comercial, y legibilidad de 0,01 mg 3. Balanzas analíticas: g y legibilidad de 0,1 mg 4. Balanzas de precisión: capacidad de carga de g; legibilidad 0,001g- 0,1 g Microbalanza Balanza analítica Balanzas de precisión Algunas balanzas, del tipo 2-4, tienen capacidad y legibilidad dual: pueden aumentar su capacidad disminuyendo su legibilidad o disminuir su capacidad y aumentar su legibilidad. 4

9 MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIONES, Consideraciones prácticas en medidas de masa 1. Localización de la balanza a) En una sala con una entrada, el mínimo número de ventanas. Evitar la luz directa del sol y corrientes de aire. Evitar choques y vibraciones. Si las balanzas están ubicadas en lugares con alto grado de vibración, se recomienda colocarlas sobre mesas antivibraciones (fabricadas en granito masivo, la amortiguación por aire evita todo tipo de oscilaciones y vibraciones de una forma efectiva). b) Mantener la temperatura de la sala constante. Humedad entre 45-60%. c) Realizar las medidas lejos de fuentes de calor y de aparatos que utilicen ventiladores. 2. Cuidados básicos a) Comprobar que la cámara de medida y el plato estén limpios b) Verificar siempre la nivelación de la balanza c) Conectar y esperar tiempo de calentamiento. Si se deja en el modo stand by se evita posteriores esperas d) Usar siempre un pesasustancias o frasco de la menor medida posible, limpios y secos e) No usar frascos de plástico cuando la humedad esté por debajo del 30-40% f) La temperatura del frasco y su contenido deben de estar a la misma temperatura del ambiente de la cámara de medida. Las diferencias de temperatura causan corrientes de aire g) Evitar el contacto directo de los dedos al poner o sacar los pesasustancias o frascos de la cámara de medida h) Poner el pesasustancias o frasco en el centro del plato de medida i) Verificar si el mostrador indica cero al empezar la operación. Tarar la balanza si fuese necesario j) Calibrar la balanza regularmente si los patrones de referencia son externos. Las balanzas analíticas de precisión que utilizan patrones internos pueden calibrarse automáticamente Ejercicio 1. Nivelación, calibración y precisión de una balanza Denver Maxx Preparación de 100 ml de NaCl 1 M 5

10 MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIONES, 2.2 Pipetas En el laboratorio, la medición precisa del volumen es tan importante como la medición precisa de la masa. La medición fiable del volumen se realiza con una pipeta, una bureta o un matraz aforado. Las pipetas permiten la transferencia de volúmenes medidos exactamente de un recipiente a otro Tipos de pipetas de uso común en el laboratorio 1. Aforadas: transfieren un sólo volumen fijo, las hay desde 0.5 a 200 ml 2. Graduadas: transferencia de 0.1 a 50 ml Ambas se llenan hasta la marca de calibración. La superficie alta de un líquido contenido en un tubo estrecho presenta una marcada curvatura o menisco. Es una práctica común usar la parte inferior del menisco de los líquidos acuosos como el punto de referencia en la calibración y empleo de las pipetas. El llenado de las pipetas nunca se debe de hacer aspirando con la boca. Existen accesorios auxiliares para macropipeteado que facilitan la operación de carga y descarga. Pipeta aforada Pipeta graduada Aspirador Macro de Brand Aspiradores de seguridad Dentalab La transferencia se realiza apoyando la pipeta en el borde del recipiente recibidor y nunca se sopla el líquido residual. 6

11 MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIONES, Ejercicio 2. Manejo de aspiradores de seguridad de pipetas de la casa Dentalab. 1. Aspiración: Gire la rueda hacia arriba y aspire, sin producir burbujas, hasta situarse un poco por encima de la marca de calibración. Desplace lentamente la rueda en sentido contrario para el ajuste de la pipeta. Preste atención al menisco. recibidor. 2. Vaciado: Presionar la palanca una vez que la pipeta esté dentro del tubo o recipiente 3. Pipetas automáticas: micropipetas y macropipetas a) Micropipetas: transferencia de volúmenes de microlitros de líquido - monocanal de volumen fijo: único volumen de transferencia, existen distintas pipetas que cubren el intervalo entre 1 μl y 1000 μl - monocanal de volumen variable: elección del volumen de transferencia mediante desplazamiento de un micrómetro de ajuste localizado en la parte delantera o superior del dispositivo. Poseen un indicador del volumen seleccionado Con un número reducido de aparatos se cubre el intervalo entre 0,1 μl y 1000 μl - multicanal: igual que la anterior pero dispensando 4, 8 ó 12 veces simultáneamente el mismo volumen. Intervalo entre 0,5-300 μl Micrómetro Indicador de volumen Monocanal fija y variable Multicanal y variable b) Macropipetas: transferencia de volúmenes de mililitros de líquido - monocanal de volumen variable: hasta 2, hasta 5 o hasta 10 ml 7

