METODOLOGÍA DE EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE INHIBIDORES DE PROTEASAS EN Opuntia streptacantha

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1 METODOLOGÍA DE EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE INHIBIDORES DE PROTEASAS EN Opuntia streptacantha RESUMEN Estudiante: Jannet Alejandra Vargas Sánchez Instituto Tecnológico de Roque jannettitajm@hotmail.com Asesor: Dr. Alejandro Blanco Labra CINVESTAV IPN Campus Guanajuato Existen ciertas moléculas de proteínas llamadas inhibidores de proteasas (IP), las cuales son capaces de impedir la actividad proteolítica de las enzimas; el conjunto de técnicas que aquí se presentan, muestran de manera práctica las bases para lograr la extracción y purificación de los IP utilizando tejido de Opuntia streptacantha, y así continuar su estudio. INTRODUCCIÓN La proteolisis consiste en la degradación de proteínas en forma parcial o total, la cuál puede llevarse a cabo por vía química o enzimática (proteasas). La proteolisis enzimática puede ser impedida o regulada por otras proteínas llamadas inhibidores de proteasas (IP), que se unen a la enzima, formando el complejo enzima-inhibidor. Los IP actualmente han adquirido gran importancia por su aplicación en procesos biológicos y biotecnológicos. Por lo anterior, es que el desarrollo de las metodologías y técnicas de extracción y purificación son fundamentales en el inicio de cualquier trabajo de investigación con IP. En el presente trabajo se desarrollaron las técnicas en la extracción y purificación de IP presentes en nopal (Opuntia streptacantha). OBJETIVO Adquirir los conocimientos teóricos para poner en práctica las técnicas de extracción y purificación de IP utilizando tejido de Opuntia streptacantha. METODOLOGÍA 1. Extracción de proteínas El primer paso consiste en obtener un extracto crudo del tejido del cual se pretende aislar la proteína de interés. En el extracto se encuentran mezclados

2 todos los componentes celulares, como proteínas, lípidos, carbohidratos, sales, metabolitos secundarios, etc. El proceso consiste en la extracción acuosa de algunos componentes celulares. Se realiza dependiendo del tejido a trabajar, del cladodio se extrae el jugo por trituración y por molienda se obtiene harina de la semilla. Ambas muestras son sometidas a agitación por un tiempo determinado a baja temperatura; al terminar esta etapa la muestra se centrifuga y se recupera el sobrenadante con la finalidad de desechar el precipitado que contiene algunas impurezas, y descartar restos de tejido. 2. Precipitación con Sulfato de Amonio Al obtener un extracto crudo se debe de tener en cuenta que nuestras proteínas de interés se encuentran en solución acuosa a una baja salinidad. Al incrementar la concentración de sales en la solución incorporando lentamente sulfato de amonio, (entre 20-95% de saturación), la proteína comienza a ceder intercambios iónicos con los iones amonio y sulfato, y sustituye los sitios de intercambio que compartía con el agua y pasado un tiempo de esta manera, la proteína disminuye su solubilidad y precipita. Por lo general las moléculas de mayor peso molecular se precipitan primero [1]. Esta nueva solución se centrifuga y el precipitado que contiene las proteínas se recupera. El éxito de la precipitación depende del tiempo de contacto y de la concentración de la solución [1]. 3. Redisolución y Diálisis El siguiente paso en la purificación de proteínas consiste en tomar una alícuota del precipitado y dializar mediante el flujo selectivo de materia de una zona de mayor concentración a otra de menor concentración con ayuda de presión osmótica, es decir, separando dos disoluciones de concentraciones diferentes por una membrana semipermeable (una membrana que permite el paso selectivo de las moléculas del disolvente, pero impide el paso de compuestos de mayor peso molecular). De ésta manera se puede concentrar un producto o separarlo de una mezcla de moléculas. 1 Es necesario realizar éste paso a baja temperatura y en agitación constante, ya que la diálisis es un proceso molecular que depende exclusivamente de los movimientos aleatorios de las moléculas individuales. 4. Calentamiento Este tipo de IP, posee la propiedad de ser altamente resistentes a la temperatura. Por lo tanto, al aplicar una temperatura alta, la mayoría de las proteínas se desnaturalizan y disminuyen, permitiendo purificar el IP de interés. Además, se disminuye la proteolisis, ya que la estabilidad de las enzimas disminuye por inactivación térmica [1].

