Objetivos del tema. El alumno... Aplicación. Comprensión. Conocimiento VI. TRANSCRIPCIÓN Y PROCESAMIENTO DEL RNA

Transcripción

1 Objetivos del tema VI. TRANSCRIPCIÓN Y PROCESAMIENTO DEL RNA El alumno... Revisará como se expresa la información genética, identificando los factores involucrados en este proceso: DNA y proteínas. Reconocerá los mecanismos por los que se lleva a cabo la maduración de los mensajeros. Conocimiento Comprensión Aplicación 1. Tipos de genes Conocerá los diferentes tipos de genes: los que codifican proteínas, los que codifican RNA ribosomal y RNA de transferencia Identificará los diferentes tipos de RNA: RNA mensajeros (mrna), RNA de transferencia (trna) y RNA ribosomales (rrna), sus características, abundancia en la célula y sus funciones. 2. Promotores 2.1. Conocerá las características y funciones de las secuencias procariontes. promotoras que definen el sitio de iniciación de la transcripción (+1) de mrna en procariontes: caja TATA (-10) Conocerá algunas otras secuencias involucradas en la 3. Síntesis de RNA en procariontes. 4. Las fases de la transcripción en procariontes. regulación de la transcripción de mrna en procariontes Analizará que la reacción de síntesis de RNA es en dirección 5-3, que requiere de ribonucleótidos, de un molde de DNA y de una RNA polimerasa Distinguirá la cadena codificante (con sentido +) de la cadena molde (sin sentido) Conocerá la composición de la RNA polimerasas de procariontes y la función de sus subunidades (factores sigma) Conocerá que los mrna tienen regiones no traducibles (5 UTR y 3 UTR) que son importantes en la regulación de su vida funcional Será capaz de transcribir una secuencia de mrna a partir de una secuencia de DNA en la que se indique cual es la hebra molde, la caja TATA y el sitio de inicio de la transcripción Conocerá los requerimientos para el inicio de la transcripción, identificando el complejo cerrado y el complejo abierto Comprenderá como ocurre la polimerización de ribonucleótidos durante el alargamiento de la hebra de mrna Distinguirá entre el tipo de terminación Rho dependiente y el tipo Rho independiente. X X X X X X X X X X X X

2 Objetivos del tema VI. TRANSCRIPCIÓN Y PROCESAMIENTO DEL RNA 5. Transcripción en eucariontes. 6. Inhibición de la transcripción. 7. Procesamiento posttranscripcional de RNAm de eucariontes. 8. Procesamiento posttranscripcional de RNAr y RNAt de procariontes y eucariontes. El alumno... Revisará como se expresa la información genética, identificando los factores involucrados en este proceso: DNA y proteínas. Reconocerá los mecanismos por los que se lleva a cabo la maduración de los mensajeros Conocerá las señales que controlan la transcripción en eucariontes: X secuencias consenso y secuencias intensificadoras Reconocerá que las RNA polimerasas I, II y III sintetizan diferentes X tipos de RNAs en eucariontes Reconocerá que para la síntesis de mrnas se requieren diferentes X factores proteicos (factores de transcripción) Comparará los tres pasos de la transcripción de eucariontes con los mismos pasos de procariontes Conocerá algunos inhibidores de la transcripción en procariontes X (actinomicina D, acridina, rifampicina) y en eucariontes ( -amanitina) Conocerá que los RNAs se transcriben como un transcrito primario X que debe ser madurado para ser funcional (procesamiento posttranscripcional) Reconocerá que existen secuencias en el RNA y factores proteicos X que participan en el procesamiento post-transcripcional Comprenderá que los mrnas de eucariontes se procesan por tres mecanismos: splicing (empalme), capping y poliadenilación Conocerá que el RNA puede ser catalítico. X 7.5. Conocerá que el mecanismo de "splicing" alternativo genera X diferentes mrnas que dan origen a diferentes proteínas (un gen codifica varias proteínas relacionadas) Comprenderá como son procesados los RNAs ribosomales: splicing, modificación de bases Reconocerá como son procesados los RNAs de transferencia: X splicing, modificación de bases, adición de CCA en el Conocerá que los rrna y trnas de procariontes también son X procesados post-transcripcionalmente. X X X Conocimiento Comprensión Aplicación