12 MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIONES, El uso adecuado de las pipetas automáticas está asociado a la elección de la punta de pipeta correspondiente. N: 0,1 20 μl A: 0,5 20 μl B: μl C: μl D: μl E: 0,5 5 ml * Las más comunes son la B y la D, puntas amarillas y azules respectivamente Ejercicio 3. Manejo de carga y descarga de pipetas automáticas. 1. Elija una pipeta de volumen variable de las disponibles en el laboratorio 2. Seleccione el volumen deseado girando con cuidado el micrómetro. Nunca supere la capacidad máxima de la pipeta 3. Inserte la punta desechable adecuada a la pipeta elegida 4. Oprima el botón pulsador situado en la parte superior de la pipeta hasta un primer tope. Esta operación desplaza un volumen de aire conocido en la punta desechable 5. Inserte la punta desechable dentro del líquido, agua destilada en nuestro caso, y libere la presión sobre el botón pulsador. Este hecho aspira el líquido por la punta 6. Coloque la punta sobre la pared del recipiente recibidor y oprima el botón pulsador hasta el primer tope. Después de un segundo, oprima el botón hasta un segundo tope para vaciar completamente la punta. 7. Expulsar la punta desechable 8. Practique hasta conseguir el dominio de la pipeta 9. Cuando esté seguro pase al ejercicio siguiente 8

13 MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIONES, Ejercicio 4. Comprobación del pipeteo por medida gravimétrica (balanza Denver Maxx). 1. Utilice una pipeta de 1 ml fija o variable 2. Utilizar como líquido de transferencia agua destilada 3. Situar un vaso de precipitados de 25 ml sobre la balanza y ajustarla a cero 4. Pipetear en el vaso un mililitro 5. Anote su masa 6. Vuelva a tarar la balanza y añada 1 ml más 7. Anote su masa 8. Repita la operación hasta completar 5 muestras 9. Cambie la pipeta con un compañero e inicie el proceso desde el punto 3-8 El uso de pipetas automáticas exige una comprobación regular de la exactitud y precisión de las mismas Exactitud: indicada por E = diferencia entre el valor medio y el valor nominal referida al valor nominal en % El control de la exactitud se realiza mediante control gravimétrico y aplicando un factor de corrección Z Z = 1,0032 μl/mg si el control se realiza a una temperatura de 21,5 ºC a una presión atmosférica de 1013 mbar y con agua destilada Precisión: indicada por el coeficiente de variación y definido éste como la desviación estandard en %, referida al valor medio. Ejercicio 5. Simulación del control de la exactitud de la pipeta automática de 1 ml, utilizando los datos obtenidos en el ejercicio 4 9

14 MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIONES, 4. Pipetas automáticas repetitivas En el laboratorio se dispone también de pipetas automáticas repetitivas para la dosificación en serie o para situaciones que requieren transferencia repetida de un volumen particular Permite dosificar repetitivamente un volumen determinado con una sola carga Palanca de dosificación Mando selector de volumen El número de repeticiones depende del volumen seleccionado en el mando deslizante de ajuste y del combitip corespondiente (ver tabla 1) Palanca de bloqueo y de llenado combinados Tabla 1 Ejercicio 6: Manejo de una pipeta repetitiva 10

15 MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIONES, INSTRUMENTO BÁSICO DE MEDIDA PEACHÍMETRO O PHMETRO 1. Objetivo 1.1 Consideraciones prácticas, calibración y manejo de un phmetro 2. Introducción El phmetro, portátil o de sobremesa, es un instrumento utilizado en los laboratorios químicos y biológicos para medir el ph de las disoluciones. El ph determina muchas de la características notables de la estructura y actividad de las biomacromoléculas y, por tanto, el comportamiento de células y organismos. El phmetro se utiliza también para determinar el ph de aguas, suelos, bebidas y alimentos. Los instrumentos portátiles facilitan la medida en campo. Al phmetro, que mide la diferencia de potencial existente entre dos electrodos, se conecta un electrodo combinado de ph: un electrodo de vidrio (indicador) y un electrodo de referencia montados ambos en un solo cuerpo. Se constituye así el sistema necesario para la medida de ph, que debe ser siempre precedida de una calibración del equipo con disoluciones tampón de ph conocido. Si el phmetro ha de ser informado de la temperatura de la muestra se conecta también un sensor de temperatura, a no ser que el electrodo disponga del mismo. La medida del ph se ve afectada por la temperatura. Electrodo combinado de ph En el dibujo se muestran los componentes y ubicación de las partes esenciales de un electrodo combinado de ph, con el electrodo indicador en el centro y el de referencia en el exterior. 11

