1 Uso previsto. 5 Estabilidad y almacenamiento. 2 Descripción del método. 6 Material y equipamiento adicional requerido y no suministrado
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- María Mercedes Arroyo Roldán
- hace 7 años
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1 ULCGEN v.2 1 Uso previsto RealCycler ULCGEN es un kit de reactivos que permite la detección cualitativa por PCR a tiempo real del ADN de Treponema pallidum, del virus Herpes Simple (tipo 1 + tipo 2) y de Chlamydia trachomatis (agente causal del linfogranuloma venéreo) en muestras clínicas, utilizando un equipo SmartCycler (Cepheid ). El sistema incluye un control interno CHIC (Competitive Heterologous Internal ) para prevenir los falsos negativos debidos a la inhibición de la reacción. 2 Descripción del método La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) está basada en la amplificación de una región específica del ADN/ARN usando oligonucleótidos complementarios a la secuencia diana. En la PCR a tiempo real se utilizan sondas marcadas con fluoróforos que emiten fluorescencia en caso de amplificación. El ciclo de la PCR en el que se detecta inicialmente un aumento significativo en la señal de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN/ARN presente en la muestra. Este valor se denomina Ciclo umbral (Ct -Cycle Threshold- o Cq -Cycle Quantification-). La amplificación de Treponema pallidum se detecta en el canal correspondiente al fluoróforo FAM, la de CHIC en el correspondiente al fluoróforo Alx532, del virus Herpes Simple (tipo 1 + tipo 2) en el correspondiente al fluoróforo TxR y la de Chlamydia trachomatis en el correspondiente al fluoróforo Alx Especificaciones Sensibilidad Treponema pallidum: 100 copias/µl. Virus Herpes Simple tipo 1: 10 copias/µl. Virus Herpes Simple tipo 2: 10 copias/µl. Chlamydia trachomatis : 100 copias/µl. La sensibilidad analítica ha sido determinada por el método de dilución límite. La sensibilidad ha sido obtenida en ensayos repetitivos con una reproducibilidad superior al 95%. Especificidad Treponema pallidum: gen PolA. Virus Herpes Simple tipo 1: gen US6. Virus Herpes Simple tipo 2: gen DNA polimerasa. Chlamydia trachomatis : gen pmph. La validación de la especificidad ha sido realizada mediante ensayos experimentales y el análisis BLAST ( 4 Composición RealCycler ULCGEN incluye la mezcla de reacción AmpliMix dispensada en tubos de amplificación y un Positivo ADN ULCGEN, el cual contiene una mezcla de ADN de Treponema pallidum, virus Herpes Simple (tipo 1 + tipo 2) y Chlamydia trachomatis. Todos los reactivos están listos para su uso sin añadir ni reconstituir ningún componente. Componente Viales Volumen AmpliMix 24 18,67 μl Positivo 1 60 μl 5 Estabilidad y almacenamiento Todos los componentes del kit RealCycler ULCGEN deben ser almacenados a -20 C. El kit es estable a -20 C hasta la fecha de caducidad que consta en la etiqueta externa del kit. 6 Material y equipamiento adicional requerido y no suministrado - Equipo de PCR a tiempo real SmartCycler (Cepheid ). - Microcentrífuga para tubos SmartCycler. - Gradillas para tubos SmartCycler. - Kit de purificación de ADN. - Guantes desechables. - Pipetas calibradas. - Puntas de pipeta con filtro. - Congelador (-20 C). - negativo (ADN de muestras negativas, agua o tampón de elución). 7 Advertencias y precauciones - Todos los componentes del kit deben mantenerse en frío mientras se están manipulando. - Después de añadir el ADN, minimizar el tiempo necesario para iniciar el programa de amplificación. - Los tubos con la mezcla de amplificación no deben exponerse a la luz durante un periodo de tiempo prolongado. - Descongelar y congelar repetidas veces los reactivos puede disminuir la sensibilidad del kit. - Usar guantes desechables. - Usar pipetas calibradas y puntas de pipeta con filtro. - Los ensayos deben llevarse a cabo por personal cualificado y siguiendo las buenas prácticas de laboratorio. - Se recomienda que se lleven a cabo controles positivos y negativos cada vez que se realice un análisis. - Se recomienda atemperar los tubos durante 5 minutos a temperatura ambiente antes de abrirlos. En caso contrario puede producirse la rotura del tapón. - No usar el kit después de la fecha de caducidad. - La presencia de polimorfismos en las secuencias de unión de las sondas u oligonucleótidos al ADN/ARN del patógeno puede generar resultados erróneos. En el caso de discordancia entre las observaciones clínicas y los resultados obtenidos se aconseja comprobar los resultados mediante métodos alternativos. - Los resultados obtenidos con este kit de diagnóstico deben utilizarse e interpretarse en el contexto de un cuadro clínico general y no deben ser el único criterio para la toma de decisiones clínicas. - Uso para diagnóstico in vitro. La detección de no está incluida en el marcado CE. Los resultados obtenidos con este kit para este patógeno solo deben ser considerados con fines de investigación científica. 1 RealCycler ULCGEN v.2 2