3 TRANSCRIPCIÓN

4 DOGMA CENTRAL

5 Tipos de genes Un gene es una secuencia de DNA que codifica: a) un polipéptido (RNA mensajero) a) un RNA (RNA ribosomal y RNA de transferencia)

6 Estructura química del RNA cadena sencilla

7 En el RNA el uracilo se aparea con la adenina el uracilo está en lugar de la timina

8 El RNA puede presentar diferentes tipos de estructura secundaria Dúplex Tallo - asa Región de cadena sencilla Protuberancia Burbujas internas Juntas Desapareamiento, simétrica, asimétrica Tres tallos, cuatro tallos

9 La transcripción es el proceso por el cual se sintetiza RNA Los RNAs más abundantes y más estudiados son: rrna trna mrna RNA ribosomal, componente estructural y catalítico del ribosoma RNA de transferencia, adaptador entre mrna y proteína RNA mensajero, codifica la secuencia primaria de una proteína

10 Otros tipos de RNA que se sintetizan en eucariontes snrna snorna scarna mirna sirna Otros no codificantes RNAs pequeños nucleares, funcionan en corte y empalme de intrones RNAs pequeños nucleolares, procesamiento y modificación de rrna RNAs pequeños de cajal, modifican snornas, snrnas, mirnas, regulan traducción específica micrornas, regulan la expresión genética RNAs pequeños interferentes, apagan la expresión de genes mediante degradación de mrnas específicos Otros RNAs no codificantes que funcionan en procesos diversos como síntesis de telómeros, inactivación del cromosoma X, transporte de proteínas, etc.

11 Producto de transcripción: RNA ribosomal PROCARIONTES: RNAr 23S: 2,904 nts. RNAr 16S: 1,542 nts. EUCARIONTES: RNAr 28S: 4,718 nts. RNAr 18S: 1,874 nts. Estructura secundaria del rrna

12 Producto de la transcripción: RNA de transferencia Región aceptora Asa anticodón Tamaño: nucleótidos

13 Producto de la transcripción: RNA mensajero El tamaño de los RNAs mensajeros es variable y depende del tamaño del gen que se transcribe. La estructura de los mrnas es variable y depende de la secuencia. Autoradiografía de mrna marcado radioactivamente con 32 CTP. Se observan los diferentes tamaños del mrna.

14 La transcripción es la síntesis de RNA a partir de un molde de DNA Micrografía electrónica de la síntesis de RNA ribosomal Dirección de la síntesis: 5 3

15 Mecanismo de transcripción Para la reacción química de la transcripción se requiere: La enzima RNA polimerasa DNA molde Ribonucleótidos (trifosfatados) ATP, GTP, CTP, UTP Proteínas o factores de transcripción

16 A diferencia de la replicación, en la transcripción... Solamente un fragmento de DNA, que corresponde a un gen, es copiado a RNA Sólo una de las dos cadenas de DNA es copiada a RNA DNA Cadena codificadora: 5 -ATTCCGATGTACGAGG-3 DNA RNA Cadena molde: 3 -TAAGGCTACATGCTCC-5 5 -AUUCCGAUGUACGAGG-3 La secuencia de la molécula de RNA que se sintetiza a) es complementaria y antiparalela a la cadena molde b) tiene la misma dirección y secuencia (U -> T) que la cadena codificante

17 La polimerización se lleva a cabo en dirección 5 3 La cadena que sirve de molde se lee en dirección 3 5

18 Solamente un fragmento de DNA, que corresponde a un gen, es copiado a RNA y sólo una de las dos cadenas de DNA es copiada a RNA Cómo sabe la RNA polimerasa cuál de las dos cadenas usará como molde? Cómo sabe la RNA polimerasa dónde comenzar a sintetizar? Cómo sabe la RNA polimerasa donde terminar de sintetizar? Quién abre la doble hélice de DNA?