16 MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIONES, Conector Tipos de elementos de referencia Cable Cabezal Para emulsiones De penetración Orificio de relleno De superficie Tipos de electrodos Para micromuestras Electrolito de referencia: (KCl 3M) puente salino entre el electrodo y el exterior. Impide que los componentes de la disolución objeto de medida se mezclen con los del electrodo de referencia. Elemento de referencia: cristales de AgCl encapsulados y con barrera a iones Ag + Diafragma: punto de unión entre electrolito y muestra. De cerámica porosa, que permite un pequeño flujo de electrolito hacia el exterior estableciendose el circuito eléctrico para medición Electrolito interno: HCl 0,1M saturado con AgCl Membrana de vidrio: sensible a H 3 O + Electrodo con sensor de temperatura 12

17 MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIONES, 3. Consideraciones prácticas 1. Si el electrodo de ph es rellenable, verificar el nivel de electrolito de referencia. Éste debe llegar cerca del orificio de llenado, asegurando un buen flujo de electrolito a través del diafragma. 2. Verificar la ausencia de burbujas de aire en la zona de la membrana, si se observa alguna sacudir el electrodo cuidadosamente 3. Limpiar el electrodo con agua destilada. No secar con un paño, utilizar un papel sin pelusa, aplicándolo suavemente para evitar cargas electrostáticas, y retirar el exceso de agua 4. Si las mediciones se realizan a temperatura ambiente sumergir el electrodo hasta cubrir como mínimo el diafragma 5. Si las mediciones se realizan a temperatura distinta de la ambiente sumergir el electrodo hasta cubrir el sensor de temperatura y el elemento de referencia. 4. Calibración 1. Se recomienda una calibración diaria antes de proceder a las mediciones. Si se realizan muchas es aconsejable repetir la calibración cada 2 ó 3 horas, para compensar la posible deriva del electrodo (potencial de asimetría) o una pérdida de sensibilidad del mismo (pendiente) 2. Con el phmetro conectado, y el electrodo sumergido en disolución tampón de ph conocido (7.02 generalmente), esperar el tiempo indicado en las instrucciones del aparato antes de proceder a la calibración 13

18 MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIONES, 3. Calibrar siempre con disoluciones tampón frescas. Estas se alteran con el paso del tiempo, con el calor, la luz y, especialmente, con la contaminación 4. No devolver al frasco del tampón la disolución utilizada. Utilizar frascos pequeños para la calibración 5. Entre medidas, lavar con agua destilada y utilizar un papel sin pelusa para retirar el exceso de agua 6. Es recomendable para la calibración, así como para las mediciones, utilizar agitación. Un imán y un agitador magnético proporcionan rapidez y repetibilidad en las lecturas. Tipos de calibración 1. En un punto, cuando se miden valores de ph cercanos al valor del tampón utilizado 2. En dos puntos, la habitual. Se recomienda como primer tampón el de ph 7 y como segundo tampón puede utilizarse el de ph 4 ó 9 dependiendo de si se trabaja en la zona ácida o alcalina. Se corrige el potencial de asimetría y la pérdida de sensibilidad del electrodo 3. En tres puntos: si se mide en toda la escala de ph. Primer punto el tampón de ph 7, segundo y tercer punto dos de los valores restantes (2, 4.01, 9.21, 10.9 a 25ºC). Se compensa el potencial de asimetría y sensibilidad tanto en la zona ácida como en la alcalina Ejercicio 1. Calibración en dos puntos de los equipos, marca CRISON, disponibles en el laboratorio, y siguiendo el manual de instrucciones del equipo correspondiente. DISOLUCIONES Y CONCENTRACIONES DISOLUCIONES STOCK, DISOLUCIONES DE TRABAJO, DISOLUCIONES TAMPÓN 1. Objetivo 1.1 Consideraciones prácticas y preparación de disoluciones usadas en la experimentación 1.2 Preparación de una disolución tampón y medida del ph 14

