VALIDACIÓN DE UN MÉTODO DE EXTRACCIÓN DE ALICINA EN AJO Y SU CUANTIFICACIÓN POR HPLC

Transcripción

1 Ci Cinvestav t Unidad Saltillo VALIDACIÓN DE UN MÉTODO DE EXTRACCIÓN DE ALICINA EN AJO Y SU CUANTIFICACIÓN POR HPLC Dra. Lourdes Díaz Jiménez Q Karla Q. K l Jiménez Ji é Ló López 23 de octubre de 2008

2 VALIDACION DE UN METODO DE EXTRACCION DE ALICINA EN AJO Y SU CUANTIFICACION POR HPLC Antecedentes

3 Antecedentes Origen Centro y sur de Asia. En el siglo g XV es introducido al continente americano.

4 Antecedentes Actividad biológica g Enfermedades respiratorias Tuberculosis Antimicrobial Anticancérigeno g Reductor de colesterol Anti-inflamatorio

5 Antecedentes Química del ajo *Compuestos sulfurados - Disulfuro Di lf de d alilo lil - s- alilcisteína - ALICINA *Compuestos Compuestos no sulfurados - Saponinas - Macronutrientes

6 Antecedentes Alicina Formación de la alicina - Sustrato aliina - Enzima aliinasa - Rompimiento del tejido

7 Antecedentes Características 70% de los compuestos sulfurados. Olor característico Propiedades curativas Inestable Descomposición

8 Antecedentes Cuantificación de alicina Dificultades. - Inestabilidad - Dificultad para obtener un estándar - Falta de concenso

9 Antecedentes Diversos métodos analíticos Mét d INA Método Condiciones estrictas en la temperatura. Método propuesto por Dowell (1999) Tiempo de reposo Lawson y Wang (2001) T Temperatura t de d C y ti tiempo de d reposo. Lawson y Wang, 2001, J. Agric. Food Chem. Vol 49. Bocchini y col. 2001, Analytica Chemica Vol. 441/1

10 Antecedentes Validación Confirmar Aceptabilidad Aceptabilidad Fiabilidad Fiabilidad

11 Antecedentes Parámetros de validación Linealidad Selectividad o especificidad Exactitud E actit d Precisión - Repetibilidad - Reproducibilidad Robustez

12 VALIDACION DE UN METODO DE EXTRACCION DE ALICINA EN AJO Y SU CUANTIFICACION POR HPLC Objetivo Validar un método de extracción y cuantificación de alicina en ajo y extractos de ajo.

13 VALIDACION DE UN METODO DE EXTRACCION DE ALICINA EN AJO Y SU CUANTIFICACION POR HPLC Metodología M t d l í

14 Metodología Material biológico La materia prima fue proporcionada por la N t ilit S. S de d R.L. R L de d C.V. CV empresa Nutrilite

15 Metodología Tratamiento de la muestra *F *Fresco *Li *Liofilizado fili d *Seco *S

16 Metodología Extracción AJO INCUBACIÓN 30 MIN. ETILPARABENO HOMOGENIZADO 2.5 MIN. ANÁLISIS EN HPLC FILTRA Y DEPOSITA EN VIAL AFORADO CON AC. CITRICO CENTRIFUGADO 3500 rpm 10 MIN 2 ml ml. DE SOBRENADANTE Condiciones HPLC: MeOH/Agua 45/55, Flujo 0.80 ml/min, λ= 230 nm

17 Metodología Validación Selectividad o especificidad: se utilizó polvo de ajo estandarizado, concentración de alicina al 1.023% Linealidad: Concentraciones de 20, 40, 60, 80 y 100% realizando dos replicas por cada nivel de concentración Repetibilidad: concentraciones de 20, 50 y 100%, realizando li d 8 réplicas é li por cada d nivel i l de d concentración (análisis realizados por el mismo analista, equipo y día).

18 Metodología Validación Reproducibilidad: concentración al 100% realizando 2 réplicas de concentración, por dos analistas diferentes. Exactitud: concentraciones del 20, realizando 3 réplicas por cada nivel. 50 y 100% Robustez: se evaluaron las diferentes condiciones que pueden llegar a representar cambios significativos, las modificaciones que se hicieron al método fueron la concentración de fase móvil, mó il dos columnas col mnas de diferentes marcas, cambios de analistas.