2 - Cepheid y SmartCycler son marcas registradas de Cepheid Corporation. - QIAamp, QIAcube y BioRobot EZ1 son marcas registradas del Grupo QIAGEN. - Maxwell es una marca registrada de Promega Corporation. - NucliSENS easymag es una marca registrada de biomérieux. - Arrow/LIAISON IXT es una marca registrada de DiaSorin. 8 Muestras clínicas - Recoger las muestras en tubos estériles. - Almacenarlas y transportarlas congeladas a -20 C hasta su uso. - El kit es compatible con cualquier muestra en la cual el patógeno esté presente y se pueda extraer un ADN de calidad. Muestras clínicas validadas: Virus Herpes simple (tipo 1 + tipo 2): exudado genital, orina y plasma. Chlamydia trachomatis : exudado genital y orina. 9 Procedimiento c) Preparación de la reacción - Descongelar los tubos AmpliMix necesarios para amplificar las muestras y el Positivo. Utilizar como control negativo ADN de muestras negativas, agua o tampón de elución de ADN (no proporcionados). - Añadir 8 μl del ADN de cada muestra o control a cada tubo. - Centrifugar los tubos para que la reacción pase a la zona óptica del tubo. Verificar que no se forman burbujas en la zona óptica. - Colocar los tubos en el equipo. - Create Run > Dye Set > FATA25. - Add/Remove Sites: asignar el protocolo ULCGEN a las posiciones correspondientes a las muestras y los controles. - Start Run: iniciar el programa de amplificación. d) Ajustar el umbral de fluorescencia - Analysis settings > Manual Thresh Fluor Units > fijar el valor a e) Interpretación de los resultados de los controles - Resultados válidos de los controles a) Purificación de los ácidos nucleicos El ADN debe purificarse a partir de las muestras clínicas utilizando un procedimiento adecuado. En el mercado se encuentran disponibles gran cantidad de sistemas de purificación de ácidos nucleicos. Realizar el procedimiento de purificación siguiendo las instrucciones del fabricante y partir del volumen de muestra recomendado. Sistema de purificación validado: Canales Ch1 Ch2 Ch3 Ch4 FAM Alx532 CHIC ( Indiferente ) ( ) TxR ( ) Alx647 ( ) Interpr. VÁLIDO VÁLIDO Arrow/LIAISON IXT (referencia Viral NA Extraction Kit). DiaSorin. Sistemas de purificación compatibles: QIAamp DNA Blood Mini kit. QIAGEN. Maxwell 16 Cell LEV DNA Purification kit. Promega Corporation. BioRobot EZ1. QIAGEN. QIAcube. QIAGEN. NucliSENS easymag. biomérieux. b) Protocolo - Resultados inválidos de los controles En el caso de obtener en algún canal del Positivo (excepto en CHIC) un resultado negativo o un Ct fuera indicado en la etiqueta interna se considera que ese control es inválido. Los resultados obtenidos en las muestras incluidas en la serie de trabajo deben ser descartados (no valorables). En el caso de obtener en algún canal del control negativo (excepto en CHIC) un valor de Ct > 0, los resultados obtenidos en las muestras incluidas en la serie de trabajo deben ser descartados (no valorables). Programar el protocolo de amplificación ULCGEN de acuerdo con las siguientes especificaciones: 3 RealCycler ULCGEN v.2 4
3 f) Interpretación de los resultados de las muestras Interpretar el resultado obtenido en cada muestra o control según la combinación de señales indicada en la siguiente tabla: Canales Ch1 Ch2 Ch3 Ch4 FAM Alx532 CHIC TxR Alx647 Indiferente Interpretación T. pallidum Indiferente Indiferente Indiferente Indiferente Indiferente Indiferente Herpes T. pallidum y Herpes T. pallidum y Herpes y T. pallidum, Herpes y Gráfica 2 (Canal Alx532: CHIC): Resultado obtenido al amplificar un control negativo, un control positivo T. pallidum, un control positivo Herpes y un control positivo. negativo (A1 en azul): se observa señal con Ct=29,58. positivo T. pallidum (A2 en gris): se observa señal con Ct=29,23. positivo Herpes (A3 en naranja): se observa señal con Ct=29,71. positivo (A4 en verde) se observa señal con Ct=29,43. NO SE DETECTA Ct fuera NO VALORABLE 0,00 NO VALORABLE g) Ejemplo de resultado Gráfica 3 (Canal