19 MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIONES, 2. Introducción La experimentación biológica utiliza técnicas de laboratorio que pueden ser de observación, analíticas y /o bioensayo. El bioensayo puede realizarse in vivo, utilizando organismos intactos, o in vitro, utilizando órganos, tejidos o suspensiones de células aisladas. El bioensayo es una técnica muy utilizada en Fisiología Animal. Los estudios requieren habitualmente el uso de disoluciones cuya concentración iónica y osmolaridad mantengan la integridad y funcionalidad celular, y en los in vitro, además, que la disolución esté tamponada. Es decir, que contenga un sistema tampón o buffer para amortiguar las variaciones de ph que pudieran producirse a lo largo de un trabajo experimental, al igual que hace el plasma. 3. Disoluciones y concentraciones En el laboratorio la concentración de las disoluciones se expresa de dos formas: concentración molar o concentración porcentual. Concentración molar, es el nº de moles de una especie contenida en un litro (1L) de disolución. Unidad de concentración molar = molaridad (M), dimensiones mol.l -1 o mmoles.ml -1 de disolución. 1 mmol = 10-3 mol Concentración porcentual (partes por cien): tres formas de expresarla a) tanto por ciento en peso (p/p): peso del soluto. peso de la disolución b) tanto por ciento en volumen (v/v): volumen del soluto. volumen de disolución c) tanto por ciento en peso/volumen: peso del soluto (g). volumen de la disolución (ml) Ejercicio 1. - Preparar 100 ml de NaCl 154 mm - Preparar una disolución de NaCl 0.9% (p/v) Qué observación destacaría? Disoluciones madre y disoluciones de trabajo 15

20 MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIONES, En el laboratorio, es habitual preparar las disoluciones de trabajo a partir de disoluciones concentradas, a las que se les llama disoluciones madre o disoluciones stock. Las disoluciones stock, además de proporcionar rapidez, disminuyen los posibles errores que se producirían durante continuas pesadas de los componentes de las disoluciones de trabajo. Para preparar disoluciones diluidas a partir de las concentradas se utiliza la siguiente ecuación, la cual se basa en que el nº de moles de soluto de la disolución diluida es igual al de moles en el reactivo concentrado. V concentrada. Moles/L concentrada = V diluida. Moles/L diluida,, es decir V 1.C 1 = V 2.C 2 Volumen en litros y concentración molar en moles/l O volumen en ml y concentración molar en mmoles/ml Ejercicio 2. Tomando como disolución stock la de NaCl 1 M, calcular el volumen que habría que tomar para preparar 10 ml de NaCl 150 mm 5. Disoluciones tampón Sistemas tampón o buffers son aquellas disoluciones cuya H + apenas varía al añadir ácidos o bases fuertes. Suelen ser mezclas binarias de un ácido débil y una sal del mismo ácido con base fuerte, o bien una base débil y la sal de esa base con un ácido fuerte. La eficacia amortiguadora del sistema depende de la proporción relativa de las formas disociada y sin disociar, siendo máxima cuando el cociente sal /ácido es próximo a la unidad. Esta proporción está relacionada con el ph por la ecuación de Henderson-Hasselbach. ph = pk + log sal / ácido El Tris-HCl es un tampón para medios biológicos de uso habitual en el laboratorio. Está compuesto de la base Tris-aminometano (Tris), y su sal cloruro de Tris. Sin embargo, no se suele comprar la sal, sino sólo la base, que se disuelve y se lleva al ph requerido añadiendo HCl. La cantidad de HCl no se suele medir con precisión, sino que es la necesaria para llevar la solución al ph deseado. 16

