-Concepto operon -Mutante constitucional -Lac operon, represor (alolactosa), regulacion por represion catabolito -Promotor (pro. Policistronico, eu.
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- José Antonio Mendoza Suárez
- hace 7 años
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1 -Concepto operon -Mutante constitucional -Lac operon, represor (alolactosa), regulacion por represion catabolito -Promotor (pro. Policistronico, eu. Pol II con TF) -Elementos cis- y trans-regulatorios, ubicacion -Enhancer -Ej dominios union al DNA -Def transcriptomics, proteomics Análisis de todos los transcritos en una celula en un momento análisis de todas las proteínas en una celula en un momento
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5 Estudios de todos los transcritos en un momento en un lugar Transcriptomics No transcritos Verde: ++++ Rojo: - Distintos genes en un tejido en diferentes momentos Un gen en distintos tejido
6 Estudios de todas las proteinas en un momento en un lugar Proteomics En cerebro humano En higado humano Cada punto es una proteina Separacion de proteinas por electroforesis bi-dimensional (1. pi; 2. tamaño)
7 Posibles puntos de control de la expresion genica
8 ESTRUCTURA de un GEN 5 -notraducida 3 -notraducida promotor codificante intergenico DNA RNA Inicio transcripción Sitio de entrada de la RNA polimerasa termino transcripción Inicio traducción Sitio de entrada de la ribosoma proteina termino traducción
9 Análisis in silico para la predicción de secuencias cis-regulatorios Secuencias de consenso en la región promotora predicen sitios de unión de factores de transcripción
10 Lodish, 10.1 En procariotas: En procariotas el factor sigma determina cual, donde y cuando se transcribe un gen j.:
11 Ej: Virus imita factor sigma de bacteria huésped para transcribir sus genes tiempo - El virus bacteriano SPO1 que infecta Bacillus subtilis, codifica proteínas parecidas a la subunidad sigma -La RNA pol de la bacteria transcribe genes tempranos del virus, se produce una proteína 28 que parece factor sigma y compite con el sigma de la bacteria -Se transcribe entonces un próximo set de genes, uno de los cuales produce una proteína parecida a factor sigma 34 y -Se transcriben los genes tardías del virus, y el virus completa su ciclo lítico
12 REGULACION -Estudiado mayoritariamente en el operon lactosa, procariota -modelo: OPERON, Francoise Jacob y Jaques Monod Mutantes constitutivos y mutantes no-inducibles
13 EXPRESION en PROCARIOTAS - transcripción y traducción espacial y temporalmente acoplada - mensajeros policistronicos - la síntesis de varios proteínas bajo control de un promotor PROMOTOR +1 gen 1 gen 2 gen un mrna policistronico Varias proteinas Proteina 1 Proteina 2 Proteina 3
14 REGULACION NEGATIVA REGULACION POSITIVA El gen esta en OFF por un represor unido al operador y se activa por sacar el represor El gen esta en OFF y se activa por que se une un activador
15 E.coli sintetiza tres proteínas para utilizar lactosa como fuente de energía entra lactosa a la célula bacteriana lactosa permeasa β galactosidasa Una pequeña parte se transforma en alolactosa (el inductor que saca el inhibidor del operador) β galactosidasa alolactosa La β-galactosidasa cataliza la digestión a galactosa y glucosa galactosa glucosa acetilasa no se sabe bien
16 Regulación por elementos cis (secuencias) y elementos trans (proteínas regulatorios) OPERON de lactosa gen represor/inductor I represor 1040bp PROMOTOR P operador O genes estructurales lacz lacy laca β-galactosidasa 3072bp permeasa 1251bp acetilasa 609pb CAP RNA Pol Repressor
17 La secuencia cis-regulatoria del lac-operon +1 tss
18 La lactosa saca el represor del operador y solamente cuando no hay glucosa se transcribe el operon lac I P O Z Y A represor/inhibidor alolactosa 1.) cuando no hay lactosa la célula no transcribe los genes del operon lac, el represor esta unido al operador, que inhibe la unión de la RNA polimerasa al promotor 2.) cuando hay lactosa, la lactosa (alolactosa) se une al represor y el represor ya no esta en el operador 3.) cuando hay glucosa y lactosa, la célula prefiere usar glucosa la presencia de glucosa reprime la degradación de la lactosa = represión por catabolito 4.) cuando no hay glucosa aumenta la concentración del camp, el camp se une a una proteína (CAP) y estimula la unión de la RNA Pol al promotor transcripción del operon lac
19 En E.coli se sobrepone otro tipo de regulacion (positiva) en el lac-operon -Cuando no hay lactosa, el operon esta apagado -Cuando hay lactosa, se activa -Cuando hay glucosa y lactosa, se prefiere utilizar glucosa y se reprime el operon lac = catabolite repression COMO sabe la célula, que hay glucosa en el medio????