19 En qué sitio del gen inicia la transcripción? El sitio donde se inicia la transcripción es el +1 Cómo reconoce la RNA pol el sitio para iniciar la transcripción? Es reconocido porque antes de él, hacia el 5, hay una región llamada promotor Esta secuencia de DNA no se transcribe, es decir no se sintetiza RNA correspondiente a esa región del DNA. El promotor sirve de señal de reconocimiento para que la RNA pol se una a esa región y lleve a cabo la transcripción

20 Estructura de los promotores procariontes Secuencias que se encuentran corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción. Hay secuencias muy conservadas en los promotores procariontes. 5 8 pb Secuencia -10 o caja Pribnow TATAAT Apertura de la cadena. Secuencia 35 TTGTCA Es la región de reconocimiento e interacción con el factor de la RNA polimerasa.

21 Secuencias consenso en promotores procariónticos Caja TATA

22 Las secuencia del promotor está referida a la cadena codificadora, no a la cadena molde El promotor Lac controla la expresión del gen lacz, pero no del gen laci. Observa que la posición de la caja TATA en el sitio -10 se representa sobre la cadena codificadora, es decir la que va de 5 a 3.

23 Los promotores tienen orientación

24 La dirección en la que se transcriben los genes puede variar sobre el cromosoma Las flechas azules indican la dirección en la que se transcribirá el mrna (siempre se sintetiza en dirección 5 3 ), por lo que se puede deducir cual es la cadena que sirve de molde.

25 La enzima que sintetiza RNA es la RNA polimerasa. Solo hay una RNA pol en E. coli y está formada por 4 subunidades : ensamblaje de las unidades y unión al promotor : sitio catalítico : se une al DNA y parte de la subunidad catalítica : reconoce el promotor específico

26 La estequiometría de subunidades en la holoenzima es 2 ' Núcleo de la enzima Cuando la subunidad se asocia al núcleo se forma la holoenzima

27 Modelo de la RNA polimerasa de E. coli a partir de los datos cristalográficos Núcleo de la enzima 2 Holoenzima 2

28 La subunidad sirve como nodo para ensamblar la RNA polimerasa holoenzima y esta función reside en el dominio N- terminal de la proteína. El domino C-terminal de la subunidad promotores que la tengan. interactúa con la región UP de los

29 Cómo reconoce la RNA pol cuáles genes debe transcribir? Porque existen diferentes factores que reconocen promotores específicos: Factores sigma

30 Las funciones de la subunidad El factor sigma selecciona los genes a transcribirse al facilitar la unión entre la RNA polimerasa y el promotor. Esta unión depende de la denaturalización local del DNA que permite la formación de un complejo de promotor abierto El factor polimerasa. se recicla, i.e. cuando se disocia puede ser usado por otra RNA Al unirse al promotor, la RNA polimerasa causa la apertura de al menos pb de la doble cadena de DNA. Esta burbuja de transcripción se mueve con la polimerasa exponiendo la cadena molde, de tal manera que puede ser transcrita.

31 Factores sigma ( ) Sigma 38: Regulate gene expression against external stresses.

32 La transcripción involucra tres etapas Inicio Alargamiento Terminación

33 RNA pol Holoenzima Complejo cerrado Complejo abierto Inicio de la transcripción El factor sigma determina la iniciación de la transcripción permitiendo que la RNA polimerasa se una fuertemente al promotor (COMPLEJO CERRADO) La doble hélice en esa región debe abrirse para permitir la lectura de la secuencia formando el COMPLEJO ABIERTO. Sigma se disocia El factor sigma se disocia de este complejo. Complejo de elongación La RNA polimerasa tiene un canal abierto al cual se une el DNA. Una vez que se unen al DNA, los dedos de la enzima se cierran alrededor del DNA.

34 Alargamiento 1.- Se disocia la subunidad de la RNA polimerasa. 2.- Comienza la adición de ppp G o ppp A, en el extremo 5 del RNA naciente. ATP GTP UTP CTP Sustratos + DNA (como molde) Polimerasa de RNA dirigida por DNA (Mg ++ ) npp i 5 3 pppapupcpcpcpgpu RNA (tipo, longitud y secuencia de este RNA dependen del gen de DNA que se está transcribiendo) El RNA que se va copiando del DNA se llama transcrito

35 ESTRUCTURA DE UNA CADENA DE RNA Se añaden ribonucleótidos polimerizándose la cadena a través de enlaces fosfodiéster (la cadena va creciendo en la dirección 5 > 3 )

