ESTABLECIMIENTO DE UN PROTOCOLO RAPDs EFICIENTE PARA PLANTAS DE ÑAME RESUMEN

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1 Agronomía Trop. 56(4): ESTABLECIMIENTO DE UN PROTOCOLO RAPDs EFICIENTE PARA PLANTAS DE ÑAME Maira Oropeza C.*, Erick A. Marilyn R.* y Teresa Edith Vargas C.* RESUMEN Dada la importancia del cultivo de ñame, Dioscorea alata en Venezuela y el resto del mundo, en el Laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Universidad Central de Venezuela se logró establecer sistemas de regeneración in vitro para esta especie vía Organogénesis y Micropropagación. Basado en la posibilidad de evaluar la variabilidad genética de estas plantas, en el trabajo se estableció un protocolo de Amplificación al Azar del ADN Polimórfico (RAPDs) para el ADN de plantas de ñame. Esta investigación constó de 4 pasos: 1) Extracción del ADN: se realizó con el protocolo propuesto por Doyle y Doyle (1990), modificado con tratamiento con solución limpiadora: (Etanol 76% en 10 mm (NH 4 COOH)) y precipitación de oligosacáridos con Acetato de Amonio (NH 4 COOH) 7,5 M; 2) Evaluación del ADN extraído: se realizó mediante el uso de un espectrofotómetro según el protocolo planteado por Sambrook et al. en 1989; 3) Amplificación vía RAPDs del ADN extraído: según el protocolo planteado por Ramser et al. en 1997; 4) Comprobación de la amplificación del ADN extraído: en gel de agarosa 1,8%. Con las modificaciones aquí señaladas se logró obtener un protocolo adecuado de extracción y amplificación del ADN de D. alata. Palabras Clave: ADN; Dioscorea alata; RAPDs. * Profesores. Universidad Central de Venezuela. Facultad de Ciencias. Instituto de Biología Experimental. Centro de Botánica Tropical. Laboratorio de Biotecnología Vegetal. Apartado Caracas 1041A, Venezuela. RECIBIDO: febrero 20,

2 Vol AGRONOMÍA TROPICAL Nº 4 ESTABLISHMENT OF AN EFFICIENT RAPD PROTOCOL FOR YAM PLANTS Maira Oropeza C.*, Erick A. Marilyn R.* y Teresa Edith Vargas C.* SUMMARY Because of the importance of yam, Dioscorea alata plants in Venezuela and the world, in the Plant Biotechnology Laboratory at the Universidad Central de Venezuela, in vitro culture systems via organogenesis and micropropagation for this plant species were established. Based on the possibility of evaluating genetic variability in regenerated plants, a protocol of Random Amplification Polymorphic DNA (RAPD) for yam plants was developed. This research was made up of four steps: 1) DNA extraction following Doyle and Doyle (1990) protocol modified with a cleaning treatment with 76% Ethanol in 10 mm NH 4 COOH and oligosaccharides precipitation with 7,5 M NH 4 COOH; 2) Spectrophotometric evaluation of extracted DNA according to Sambrook et al. (1989); 3) RAPD amplification of extracted DNA following the protocol established by Ramser et al. (1997) and 4) Verification of the amplification of extracted DNA using 1,8% agarose gel. Good quality D. alata DNA extracts and efficient DNA random amplifications were obtained using the modifications incorporated in our protocol. Key Words: AND; Dioscorea alata; RAPDs. * Profesores. Universidad Central de Venezuela. Facultad de Ciencias. Instituto de Biología Experimental. Centro de Botánica Tropical. Laboratorio de Biotecnología Vegetal. Apartado Caracas 1041A, Venezuela. RECIBIDO: febrero 20,

3 OROPEZA et al. - Protocolo RAPDs para ñame INTRODUCCIÓN El ñame, Dioscorea alata L, nativo de regiones cálidas de ambos hemisferios, es una de las especies más importante del género Dioscorea, dado su gran valor económico, farmacológico y alimenticio, cultivándose a través de los trópicos y en parte de las regiones sub-tropicales y templadas. Debido a la gran importancia de este género, Royero (2004), logró establecer sistemas de regeneración in vitro para esta especie. El cultivo in vitro puede generar alteraciones genéticas que en su conjunto se denominan Variación Somaclonal (Larking y Scowcroft, 1981), por lo que se han desarrollado numerosas técnicas para evaluar este fenómeno. La técnica de RAPDs (ADN Polimórfico Amplificado al Azar) es una de las más eficientes y de mayor empleo para la detección de variaciones genéticas, no sólo de plantas regeneradas in vitro (Oropeza et al., 1995), sino también en estudios de variaciones genéticas entre variedades de plantas de la misma especie (Oropeza y García, 1997). En el presente trabajo, se estableció un protocolo eficiente para la extracción y amplificación del ADN de plantas de ñame. MATERIALES Y MÉTODOS Material vegetal: Hojas de plantas de Dioscorea alata en condiciones de vivero (in vivo), y hojas de plantas de Dioscorea alata regeneradas vía Organogénesis (in vitro). Extracción de ADN: Se realizó según el método Doyle y Doyle (1990) y se modificó según Weising y Kahl (1997). Evaluación del ADN extraído: Se realizó mediante el uso de un espectrofotómetro, y se complementó con la electroforesis en gel de agarosa 0,8% para evaluar la integridad del ADN extraído, según Sambrook et al. (1989). Amplificación del ADN extraído vía RAPDs: Se realizó con primers pertenecientes a la serie OPC de la casa OPERON, según el protocolo planteado por Ramser et al. (1997), llevándose a cabo en un volumen final de 25 µl que contenía: Buffer de reacción (1X); MgCl 2 (2 mm); dntp s (0,2 mm); Iniciador (primer) (10 pm); ADN de Dioscorea alata (100 ng µl -1 ); Taq Polimerasa (0,06 U. por reacción). Las condiciones de amplificación se fijaron según el protocolo planteado por Ramser et al. (1997). Comprobación de la amplificación: Se realizó mediante electroforesis en gel de agarosa 1,8%. 603