3 5. Liofilización Este paso consiste en la eliminación del solvente mediante el proceso de sublimación, en el cuál, la muestra es congelada y sometida a una cámara de alto vacío para favorecer que los solventes pasen del estado sólido a vapor, lo que permite la concentración de la muestra (liofilizado), eliminando el solvente.. 6. Cuantificación de proteína El contenido proteico dependiendo de la naturaleza de nuestra molécula puede ser determinado mediante el Método de Bradford el cual se basa en la unión del colorante azul de Comassie G250, a los residuos Arginil y lisil (de aminoácidos arginina y lisina respectivamente) de la proteína [2]. Esto es usualmente realizado para medir la absorbancia de la solución en el espectrofotómetro a 595 nm. El contenido proteico es una función de la concentración de la proteína, y estará dado en unidades de µg de proteína por mg de liofilizado. 7. Electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida Es un método analítico que permite la migración de proteínas a través de un soporte (poliacrilamida) sujeto a un campo eléctrico, su movilidad estará dada en función principalmente de su peso molecular. La separación de mezclas de proteínas permite analizar la pureza de la solución en estudio. 8. Determinación de actividad inhibitoria de proteasas utilizando geles de poliacrilamida. Realizada la electroforesis, el gel con las bandas de proteína se sumerge en una solución amortiguadora compuesta por Tris Hcl- CaCl 2 con ph 8 y la proteasa Tripsina a una concentración de 1 mg/ml. El gel sumergido se mantiene en incubación a 30 o C por 2 horas, después se enjuaga con agua común y se somete a fijación y tinción. Las proteínas que no son degradadas por la tripsina pueden ser posibles inhibidores de proteasas. 9. Determinación de actividad Inhibitoria de proteasas Una proteasa es una enzima capaz de cortar un enlace peptídico que constituye la base estructural de las proteínas; existen varias técnicas para medir la actividad proteolítica. Una de ellas es una técnica espectrofotométrica la cuál emplea un sustrato sintético que permite monitorear la actividad de proteasa con una alta sensibilidad. La técnica para determinar actividad inhibitoria de proteasas se basa en establecer un blanco de actividad proteolítica, usando un sustrato sintético llamado BAEE (N-benzoil-L-arginina etil ester) y leyendo su hidrólisis a 253 nm. El blanco es usado como referencia. La actividad inhibitoria en sí, consiste en

4 incubar la proteasa blanco con la muestra con inhibidor de proteasas, una vez terminada la reacción se agrega el sustrato y se hace una lectura en el espectrofotómetro, la absorbancia obtenida se relaciona a la absorbancia del blanco de actividad proteolítica y la alícuota de la muestra, para así obtener las unidades de actividad inhibitoria. RESULTADOS Actividad inhibitoria de proteasas Alícuota de enzima: 18.5 µl Abs 253 nm: act Act/ml= Abs 253nm/0.01* alícuota (ml) =.0518/ = 280 Act/ml Cuantificación de proteína 1.5 mg de liofilizado 3 repeticiones Abs 595 nm a) µg b) µg media: µg c) µg 1.5 mg µg cálculos 1.0 mg x X= µg de proteína por mg Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida de semilla de O. streptacantha Carriles: 1: Marcadores de peso molecular 2: Extracto proteico precipitado 95% con (NH 4 ) 2 SO 4 3: Extracto proteico precipitado al 95% con sulfato de amonio y calentado a 95 C por 10 minutos (Paso de purificación de inhibidores de proteasas) zimograma Inhibidor de proteasa

5 CONCLUSIONES Y DISCUSIÓN Gracias a la biotecnología de plantas, hoy en día es posible purificar y caracterizar una molécula específica (inhibidor de proteasas), lo cuál hace posible su estudio y abre camino para descubrir los beneficios potenciales que pueden brindar en un futuro. NOTAS [1] Ver Quintero R. (1981) [2] Consúltese Walter J, (2002) REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Quintero R, Ingeniería Bioquímica Teoría y Aplicaciones (1981), Alambra Mexicana, México. 2. Walker J, The Protein Protocols Hand Book (2002), Humana Press. 2da Ed. New Jersey.