36 Alargamiento Rebobinado RNA polimerasa Desenrollado 3 5 Hebra molde Hélice híbrida RNA - DNA Hebra codificadora 3 Punto de elongación ppp RNA naciente Desplazamiento de la polimerasa 4.- La burbuja de transcripción va avanzando, por un lado se abre el DNA duplex y por el otro se re-bobina. 5.- El RNA sintetizado va formando un híbrido (transitorio), con la cadena 3 5 del DNA

37 BURBUJA DE TRANSCRIPCIÓN

38 Alargamiento La subunidad contiene el sitio activo de la RNA polimerasa donde se forman los enlaces fosfodiéster Hay dos sitios en el DNA que interactúan con la RNA polimerasa: 1. Un sitio de unión débil que involucra la zona del DNA desnaturalizada y el sitio activo en la subunidad de la polimerasa. La interacciones son principalmente electrostáticas. 2. Un sitio de unión fuerte que involucra al DNA río abajo del sitio activo y lo conforman las subunidades y de la enzima. La subunidad une dos átomos de Zn 2+ que participan en la catálisis. Esta subunidad se une fuertemente al DNA.

39

40 Terminación Hay dos mecanismos de terminación de la transcripción 1. Mecanismo dependiente de la proteína Rho 2. Mecanismo independiente de la proteína Rho

41 Terminación: dependiente de la proteína Rho (trans) La proteína rho es un hexámero que hidroliza ATP en presencia de RNA. Se une al RNA que se está sintetizando y se mueve en dirección al sitio de síntesis. Desestabiliza al híbrido DNA RNA, facilitando así la terminación de la transcripción.

42 Terminación independiente de la proteína Rho (cis) La secuencia al final del gen contiene repeticiones invertidas que permiten la formación de una estructura de horquilla en el RNA. Hay una región rica en Adeninas, de tal forma que el híbrido DNA-RNA que se forma es débil y se disocia.

43 Transcripción en eucariontes

44 Diferentes tipos de RNA polimerasas Las tres RNA polimerasas en eucariontes: 1. RNA Polimerasa I sintetiza RNA ribosomal (rrna) 5.8S, 18S y 28S. 2. RNA Polimerasa II sintetiza RNAs mensajeros (mrna), RNAs pequeños nucleolares (snorna), micro RNAs (mirna), RNAs pequeños interferentes (sirna) y la mayoría de RNAs pequeños nucleares (snrna). 3. RNA polimerasa III sintetiza RNAs de transferencia (trnas), rrna 5S y algunos RNAs pequeños nucleares (snrnas).

45 Los promotores reconocidos por la RNA pol II se llaman Promotores de clase II Los promotores clase II tienen diferentes secuencias reguladoras dependiendo de la combinación de factores de transcripción requeridos para formar el complejo transcripcional funcional en cada promotor. Algunos de los elementos que han sido descritos en los promotores de clase II de eucariotes son los siguientes: La TATA Box. Su secuencia consenso es TATAAAA. Está localizada 25 bp upstream de el punto de inicio de la transcripción. El Iniciador es una secuencia que es encontrada en muchos promotores y define el sitio de inicio de la transcripción. La GC box. Su secuencia consenso es GGGCGG. Puede haber una o más copias localizadas entre 40 y 100 bp upstream del inicio de la transcripción. La CAAT box secuencia consenso CCAAT - es también frecuentemente encontrada entre 40 y 100 bp upstream del inicio de la transcripción. El factor de transcripción CTF o NF1 se une a la CAAT box.

46 TATA Box Localizada aproximadamente 25 bp upstream de el punto de inicio de la transcripción, es encotnrada en muchos promotores. La secuencia consenso es TATAAAA (semejante a la caja TATA de procariontes localizada en la región - 10). La caja TATA parece ser más importante para seleccionar el punto de inicio de la transcripción (i.e. posicionar la enzima) que para definir el promotor.

