UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN SIMON

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1 UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN SIMON FACULTAD DE CIENCIAS FARMACEUTICAS Y BIOQUIMICAS DEPARTAMENTO DE POSTGRADO DETECCION PRECOZ DE HEMOLISINAS MATERNAS DEL SISTEMA ABO Y SU RELACION CON LA ENFERMEDAD HEMOLITICA FETO NEONATAL EN EL HOSPITAL MATERNOLOGICO GERMAN URQUIDI DE AGOSTO A SEPTIEMBRE DEL 2010 TESIS PRESENTADA PARA LA OBTENCION DEL GRADO ACADEMICO DE MAGISTER EN HEMATOLOGIA LABORATORIAL, INMUNOHEMATOLOGIA Y MEDICINA TRANSFUSIONAL ELABORADO POR: TUTOR: LIZETH MAIDA BALCAZAR Msc. TAYITA UGARTE CUBA Cochabamba, Febrero 2011

2 Resumen La Incompatibilidad Feto Materna por el Grupo Sanguíneo ABO es la más frecuente de las incompatibilidades sanguíneas maternas fetales. Se presenta en madres grupo O y fetos grupo A o B. La gran mayoría de los pacientes con incompatibilidad por grupo clásico no sufre Enfermedad Hemolítica Feto Neonatal, cursando con una enfermedad más bien benigna, poco intensa donde la hemólisis fetal es escasa en importancia, sólo siendo necesario en algunos casos el tratamiento de la anemia resultante de la enfermedad hemolítica, que en la mayoría de los casos es leve. Estudios recientes señalan que la razón de esta benignidad de la incompatibilidad ABO se debe a la poca especificidad de los antígenos ABO, los cuales a partir de la 6 semana de gestación se encuentran en la mayoría de los tejidos fetales, incluyendo los eritrocitos, además de lugares como la placenta, donde se piensa que hay gran clearance de anticuerpos maternos. La Enfermedad Hemolítica Feto Neonatal es un cuadro que se caracteriza porque los anticuerpos presentes en la madre de grupo sanguíneo O atraviesan la placenta y se unen a la superficie de los glóbulos rojos del bebe acortando su tiempo de vida. Lo cual termina llevando al hijo a un cuadro de anemia, la que a su vez estará determinada por la magnitud de la destrucción y de la capacidad de reposición de los glóbulos rojos. Como consecuencia de esto, el hijo intenta reponer los glóbulos destruidos produciendo una gran cantidad de glóbulos rojos inmaduros con capacidad transportadora del oxígeno muy insuficiente, afectando los distintos órganos. La enfermedad hemolítica del feto y del recién nacido (EHFN), es una afección inmunológica aloinmunitaria, en la cual la sobrevida del eritrocito esta disminuida por la acción de anticuerpos maternos que pasan a través de la placenta, estos son específicos contra antígenos de origen paterno. El objetivo del presente trabajo fue determinar la relación existente entre la presencia de anticuerpos fijadores y

3 activadores del complemento en el suero de embarazadas, con la presencia de EHFN-ABO en los Recién Nacidos. En el periodo de estudio (Agosto a Octubre del 2010) se registro a 1764 mujeres embarazadas que acudieron al Hospital Maternológico Germán Urquidi; de este grupo se hizo una preselección (151 mujeres O) de acuerdo al grupo sanguíneo de la pareja, que debían ser de grupo sanguíneo A, B o AB. Al nacimiento del bebe y verificando su grupo sanguíneo se seleccionaron solo a 75 recién nacidos con grupo sanguíneo A, B o AB. De las 75 madres O que fueron estudiadas nacieron 64 (85.3%) bebes del grupo A, 11 (14.7%) del grupo B. Se realizó el test de Coombs Directo a 30 (40%) Recién Nacidos diagnosticados por criterio clínico y nivel de bilirrubina con EHFN, dando como resultado que solo 9 (30%) fueron positivos a la prueba y 21 (70.0%) fueron negativos. El bajo porcentaje de resultados positivos es debido a la escasa presentación de antígenos y a la baja afinidad, lo que hace lábil la unión antígenoanticuerpo. La presencia de anticuerpos fijadores y activadores del complemento se manifiesta a través de la hemolisis en el suero de la mamá frente a eritrocitos del grupo sanguíneo A. De la determinación de anticuerpos fijadores y activadores, los resultados obtenidos nos muestran que la mayoría de las mamás presentaron anticuerpos fijadores y activadores del complemento, representado por un 89% (67). La prueba de Tiempo de Hemolisis Media para saber si presentan o no hemolisinas se encuentra dividido en dos grupos: a) los valores de THM mayores a 300 segundos; que son los que no alcanzaron el tiempo de hemolisis media al cabo de 5 minutos: ausencia de Hemolisinas y b) los valores de THM menores de 300 segundos, que son los que presentan hemolisis en ese periodo de tiempo: presencia