4 Vol AGRONOMÍA TROPICAL Nº 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Al analizar los resultados de la extracción del ADN de ñame, se encontró que este estaba contaminado con ARN, por lo que se decidió introducir la primera modificación al protocolo de extracción, la cual consiste de un tratamiento con RNAasa A (10 mg ml -1 ) con lo cual se eliminó la ccontaminación de ARN en las muestras. Luego de esta modificación, al realizar la electroforesis en gel de agarosa, pudo observarse que todavía la muestra se quedaba retenida en los bolsillos del gel, hecho este que ponía en evidencia la presencia de oligosacáridos asociados al ADN extraído, por lo que se realizó la segunda modificación: Un tratamiento con solución limpiadora de los oligosacáridos: (Etanol 76% en 10 mm (NH 4 COOH)) y su posterior precipitación con Acetato de Amonio (NH 4 COOH) 7.5 M. La eliminación de estos oligosacáridos fue un paso sumamente importante, debido a que la presencia de estos no permitiría la posterior amplificación del ADN al evitar que los primers se unan a las cadenas del ADN extraído (Figura 1). M V V O M V O FIGURA 1. Evaluación de la integridad del ADN extraído. Izq.: Sin modificaciones; Der.: Luego de las modificaciones; M: marcador de peso molecular; DNA: Fago Lambda EcoR1 + Hind III (Promega); V: ADN de plantas in vitro; O: ADN de plantas in vitro. 604

5 OROPEZA et al. - Protocolo RAPDs para ñame Para que un ADN extraído presente suficiente pureza para ser amplificado, debe presentar valores entre 1,8 y 2 en la relación 260/280 al ser leído en un espectrofotómetro (Sambrook et al., 1989), por lo tanto, luego de las modificaciones, se obtuvo un ADN de ñame apto para ser amplificado. Para evidenciar esto, se realizó la amplificación vía RAPDs del ADN de plantas de ñame in vivo y de plantas de ñame regeneradas in vitro vía Organogénesis, y al realizar la electroforesis en gel de agarosa 1,8% claramente se observó una amplificación efectiva (Figura 2), por lo que se dice que se obtuvo un protocolo eficiente de extracción y amplificación para el ADN de ñame. M V O V O V O V O V O P15 P16 P17 P18 P19 FIGURA 2. Comprobación de la amplificación vía RAPDs. M: Marcador de peso molecular; DNA: Fago Lambda EcoR1 + Hind III (Promega); V: ADN de plantas in vitro; O: ADN de plantas in vitro (Organogénesis); P15: Primer 15; P16: Primer 16; P17: Primer 17; P18: Primer 18. Todos los primers son de la serie OPC de OPERON. 605

6 Vol AGRONOMÍA TROPICAL Nº 4 BIBLIOGRAFÍA DOYLE, J. J and J. L. DOYLE Isolation of plant DNA from freh tissue. Phytochemical Bull. 19: LARKING, P. J and W. R. SCOWCROFT Somaclonal variation a novel source of variability from cell cultures for plant impovement. Theor. Appl. Genet. 60: OROPEZA, M., P. GUEVARA, E. GARCÍA and J. L. RAMÍREZ Identification of Sugarcane Saccharum spp. Somaclonal Variants Resistant to Sugarcane Mosaic Virus, via Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) markers. Plant Mol. Biol. Rep. 13: OROPEZA, M. y E. GARCÍA Utilización de marcadores moleculares para la identificación de variedades de caña de azúcar. PHYTON: 61: RAMSER, J., K. WEISING, V. CHIKALEKE and G. KAHL Increased informativeness of RAPD analysis by detection of microsatellite motifs. BioTechniques. 23: ROYERO, M Regeneración in vitro de Dioscorea alta (ñame). Trabajo Especial de Grado. Caracas. Venezuela. Universidad Central de Venezuela. Facultad de Ciencias. pp. 82. SAMBROOK, J., E. F. FRITSCH and T. MANIATIS 1989: Molecular cloning, a laboratory manual. Sec. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA. pp WEISING, K. and G. KAHL Hybridization-based microsatellite fingerprint of plants and fungi. In: Caetano-Anollés G., Gresshoff P. M, (Ed.). DNA markers. Protocols, applications and overviews. Wiley-VCH, New York. pp