20 El mensajero secundario camp Mensajero secundario: camp Cuando hay mucha glucosa, hay baja concentracion camp en la célula cuando baja la concentracion de glucosa, aumenta la conc. del camp en la célula
21 El camp interactua con una proteina, CAP, que se une al operon lac y estimula la expresion del lac-operon Catabolite Activating Protein Lodish, 10.17
22 Jacob y Monod (1962) estudiaron mutantes que constitutivamente utilizan lactosa y revelaron la regulación del operon de la lactosa en E.coli Alberts, 7-38 CAP: catabolite activating protein
23 Un promotor que regula toda esta unidad Operon de triptofano en E. coli una entera molécula RNA Mensajero policistronico Cinco proteínas que están involucradas en la síntesis de triptofano
24 Triptofano inhibe la expresión del operon triptofano
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26 En humano de aproximadamente genes, unos 5-10% codifican proteínas regulatorias
27 GEN = Promotor + secuencias regulatorios elementos cis-regulatorios TRANSCRIPCION POL II en EUCARIOTAS
28 secuencias cis-regulatorios en promotor eucariota
29 FUNCION DE UN ENHANCER Secuencia enhancer puede ubicarse rio arriba (5 ) o rio abajo (3 ) o dentro del gen para modular la expresion
30 FACTORES DE TRANSCRIPCION Elementos trans-regulatorios Proteínas regulatorias: diseño modular región transactivadora + región unión al DNA Ej: - homeobox - leucin zipper - dedos de zinc
31 TIPOS DE MOTIVOS DE UNION AL DNA dedo de zinc Ej.: el motivo helice-vuelta-helice se encuentra en el dominio homeobox, el dominio de unión al DNA helice vuelta helice leucine zipper helice loop helice
32 Secuencias especificas pueden ser reconocidas sin que se abren las hebras complementarias, de afuera en el surco mayor y menor
33 El dominio homeo de 60 aa esta codificado en el homeo-box de 180bp el homeodominio, que contienen el motivo helice-vuelta-helice, se compone de 60aa codificado por 180bp homeo-box, altamente conservada, presente en multiples proteinas regulatorios como los factores de transcripcion con homeo-box, ej. genes hox en eucariotas, que determinan eje anterior-posterior Wolberger et al., Cell 67: , 1991
34 Otro tipo de motivo de unión al DNA: DEDOS DE ZINC zinc-finger Ej.: fragmento del receptor de glucocorticoide Células detectan y responden a nivel transcripcional a hormonas glucocorticoides que están producidos por la glándula adrenal en respuesta al estrés Luisi et al., Nature 352: , 1991
35 Múltiples elementos regulatorios modulan la expresión de un gen cuando, cuanto y donde
36 Proteínas regulatorios que no unen directamente DNA se llaman co-activador o co-represor INTERACCION PROTEINA-PROTEINA esa proteína participa en complejos activadoras y represoras
37 REGULACION DE LA ACTIVIDAD DE GENES MEDIANTE EL ESTADO DE ORGANICACION DEL DNA - ESTRUCTURA DE LA CROMATINA EPIGENETICA -Modificación química del DNA (metilacion) -Modificación química de las proteínas histonas (acetilacion, metilacion, fosforilacion, poliadenilaion) - Unión de otras proteínas al DNA Regulación del aceso a ser transcrito
38 IMPORTANCIA DE LA METILACION DEL DNA -en mamíferos en dinucleotidos CpG -involucrado en funciones importantes como - impronta - inactivación de la cromosoma X - silenciamiento de retrotransposones - inactivación de genes de tumores - regulación de la expresión génica en embriones Dnmt1 = mantencion-mt; Dnmt3a y b = de novo MT
39 Estudio funcional de la secuencia regulatoria de un gen GEN REPORTERO Con metodos de biologia molecular se produce un DNA recombinante, la región regulatoria (promotor) frente la región codificante de un gen que produce una proteína cuya actividad es fácilmente detectable; ej. beta-galactosidasa se puede medir la formación de un producto azul; Region regulatorio modula expresión de secuencia codificante gen reportero -In vitro: estudio promotor: induccion de la expresion gen reporter (fold-induction) transfeccion de constructos en líneas celulares, evaluar expresión gen reportero ej: - gen lacz β-galactosidasa reacción colorimetrico - gen luciferasa con sustrato luciferin reacción colorimetrico -in vivo: ej: - gen green fluorezcence protein detección in vivo, cualitativo
40 La actividad de la β-galactosidasa se visualiza con X-gal -Región regulatorio 5 y gen lacz β-galactosidasa, inductor in vivo: (allo)lactosa, in vitro: IPTG -actividad del gen lacz con sustrato X-Gal produce producto color azul - β-galactosidasa activa en presencia de X-Gal, IPTG AZUL - β-galactosidasa inactiva en presencia de X-Gal, IPTG sin color Ej: unión irreversible al represor X-gal
41 Ej. La expresión del gen reportero regulada por la región promotora de otro gen se expresa el gen reportero en posición que le dicta el elemento regulatorio, aquí second stripe Región cis-regulatoria del gen eve La región regulatoria de otro gen dirige la expresión del gen lacz, se produce β-galactosidasa y se detecta la actividad del gen reportero Control: inmunodeteccion del proteina EVE los siete regiones de expresión del gen eve Small, Levine
42 Gen reportero GFP en rana transgenica bajo control de un promotor tejido-expecifico, que dicta la expresión del gen en el ojo Expresión in vivo del gen reportero GFP en ojo Aequorea victoria GFP Gen green fluoreszent protein GFP
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