47 GC box y CAAT box La GC box es un elemento común en promotores eucariónticos de clase II. Su secuencia consenso es GGGCGG. Puede estar presente en una o más copias las cuales pueden estar localizadas entre 40 y 100 bp upstream del inicio de la transcripción. El factor de transcripción factor Sp1 une la GC box. La CAAT box secuencia consenso CCAAT - es también frecuentemente encontrada entre 40 y 100 bp upstream del inicio de la transcripción. El factor de transcripción CTF o NF1 se une a la CAAT box.

48 Los promotores eucariontes son muy complejos y tienen diversas secuencias regulatorias Diagram based on and adapted from Figure of Mathews & van Holde, Biochemistry, 2nd ed.

49 Además de los elementos anteriormente mencionados, Enhancers pueden ser requeridos para la expresión adecuada de un gen. Estos elementos no son parte del promotor per se. Pueden estar localizados upstream o downstream del promoter e incluso estar muy lejos de él. El mecanismo por el cual funcionan no se conoce. Podrían proporcionar un punto de entrada para la RNA polimerasa o podría asistir en la unión de otras proteínas a la región promotora

50 Sitios consenso en promotores eucariontes

51 Arthur Kornberg, premio Nobel Medicina 1959 por el descubrimiento de la DNA polimerasa III bacteriana RNA polimerasa II de levadura

52 Transcripción por la RNA polimerasa II - 12 subunidades formando un complejo de mas de 500 kda - múltiples factores accesorios (factores de transcripción) RNA pol II cola que se fosforila RNA pol bacteriana

53 Promotor tipo II basal de eucariontes D Caja TATA 25 pb río arriba del Inr (+1) Factores de transcripción generales: A B TFIID TBP: proteína de unión a caja TATA TAFs E F TFIIA TFIIB Ayudan a posicionar al complejo de factores sobre el promotor TFIIF Proporciona la ocupación de +30 bp

54 Promotor tipo II basal de eucariontes TFIIE Une a RNA pol II al complejo montado sobre el promotor H TFIIJ TFIIH Promueve el escape del promotor y fosforila el CTD de RNA pol II brindando progresividad a la transcripción

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58 La unión de la TBP al sitio TATA distorsiona la cadena

59 Proteínas activadoras de la transcripción

60 Activadores: se unen a secuencias intensificadoras en el promotor del gen. Incrementan los niveles de transcripción Represores: se unen a secuencias silenciadoras en el promotor del gen. Disminuyen los niveles de transcripción Coactivadores: integran señales de activadores y/o represores a la maquinaria de transcripción con los factores de transcripción basal Factores de transcripción basal: Estos factores posicionan a la ARN polimerasa sobre el gen y comienzan la transcripción en respuesta a la señal de activadores y/o represores

61 Diferencias en la transcripción entre procariontes y eucariontes Procariontes 1. Todas las especies de RNA son sintetizadas por la misma especie de RNA polimerasa. 2. El mrna se traduce durante la transcripción. 3. Los genes son segmentos contiguos de DNA alineados ininterrumpidamente con el RNA traducido a proteína. 4. Los mrnas son frecuentemente policistrónicos Eucariontes 1. Hay 3 diferentes RNA polimerasas responsables de la transcripción de diferentes moléculas de RNA 2. El mrna es procesado antes de ser transportado a citoplasma (adición de CAP, cola de polia, remoción de intrones 3. Los genes frecuentemente se interrumpen por intrones. 4. Los mrnas son monocistrónicos

62 Inhibición de la transcripción en procariontes Las rifampicinas son producidas por Streptomyces mediterranei, con buena actividad contra bacterias Gram-positivas y contra Mycobacterium tuberculosis. Bloquea la transición de iniciaciónelongación. Se une de manera no covalente a la subunidad en el complejo RNA pol-promotor una vez que se han incorporado dos o tres nucleótidos a la cadena de RNA. La estreptolidigina inhibe a la RNA polimerasa durante el alargamiento.

