RECOPILADO POR: EL PROGRAMA UNIVERSITARIO DE ALIMENTOS

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1 NMX-F MÉTODO DE PRUEBA PARA LA DETERMINACIÓN DE RIBOFLAVINA. RIBOFLAVIN DETERMINATION. TEST METHOD. NORMAS MEXICANAS. DIRECCIÓN GENERAL DE NORMAS. 1. DEFINICIÓN Y GENERALIDADES 1.1 Definición Método de Prueba Esta Norma establece el método de prueba para la determinación de Riboflavina, las condiciones en las que deberá realizarse y sus especificaciones, alcance y campo de aplicación Riboflavina La Riboflavina es la Vitamina B2, que forma parte del complejo vitamínico B. 1.2 Generalidades Campo de Aplicación Este método es aplicable para la determinación de riboflavina en productos terapéuticos o dietéticos Fundamento El método se basa en la acidificación con ácido clorhídrico y digestión, de la muestra para la valoración de la riboflavina con hidróxido de sodio. 2. CLASIFICACIÓN Y ESPECIFICACIONES 2.1 Clasificación Esta Norma establece un sólo método para la determinación de la riboflavina. 2.2 Especificaciones Equipo Potenciómetro, refrigerador, incubadora y material usual de laboratorio Material Reactivos Pentóxido de fósforo. Acido acético. RECOPILADO POR: EL PROGRAMA UNIVERSITARIO DE ALIMENTOS

2 Tolueno. Peptona fotolizada. Cistina. Dextrosa anhidra. Hidróxido de sodio. Acetato de sodio anhidro. Acido clorhidrico. Subacetato de plomo. Hidróxido de amonio. Acido sulfhídrico. Fosfato ácido de potasio. Fosfato monoácido de potasio. Sulfato de magnesio. Cloruro de sodio. Sulfato ferroso. Sulfato de manganeso. Extracto de levadura. Acetato de sodio anhidro. Agar. Cultivo puro de Lactobacilus cassei. Azul de Bromotimol Preparación de soluciones Solución madre de Riboflavina I Disuélvase 0.05 g de riboflavina patrón (previamente desecada a 105 C por dos horas y que haya estado en un desecador con pentóxido de fósforo al vacío y en la obscuridad) en 500 ml de solución 0.02 N de ácido acético, póngase en el refrigerador con tolueno. Cada ml equivale a 100 microgramos de riboflavina patrón Solución madre de Riboflavina II Colóquese 100 ml de solución madre de riboflavina I en un matraz aforado de 1000 ml, agréguese solución 0.02 N de ácido acético hasta 1000 ml, póngase en el refrigerador con tolueno. Cada ml equivale a 10 microgramos de riboflavina patrón Solución tipo de riboflavina Dilúyase 5 ml de solución madre II con agua destilada para hacer 1000 ml. Cada ml representa 0.05 microgramos de riboflavina patrón. Prepárese esta solución para cada determinación Solución de peptona fotolizada Disuélvanse 40 g de peptona en 250 ml de agua destilada y 20 g de hidróxido de sodio en 250 ml de agua destilada y mézclense las soluciones en un cristalizador con un diámetro de unos 25 cm. A una distancia de unos 30 cm del cristalizador, póngase un foco de 100 voltios acoplado con un reflector y expóngase la solución a la luz del foco