TxR: Herpes): Resultado obtenido al amplificar un control negativo, un control positivo T. pallidum, un control positivo Herpes y un control positivo. negativo (A1 en azul): ausencia de señal. positivo T. pallidum (A2 en gris): ausencia de señal. positivo Herpes (A3 en naranja): se observa señal con Ct=29,99. positivo (A4 en verde): ausencia de señal. Gráfica 1 (Canal FAM: T. pallidum): Resultado obtenido al amplificar un control negativo, un control positivo T. pallidum, un control positivo Herpes y un control positivo. negativo (A1 en azul): ausencia de señal. positivo T. pallidum (A2 en gris): se observa señal con Ct=28,96. positivo Herpes (A3 en naranja): ausencia de señal. positivo (A4 en verde): ausencia de señal. Gráfica 4 (Canal Alx647: ): Resultado obtenido al amplificar un control negativo, un control positivo T. pallidum, un control positivo Herpes y un control positivo. negativo (A1 en azul): ausencia de señal. positivo T. pallidum (A2 en gris): ausencia de señal. positivo Herpes (A3 en naranja): ausencia de señal. positivo (A4 en verde): se observa señal con Ct=28,12. 5 RealCycler ULCGEN v.2 6
4 10 Interpretación de los resultados utilizando la aplicación informática Visor RealCycler a) Exportación de resultados a.1) Desde el equipo SmartCycler Dx - Export > se abre la ventana Export data > Export (dejar por defecto la opción Export Optics Data, Export Results Tables y Export Assay Settings). b) Preparación Visor RealCycler - Abrir el Visor RealCycler e introducir nombre de usuario y contraseña. - Seleccionar el instrumento utilizado > Options > Setup. - Data > Lot input > seleccionar AmpliMix ULCGEN. - Introducir el valor de lote indicado en la etiqueta externa del kit RealCycler ULCGEN. - Introducir los valores de Ct para cada canal indicados en la etiqueta interna del kit RealCycler ULCGEN (obviar el signo < ) > guardar y salir. - Columna AmpliMix > desplegar con el botón derecho y seleccionar AmpliMix ULCGEN. Se mostrarán automáticamente los patógenos detectados en cada canal. - Columna Lot > seleccionar el lote de la AmpliMix. c) Importación de resultados - Save (opcionalmente cambiar el nombre del archivo). - Data > Import Run Data > seleccionar fichero CSV. - Elegir Use Preanalytical Data from SmartCycler (esta opción borrará los datos de las muestras que se hayan introducido en el Visor) o Use Preanalytical Data from Visor (esta opción no importará la identificación de muestras del SmartCycler ). - Import data. - En la columna Sample identificar los controles y opcionalmente las muestras de la serie. d) Generar informe - File > Reports > Seleccionar las muestras que se quieren imprimir. a.2) Desde el equipo SmartCycler I+D - Export > Se abre la ventana Export data > Export (dejar por defecto la opción Export Optics Data y Export Results Table and Analysis Settings). e) Interpretación de resultados - Detección de los patógenos La aplicación informática Visor RealCycler indicará en qué canal se detecta o no señal. En controles y muestras las señales pueden ser válidas (VAL) o inválidas (INV). En CHIC la señal puede ser VAL (Ct dentro en las muestras negativas) o VAL* (Ct indiferente en las muestras positivas). Si se obtiene señal se considerará positivo para ese patógeno siempre y cuando el estatus de la muestra sea válido. - Save (opcionalmente cambiar el nombre del archivo). 7 RealCycler ULCGEN v.2 8
5 - Estatus de la muestra ESTATUS Interpretación CHIC Positivo Negativo VÁLIDO Ct=0 Ct=0 Ct fuera Si las curvas que superan el umbral son anómalas (no sigmoideas) o lineales, no son aptas para el análisis y los resultados obtenidos en esas muestras deben descartarse. El Visor RealCycler realiza un análisis para detectarlas, en cuyo caso las clasificará como inválidas. No obstante, el usuario debe valorar individualmente si las curvas son aptas o no para el análisis, y descartar aquéllas que tengan una forma anómala (no sigmoideas) o lineales. 11 de calidad Para validar los resultados, los valores de Ct obtenidos en el control positivo y en los controles internos deben encontrarse dentro de los rangos especificados en la etiqueta interna del kit. Cada lote del kit RealCycler ULCGEN ha sido testado según las especificaciones de la PCR a tiempo real utilizando el equipo SmartCycler (Cepheid ). Fecha de publicación: Noviembre, Progenie Molecular Edificio Progenie. Valle de la Ballestera Spain T: F: RealCycler ULCGEN v.2 10
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