63 Inhibición de la transcripción en eucariontes Actinomicina D Sar Sar L-Pro L-meVal L-Pro L-meVal D-Val O D-Val O L-Thr L-Thr O C C O N NH 2 O O CH 3 CH 3 Se intercala entre bases G y C Acridina -amanitina Octapéptido bicíclico que se obtiene del hongo Amanita phalloides. Inhibe la translocación de la RNA polimerasa II eucarionte durante la transcripción. Amanita phalloides + N H Se intercala entre bases

64 Procesamiento del RNA El RNA para ser funcional debe ser procesado mrna: sólo en eucariontes trna y rrna: tanto en eucariontes como en procariontes Otros RNAs no codificantes: tanto en eucariontes como en procariontes

65 Procesamiento del mrna en eucariontes Adición del CAP en el extremo 5 Splicing. Exclusión de intrones Poliadenilación en el extremo 3

66 1. Adición del CAP 1) La fosfatasa remueve un fosfato del 5 2) Una guanil transferasa agrega GMP 3) Una metil transferasa agrega el grupo metilo

67 2. Reacción de corte en la unión exón-intrón

68 Existen secuencias específicas en los límites exón-intrón R= purinas Y= pirimidinas

69 Moléculas de RNA son las responsables del corte El apareamiento de las moléculas de snrna requiere complementación de bases con el pre-mrna snrnps: U1, U2, U4, U5, U6 BBP U2AF

70 El splicing (corte y empalme de intrones) lo realiza el snrna de U6 snrnp: Actividad de ribozima

71 Puede existir procesamiento alternativo de intrones en el pre-mrna 5 mrnas maduros 5 proteínas diferentes

72 3. Poliadenilación

73 Proteínas específicas reconocen las secuencias de poliadenilación

74 El mrna es cortado y la enzima Poli-A polimerasa (PAP) agrega A s

75 Proteínas de unión a la cola de poli- A se unen al extremo 3 hasta que el mensaje sale del núcleo

76 El alargamiento del RNA está acoplado su procesamiento

77 La salida del mensaje del núcleo es coordinada

78

79 El receptor de exporte nuclear dirige la salida

80 En eucariontes, cada paso en la regulación de la expresión genética (de transcripción a traducción), es una subdivisión de un proceso continuo.

81 RNA ribosomal Es el RNA más abundante de la célula. Tiene función tanto estructural como catalítica en la síntesis de proteínas. Existen diferentes tipos de acuerdo a su coeficiente de sedimentación asociados a las subunidades ribosomales: Subunidad ribosómica grande Subunidad ribosómica pequeña En procariontes 23S 5S 16S En eucariontes 28.5S 5.8S 5S 18S

82 Procesamiento del rrna en procariontes

83 Procesamiento del rrna en eucariontes

84 El nucléolo es el lugar de síntesis de rrna y pre-ribosomas

85 Nature Reviews Molecular Cell Biology 2,

86 Alberts et al., 3rd ed., p 232 El ribosoma

87 Ribosomas procariontes y eucariontes

88 Cumbre cabeza Protuberancia central Tallo plataforma base

89 El rrna juega un papel muy importante en la traducción rrna 16S rrna 23S

90 RNA de transferencia Es el RNA más pequeño, con unos 75 nt de longitud, en promedio. Su función es transportar los aminoácidos en forma activada hasta el ribosoma donde ocurre la síntesis de proteínas. Existe al menos un tipo de trna para cada uno de los 20 aminoácidos. Sin embargo, algunos aminoácidos tienen varios trnas. Todos los trnas presentan en su 3 la secuencia CCA, independientemente del aminoácido que transporta. El extremo 3 consitutye el sito aceptor del aminoácido.

91 Procesamiento de trna en procariontes Procesamiento del extremo 5 : Rnasa P (Ribonucleoproteína compuesta por RNA 377 nt y proteína 20 kda) Acción catalítica: RNA (ribozima) Procesamiento: co-transcripcional Procesamiento del extremo 3 : 1) endonucleasa elimina un grupo de bases 2) exonucleasa, RNAsa D elimina los restantes nucleótidos 3) El triplete CCA característico de estas moléculas es añadido por una trna nucleotidil transferasa

92 Bases modificadas que se encuentran en los trna Pseudouracilos ( 4 tiouridina 2 metilguanina 2 isopententenil adenina Dihidrouridina (D) Inosina

93 Procesamiento del intron en los trna en eucariontes Una endonucleasa corta en los sitios donde hay protuberancias y una DNA ligasa sella esos cortes

94 Los trna tienen una longitud de aproximadamente 80 nucleótidos