21 MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIONES, Ejercicio 3. Preparar 100 ml de Tris-HCl 0.1M a ph = 8, midiendo en el phmetro a temperatura ambiente 6. Disolución isotónica Una disolución en la que se pueden introducir las células sin que se vea alterado su volumen celular se denomina isotónica. Son disoluciones isotónicas (moleculares, electrolíticas o mixtas) las que tienen la misma osmolaridad que el plasma. Osmolaridad /L = M. M = concentración molar del soluto = nº de partículas en que se disocia el soluto cuando está en disolución Osmolaridad/L de una disolución constituida por un conjunto de solutos = suma de osmolaridades parciales Osmolaridad El movimiento pasivo de agua a través de una membrana semipermeable, y a favor de su gradiente de concentración, se denomina ósmosis. El grado de presión necesario para interrumpir completamente la ósmosis recibe el nombre de presión osmótica. La presión osmótica es proporcional al número de partículas disueltas / unidad de volumen líquido. La concentración de las disoluciones osmóticas en base al nº de partículas, se expresa en osmoles. Un osmol es la cantidad de soluto no disociado cuya presión osmótica corresponde a un mol. Cuando los no electrolitos se disuelven en un litro de agua, las moléculas individuales entran en solución separadamente, y cada una constituye una partícula disuelta. Como un mol de soluto tiene el mismo número de moléculas (nº de Avogadro), una disolución de glucosa 0.1M tiene el mismo nº de partículas que una disolución de urea 0.1M. Y ambas la misma presión osmótica = 0.1 osmoles. Cuando los electrolitos se disuelven en un litro de agua, las moléculas individuales se disocian en dos o más iones, cada uno de los cuales constituye una partícula disuelta. Así 0.1 mol de ClNa, que se disocia en Cl - y Na +, da lugar a dos partículas y, por lo tanto, ejerce una presión osmótica = 0.2 osmoles. Una disolución que contiene 1 osmol de soluto disuelto por litro de agua se dice que tiene una osmolaridad de 1 osmol/l. Ejercicio 4. Si la osmolaridad plasmática es de 0.3 Osmoles/L, una disolución de NaCl 0.15M es isotónica? Y una de Na 2 PO 4 1M? 17

22 MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIONES, 18

23 2. TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS (código calendario de prácticas: MICRO)

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25 TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS PRÁCTICA 1. Preparación de medios de cultivo y soluciones. Esterilización Esterilización La esterilización es la eliminación de todos los organismos presentes en un material, incluidas las esporas y otros agentes infecciosos. La metodología utilizada depende de la naturaleza del material que se va a esterilizar. Los principales métodos para destruir o eliminar microorganismos son los siguientes: 1. Calor húmedo. Esterilización por vapor Es el método más común, eficaz y cómodo de esterilización. El vapor de agua a elevadas temperaturas mata los microorganismos porque degrada los ácidos nucleicos y desnaturaliza las proteínas. El tiempo y la temperatura necesarios para la esterilización de los medios de cultivo y del material dependen de los microorganismos que se pretenden destruir, de la composición química de los medios, de la cantidad de material y del volumen de medio que se esteriliza. La esterilización por vapor se realiza en un autoclave, aparato similar a una olla a presión en la que el aire presente inicialmente en la cámara se expulsa quedando completamente llena de vapor de agua. La presión de vapor interna asciende hasta que se alcanzan 121º C de temperatura y 1,1 Kg/cm 2 de presión. En estas condiciones todas las formas vegetativas y endosporas se destruyen en minutos, aunque el tiempo estándar de esterilización es de 15 minutos. Por lo general, el autoclave se emplea para esterilizar medios de cultivo y soluciones acuosas no termolábiles, material de vidrio, plástico y metal. 2. Calor seco Es menos efectivo que el calor húmedo, necesitándose temperaturas más altas y tiempos más largos que con el calor húmedo para matar a los microorganismos. La muerte celular se produce debido a la oxidación de los componentes celulares y la desnaturalización de proteínas. Este tipo de esterilización se realiza en hornos especiales de esterilización y requiere un tiempo de exposición largo del material (por ejemplo, 2 horas a 160º C o 1 hora a 180º C). Se utiliza principalmente para la esterilización de material de vidrio (placas de Petri no desechables, pipetas, etc.) y metal, y en algunos casos para esterilizar productos en polvo, aceites y materiales similares. Una alternativa de esterilización con calor seco es la incineración, que se utiliza para la destrucción de material hospitalario contaminado, animales de experimentación, etc. En el laboratorio, la incineración se emplea para la esterilización de las asas de siembra metálicas antes y después de ponerlas en contacto con los cultivos. 19