19 VALIDACION DE UN METODO DE EXTRACCION DE ALICINA EN AJO Y SU CUANTIFICACION POR HPLC Resultados y discusión

20 Resultados y discusión Calidad de la materia prima Compuestos 1 sulfurados 2.-Allyl metano tiosulfinato, i lfi Metil M il 22 propenotiosulfinato Alicina 4.- Etilparabeno

21 Resultados y discusión Determinación del método de conservación del ajo Ajo deshidratado (por calentamiento) -Liberación de sustrato y enzima Compuestos sulfurados 2.- Etilparabeno -Degradación Degradación de alicina

22 Resultados y discusión Ajo deshidratado (por liofilización) 1 Congelamiento muy rápido Compuestos sulfurados 2.- Etilparabeno Inactivación de la aliinasa

23 Resultados y discusión Ajo congelado a 80 C 1 -Congelado a -80 C -Refrigeración previa antes al análisis. -Temperatura Temperatura ambiente Compuestos sulfurados 2.- Allyl metano tiosulfinato, Metil 2propenotiosulfinato. 3.- Alicina 4.- Etilparabeno 4

24 Resultados y discusión Fase móvil 45/ Compuestos sulfurados 50/ Alicina 4 4 Etilparabeno Etil b / Allyl metano ti tiosulfinato, lfi t Metil M til 22 propenotiosulfinato.

25 Resultados y discusión Columnas Agilent Zorbax Compuestos sulfurados 2.- Allyl metano tiosulfinato, Metil 2propenotiosulfinato. Waters Symmetry 3.- Alicina Etilparabeno 3 4

26 Resultados y discusión Cinética de formación de alicina Area (10-7 m UA) 4 -Cañizares y col. (2004) y Lawson y Wang (2001) 3 -Tiempo de extracción 2 - Temperatura adecuada entre 1926 C tiempo p (min) ( )

27 Resultados y discusión Validación del método Selectividad o especificidad Inhibición de la enzima aliinasa Compuestos sulfurados 2.- Allyl metano tiosulfinato, Metil 2-propenotiosulfinato. 3.- Alicina 4.- Etilparabeno

28 Resultados y discusión 30 Area Linealidad 2 R = (10 mua) Concentración (g) Precisión Repetibilidad Concentración 20% Valores obtenidos. X media = S= CV= 4% Criterio establecido: <5% 50% X media = S= CV= 4.4% 100% X media = S= CV= 1.7%

29 Resultados y discusión Reproducibilidad Criterio establecido: <3% Concentración Analista 1 Valores obtenidos. X media = S= CV= 0.4% Analista 2 X media = S= CV= 1.5% Exactitud Concentración 20% Criterio establecido: <3% Valores obtenidos. X media = 1.92 S= 0.04 CV= 2.2 % 50% X media = 4.55 S= 0.07 CV= 1.5 % 100% X media = S= 0.21 CV= 0.8 %

30 Resultados y discusión Robustez Robustez Fase móvil Columna Analistas No presentan cambios significativos en el método

31 VALIDACION DE UN METODO DE EXTRACCION DE ALICINA EN AJO Y SU CUANTIFICACION POR HPLC Conclusiones El método de cuantificación y extracción de alicina li i quedó dó validado lid d en base b a los l resultados de los principales parámetros evaluados: coeficiente de correlación en la linealidad (0.984), coeficientes de variación en reproducibilidad (<2 %) y repetibilidad (<5 %). %) De igual manera ha sido demostrada la precisión, selectividad y robustez.

32 VALIDACION DE UN METODO DE EXTRACCION DE ALICINA EN AJO Y SU CUANTIFICACION POR HPLC Gracias G i por su atención Dra Lourdes Díaz Jiménez Dra. Recursos Naturales y Energéticos Cinvestav-Unidad Saltillo lourdes.diaz@cinvestav.edu.mx lourdes diaz@cinvestav edu mx