3 de 6 a 10 horas. Manténgase la solución durante este tratamiento a una temperatura que no exceda de 25 C. Neutralícese el hidróxido de sodio con ácido acético y agréguense 7 g de acetato de sodio anhidro y agua suficiente para hacer 800 ml. Almacénese en el refrigerador con tolueno Solución de cistina Disuélvase 1 g de 1-cistina, en 20 ml de solución de ácido clorhídrico al 10% y suficiente agua destilada para hacer 1000 ml. Almacénese en el refrigerador con tolueno Solución de levadura suplementaria Disuélvase 25 g de extracto de levadura soluble en suficiente agua destilada para hacer 125 ml; agréguese 125 ml de una solución conteniendo 38 g de subacetato de plomo y mézclense las soluciones. Fíltrese y agréguese al filtrado solución de hidróxido de amonio, para obtener un ph de 10. Fíltrese y agréguese al filtrado ácido acético para obtener un ph de 6.5. Precipítese el exceso de plomo con sulfuro de hidrógeno; fíltrese y agréguese al filtrado, suficiente agua destilada para hacer 250 ml. Almacénese en el refrigerador con tolueno Solución Salina A Disuélvase 25 g de fosfato de ácido de potasio y 25 g de fosfato monoácido de potasio en agua destilada para hacer 500 ml. Agréguense 5 gotas de ácido clorhídrico y almacénese en el refrigerador con tolueno Solución salina B Disuélvanse 10 g de sulfato de magnesio, 0.5 g de cloruro de sodio, 0.5 g de sulfato ferroso y 0.5 g de sulfato de manganeso en agua destilada para hacer 500 ml. Agréguense 5 gotas de ácido clorhídrico y almacénese en el refrigerador con tolueno Solución madre de medio basal Solución de peptona fotolizada. 50 ml. Solución de cistina. 50 ml. Solución de levadura suplementaria. 5 ml. Dextrosa anhidra. 15 g. Solución de Salina A. 5 ml. Solución de Salina B 5 ml. Disuélvase la dextrosa anhidra en las soluciones previamente mezcladas y ajústese a un ph de 6.8 con solución de hidróxido de sodio. Finalmente agréguese agua para hacer 250 ml Cultivo madre de Lactobacillus cassei Disuélvanse 2.0 g de extracto de levadura, soluble en agua, en 100 ml de agua destilada, agréguense 0.5 g de dextrosa anhidra, 0.5 g de acetato de sodio anhidro y 1.5 g de agar

4 caliéntese la mezcla, agitando en baño de vapor hasta disolución del agar. Agréguense aproximadamente 10 ml de la solución caliente a cada tubo; tápense con algodón y esterilícense en autoclave, de 121 a 123 C. Déjense enfriar los tubos en posición vertical. Prepárense cultivos por piquete en 3 o más de los tubos, utilizando un cultivo puro de Lactobacillus cassei, incúbense de 16 a 24 horas a una temperatura entre 35 y 37 C pero manténgase constante entre ± 0.5 C; finalmente almacénese en el refrigerador. Prepárese un cultivo madre fresco por piquete, cada semana y no se use para inoculo si el cultivo tiene más de una semana Medio de cultivo A cada una de las series de tubos conteniendo 5.0 ml de solución madre de medio basal, agréguense 5.0 ml de agua destilada conteniendo 0.5 microgramos de riboflavina. Tápense los tubos con una torunda de algodón, esterilícese en autoclave de 121 a 123 C y enfríese Inóculo Hágase un paso del cultivo de Lactobacillius cassei a un tubo estéril, conteniendo 10 ml de medio de cultivo e incúbese de 16 a 24 horas a una temperatura entre 35 y 37 C pero manteniéndola constante dentro de ± 0.5 C. La suspensión así obtenida es el inóculo. 3. MÉTODO DE PRUEBA 3.1 Procedimiento Preparación de la muestra Todas las operaciones de la determinación de la riboflavina, deberán efectuarse protegiéndolas de la luz, manteniéndose el ph abajo de 7, para impedir pérdidas de la vitamina. NOTA: Póngase la muestra en un matraz de capacidad apropiada y procédase como sigue: Agréguese ácido clorhídrico para obtener un ph entre 5 y 6. Adiciónese tal cantidad de agua destilada que el total del volumen de líquido sea igual a no menos 10 veces el peso de la substancia y que la solución resultante contenga a lo más 0.1 mg de riboflavina por ml. Agréguese 1 ml de ácido clorhídrico por cada 100 ml de solución. Si el material no es fácilmente soluble, pulverícese de manera que quede uniformemente repartido en la solución ácida. Agítese vigorosamente y bájense las partículas adheridas al cuello del matraz, empleando solución décimo normal de ácido clorhídrico. Caliéntese la mezcla en el autoclave de 121 a 123 C, durante 30 minutos y enfríese. Si en esta operación se forman grumos, agítese hasta que las partículas se desprendan uniformemente y ajústese a ph de 6 a 6.5 empleando solución acuosa de hidróxido de sodio y agitando enérgicamente durante la neutralización. Añádase inmediatamente solución acuosa de ácido clorhídrico en la cantidad que necesaria para que el líquido ya

