Métodos de aislamiento

Transcripción

1 Métodos de aislamiento Aislamiento de hongos y bacterias Unidad de Fitopatología Dto. de Protección Vegetal Facultad de Agronomía. Dr. Pedro Mondino Métodos de aislamiento Técnicas de Aislamiento de hongos y bacterias fitopatógenas. Aislamiento de flora epifítica, de suelo, rizosfera. Fundamentos, aislamientos directos e indirectos. Uso de medios selectivos. Uso de cebos. 24 de abril al 5 de mayo de 2012 Aislamiento a partir de tejido vegetal Métodos de aislamiento A partir del tejido vegetal enfermo es posible aislar a los patógenos. Se busca tomar trozos de la zona de avance para incrementar las chances de aislar al patógeno. Los trozos de tejido vegetal se someten a una desinfección superficial. En el caso de bacterias es posible macerar un trozo de tejido afectado y luego sembrar Sembrando trozos de tejido vegetal de la zona de avance del patógeno. Ej: a partir de frutos afectados Aislamiento a partir de trozos de tejido vegetal Trozos de tejido afectado de la zona de avance son sembrados en medio de cultivo (ej. Madera) Aislamiento a partir de tejido vegetal Sembrando trozos de tejido vegetal de la zona de avance del patógeno. Bisturí Zona de avance Hipoclorito 1% Siembra en placa Pinza Agua estéril 1

2 Aislamiento de bacteria a partir del tejido infectado Tocando con el ansa en la zona de avance de la infección es posible aislar la bacteria. Aislamiento de bacterias por macerado del tejido vegetal El tejido afectado es macerado en mortero y luego el macerado es estriado en placa. Cuando la muestra vegetal presenta signo es posible tomar una pequeña porción del mismo y sembrar en una placa con medio de cultivo. Cuando la muestra vegetal presenta signo es posible tomar una pequeña porción del mismo y sembrar en una placa con medio de cultivo. Cuando la muestra vegetal presenta signo es posible tomar una pequeña porción del mismo y sembrar en una placa con medio de cultivo. Cuando la muestra vegetal presenta signo es posible tomar una pequeña porción del mismo y sembrar en una placa con medio de cultivo. 2

3 Aislamiento directo de zooglea Aislamiento a partir del exudado bacteriano Un trozo de tallo de una planta afectada vascularmente es colocado en agua en recipiente con agua o saline esteril. Ansa Flujo bacteriano en agua estéril Estriado en placa Inducción del signo Inducción del signo La aparición de signo puede ser inducida mediante cámara húmeda. La aparición de signo puede ser inducida mediante cámara húmeda. Uso de cebos Uso de cebos Trozos de manzana verde son utilizados para capturar Phytophthora spp del suelo. Cebos utilizados para aislar Pythium: pétalos de clavel (Dianthus caryophyllus L.) Cañamones (Cannabis sativa L.) hervidos. Trozos de zanahoria (Daucus carota L.) Papa (Solanunt tuberosum L.) + agar-agua. Trozos de tomate verde (Lycopersicon esculentum L) Acículas de pino (Pinus spp.). 3

4 Colonizadores de patógenos Colonizadores de esclerotos Se pueden encontrar antagonistas colonizando naturalmente a los patógenos de plantas. Se pueden utilizar a los patógenos como cebo para capturar a sus antagonistas. Aislamiento a partir de la flora epifítica del fruto Aislamiento de microorganismos del suelo La muestra de suelo se suspende en agua estéril. Se hacen diluciones 10-1 a veces. De cada dilución se siembran por extensión dos placas con 100 µl (0.1 ml) en medios de cultivo (dependiendo del tipo de microorganismos que queramos aislar) y luego se incuban. Se aíslan colonias separadas de distinta morfología y se purifican mediante repiques. Aislamiento de microorganismos del suelo Esquema de la metodología utilizada para aislar a partir de suelo. Microorganismos rizoféricos. Microorganismos aislados de la rizosfera de plantas de tomate. 4

5 Cultivos puros Métodos de aislamiento para obtener un cultivo puro se debe inocular o introducir, una sola célula o propágulo de un microorganismo en un medio sólido o líquido, esterilizado previamente. Para aislar células individuales, los microorganismos han de ser diluidos, debido al gran numero en que normalmente están presentes. La dilución se realiza, normalmente, por uno de los siguientes sistemas: siembra por estría en placa vertido en placa extensión en placa. Para que se pueda contar el número de colonias en la placa debe estar entre 30 y 300. Método de estriado en placa Esquema práctico del aislamiento de bacterias Colonias aisladas A partir de una suspensión concentrada de microorganismos se realizan diluciones seriadas. 0,1 ml de la solución se siembra en superficie y se esparce mediante rastrillo de vidrio. 5

6 Aislamiento de bacterias Aislamiento por estriado 0,1 ml de la solución se siembra en superficie y se esparce mediante rastrillo de vidrio. Método de vertido en placa 0,1 ml de la solución se siembra en superficie y se esparce mediante rastrillo de vidrio. Cultivos monospóricos Para asegurarnos la homogeneidad genética de un cultivo de hongos se recurre a la técnica de cultivo a partir de una única espora. Los cultivos monospóricos se pueden realizar: sembrando en superficie una suspensión de esporas y luego observando bajo lupa o microscopio repicar. Sembrando diluciones de forma que crezcan colonias aisladas.mm Cultivos monospóricos Metodología Monospóricos de Venturia inaequalis. 6

7 Metodología Monospóricos a partir de colonias aisladas de una siembra de una suspensión diluida. Cultivo a partir de punta de hifa Cuando no es posible disponer de esporas se puede recurrir al cultivo de punta de hifa 7