26 TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS 3. Filtración Es el método alternativo a la esterilización por calor cuando se esterilizan líquidos termosensibles o gases. La filtración no destruye los microorganismos, sino que los elimina mecánicamente, combinando un proceso de retención y absorción. La técnica consiste en hacer pasar el líquido o gas a través de un material poroso, el filtro, con tamaño de poro demasiado pequeño para que pasen los microorganismos, pero suficientemente grandes para permitir el paso del líquido. Estos filtros retienen las bacterias, pero dejan pasar los virus. Los filtros que se utilizan normalmente en la esterilización de líquidos son el filtro de membrana de acetato de celulosa o nitrato de celulosa con un tamaño de poro de 0,45 y 0,22 μm. Éstos últimos son los que garantizan la eliminación de las bacterias, ya que las bacterias más pequeñas conocidas miden alrededor de 0,3 μm. Para facilitar el paso de las soluciones a través de los filtros de membrana se aplica presión o se hace vacío, teniendo presente que los recipientes de recogida de la solución filtrada deben estar estériles. Hay un tipo de filtro, denominado filtros de alta eficacia de retención de partículas de aire (HEPA, high-efficiency particulate air) que se utilizan en las cabinas de flujo laminar y de seguridad biológica porque permiten eliminar el 99,9 % de las partículas mayores de 0,3 μm presentes en el aire. 4. Radiaciones 4.1. Radiaciones no ionizantes. Luz UV. La radiación ultravioleta no produce ionización al incidir sobre una molécula, pero sí excitación de sus electrones, haciendo que reaccione de forma anómala. La acción bactericida más efectiva de la luz UV se produce a 260 nm, que es el máximo de absorción del DNA. La capacidad de penetración de la luz UV es muy baja, no pudiendo atravesar el vidrio o líquidos, por lo que sólo se utiliza para la esterilización de superficies (las cámaras de flujo laminar) o la esterilización de aire en quirófanos o salas asépticas. En algunos casos específicos también puede usarse para la esterilización de agua Radiaciones ionizantes. Rayos gamma y rayos X. Debido a su elevada energía, causan la ionización de las moléculas y la aparición de radicales libres altamente reactivos que destruyen componentes celulares como el DNA y las proteínas. Las radiaciones ionizantes, además de tener un mayor poder microbicida que la radiación ultravioleta, presentan un mayor poder de penetración, pudiendo esterilizar el interior de material empaquetado. Aunque son altamente efectivas contra formas vegetativas y endosporas, no siempre lo son contra virus. Debido a la peligrosidad del equipo de radiación, este tipo de esterilización se limita a las aplicaciones industriales a gran escala, empleándose para esterilizar material plástico, material farmacéutico (antibióticos, hormonas), etc. 20

27 TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS 5. Esterilización con agentes químicos La mayor parte de los agentes químicos antimicrobianos se utilizan en la desinfección y no destruyen las esporas, por lo tanto no son esterilizantes Sin embargo, en condiciones apropiadas, compuestos como el óxido de etileno o el glutaraldehido eliminan formas vegetativas y esporas, por lo que deben clasificarse dentro de los agentes esterilizantes. Estos compuestos se emplean en la esterilización de instrumentos y material de plástico. Medios de cultivo y soluciones Los medios de cultivo son las soluciones nutritivas que se usan en el laboratorio para el crecimiento y mantenimiento de los microorganismos. También se pueden emplear para demostrar una característica fisiológica o bioquímica del microorganismo (utilización de una fuente de carbono, producción de ácido, producción de gas, etc). Antes de su empleo, tanto los medios de cultivo como las soluciones y todo el material utilizado para la manipulación de los microorganismos deben estar estériles para evitar la entrada de microorganismos contaminantes. Tipos de medios de cultivo En función de su composición química se pueden dividir en: Medios definidos: se conocen la composición química exacta del medio. Permite conocer los compuestos que metaboliza el microorganismo estudiado. Medios complejos o no definidos: contienen algunos componentes cuya composición química se desconoce. En su preparación se suelen emplear peptonas (hidrolizados parciales de proteínas de la leche, carne, soja, levaduras), extractos de carne, de levadura u otras sustancias muy nutritivas pero no definidas químicamente. Resultan muy útiles y son los más utilizados porque un único medio puede satisfacer las necesidades nutricionales de diversos microorganismos. Tanto si se trata de medios definidos como complejos, hablamos de medios de cultivo líquidos o caldos y medios sólidos. Para pasar un medio líquido a medio sólido tan solo es necesario añadir un agente gelificante que permita al medio líquido solidificar: la adición de agar al 1,5 % al medio líquido es el procedimiento comúnmente empleado. Existen una serie de medios de cultivo cuya composición ayuda a establecer o poner de manifiesto determinadas propiedades de los microorganismos que pueden servir para su aislamiento y/o clasificación. En este caso hablamos de: Medios generales: permiten el crecimiento de la mayoría de los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos (ej: Triptona Soja agar, Agar Nutritivo, etc). 21

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