5 no precipite (normalmente, a ph de 4.5 aproximadamente precipitan la mayoría de las proteínas, puesto que es un punto isoeléctrico). Dilúyase la muestra con agua destilada de manera que cada ml contenga 0.05 microgramos aproximadamente de riboflavina y fíltrese a través de papel filtro que no absorba riboflavina. Tómese una porción alícuota del filtrado límpido y compruébese la precipitación de las proteínas, agregando gota a gota primero solución acuosa de ácido clorhídrico y, si no se forma precipitado, solución de hidróxido de sodio, agitando vigorosamente y procédase como sigue: a) Si no aparece precipitado, agréguese agitando vigorosamente, solución acuosa de hidróxido de sodio hasta obtener un ph de 6.8 y dilúyase esta solución de manera que cada ml contenga aproximadamente 0.05 microgramos de riboflavina. Si el líquido se enturbia fíltrese otra vez. b) Si aparece precipitado ajústese el ph de la solución de manera que un ml contenga más de 0.05 microgramos de riboflavina y fíltrese. Tómese una porción alícuota del filtrado y procédase como se indica en "a" Determinación de la Riboflavina en la muestra Prepárense tubos de riboflavina tipo de la manera siguiente: a cada par de tubo agréguense 0.0 ml, 1.0 ml, 1.5 ml, 2.0 ml, 2.5 ml, 3.0 ml, 3.5 ml, 4.0 ml, 4.5 ml, 5.0 ml, respectivamente; de la solución tipo de riboflavina. A cada tubo agréguense 0.5 ml de solución madre de medio basal y suficiente agua destilada para hacer 10 ml. Prepárense tubos conteniendo el material por ensayar de la manera siguiente: a cada par de tubos agréguense respectivamente, 1.0 ml, 2.0 ml, 3.0 ml, 4.0 ml, de solución del material por determinar. A cada tubo agréguense 5 ml de solución madre de medio basal y suficiente agua destilada para hacer 10 ml. Después de mezclar, tápense los tubos con algodón y esterilícense al autoclave de 121 a 123 C. Enfríense, inocúlese asépticamente cada tubo con una gota de inóculo, e incúbese durante 72 horas a una temperatura entre 35 y 37 C pero manteniéndola constante dentro de ± 0.5 C. La contaminación de los tubos de la determinación con cualquier microorganismo extraño, invalida la determinación. Determínese el contenido de cada tubo con solución décimo normal de hidróxido de sodio, usando solución indicadora de azul de bromotimol, hasta un ph de 6.8 medido con potenciómetro Cálculos Trácese una curva tipo de las determinaciones de riboflavina tipo, trazando los promedios de las determinaciones expresadas en ml de solución décimo normal de hidróxido de sodio por cada nivel de la solución de riboflavina tipo empleada, contra microgramos de riboflavina contenida en cada tubo. De esta curva tipo, determínese por interpolación el contenido de riboflavina en la solución por determinar de cada tubo. Deséchese cualquier valor que nuestra más de 0.20 y no menos de 0.05 microgramos de riboflavina en cada tubo. Calcúlese el contenido de riboflavina en cada ml de la solución por determinar en cada uno de los tubos. El contenido de riboflavina en la

6 muestra por determinar es calculado del promedio de los valores obtenidos de no menos de 6 de los tubos en los que no varié más de 10% del promedio. Si los valores de las titulaciones de menos de 6 tubos, conteniendo la solución por determinar, están dentro de los límites de los valores de la titulación de los tubos de riboflavina tipo conteniendo de 0.05 a 0.20 microgramos de riboflavina, los resultados son insuficientes para calcular el contenido de riboflavina en la muestra por ensayar. Los valores de las titulaciones superiores a un ml para los tubos de la serie de solución de riboflavina tipo conteniendo 0.0 ml de la solución, indica la presencia de una cantidad excesiva de riboflavina en las soluciones madres de medio basal e invalida la determinación.