4 de Hemolisinas. Los resultados obtenidos nos muestran que la mayor proporción de sueros con anticuerpos fijadores y activadores de complemento se encuentran en un THM menor a 300 segundos, es decir que sí presentan hemolisinas un 73% (55), en cambio los sueros que presentaron un THM superior a los 300 segundos, es decir, los que no presentan hemolisinas están en un 27% (20). Se puede concluir que existe relación entre la presencia de anticuerpos y la Enfermedad Hemolítica Feto Neonatal, además que el estudio de dichos anticuerpos en forma eficaz y temprana podría alertar al médico sobre la presencia de dicha enfermedad. Además queda la recomendación de que como la prueba del Test de Coombs Directo empleada para diagnosticar la incompatibilidad ABO en el recién nacido a veces resulta insuficiente. Debido a la simplicidad de los antígenos del recién nacido y la baja densidad en comparación con el adulto, la constante de afinidad de los anticuerpos es baja y luego de los lavados, el test de Coombs Directo suele ser negativo; en consecuencia se debería implementar la técnica de Tiempo de Hemolisis Media (THM) la cual es sencilla, requiere un mínimo equipamiento de laboratorio como es el fotocolorímetro, y podría ser usada como herramienta de valor predictivo en embarazadas de grupo O con parejas ABO incompatibles y/o bebes de grupo A, B o AB. Esto permitirá a los recién nacidos considerados de riesgo quedar en observación y así evitar que deban trasladarse nuevamente hasta un centro asistencial y reingresar para realizar un tratamiento.

5 ABSTRACT Maternal Fetal Incompatibility ABO blood group is the most frequent maternal fetal blood incompatibilities. It occurs in group O mothers and fetuses in group A or B. The vast majority of patients with classical group incompatibility does not suffer from Fetal Neonatal Hemolytic Disease, studying with a rather benign disease, low intensity where fetal hemolysis is low in importance, only being necessary in some cases the treatment of anemia resulting from hemolytic disease, which in most cases are mild. Recent studies show that the reason for the mildness of the ABO incompatibility due to the lack of specificity of the ABO antigens, which from the 6 th week of gestation was found in most fetal tissues, including erythrocytes, also from places like the placenta, where it is thought that there is great clearance of maternal antibodies. Fetal Neonatal Hemolytic Disease is a condition that is characterized by antibodies present in maternal blood group "O" cross the placenta and bind to the surface of the baby's red blood cells by shortening their life span. Which ends up taking the child with anemia, which in turn is determined by the magnitude of destruction and regeneration capacity of red blood cells. As a result, the child tries to replace the destroyed cells producing a large number of immature red blood cells with oxygen-carrying capacity of the very poor, affecting different organs. Hemolytic disease of the fetus and newborn (EHFN) is an alloimmune immune disorder, in which erythrocyte survival is decreased by the action of maternal antibodies to pass through the placenta, these are specific for paternal antigens. The aim of this study was to determine the relationship between the presence of binding antibodies and complement activity in serum of pregnant women, with the presence of ABO EHFN-Newborn.

6 In the study period (August to October 2010) was recorded to 1764 pregnant women attending the Hospital Maternológico Germain Urquidi; of this group made a pre-selection (151 women, O) according to the blood group of the couple, who should be blood group A, B or AB. At birth the baby and checking your blood type is selected only 75 newborns with blood group A, B or AB. in group B. Of the mothers O that was 75, born 64 (85.3%) infants in group A, 11 (14.7%) We performed 30 (40%) infants diagnosed by clinical criteria and level of bilirubin EHFN Direct Coombs test, resulting in only 9 (30%) were positive to the test and 21 (70.0%) were negative. The low percentage of positive results is due to poor antigen presentation and low affinity, making labile antigen-antibody binding. The presence of binding antibodies and complement activity manifested by hemolysis in the serum of the mother against blood group A. The determination of binding antibodies and activators, the results show that most mothers had antibodies and complement activating fasteners, represented by 89% (67). Proof Media Hemolysis Time to learn whether to bring hemolysins is divided into two groups: a) THM values greater than 300 seconds, which are not reached half time of hemolysis in 5 minutes: no Hemolysin b) THM values less than 300 seconds, which are those with hemolysis in that time period: haemolysins. The results obtained show that the largest proportion of sera with binding antibodies and complement activity in a THM are less than 300 seconds, ie that do have hemolysins by 73% (55), whereas sera that showed a higher THM to 300 seconds, ie, those without are hemolysins by 27% (20). We can conclude that there is a relationship between the presence of antibodies and Fetal Neonatal Hemolytic Disease, that the study of such antibodies in an effective and early could alert the physician to the presence of the disease.

7 There is also the recommendation that the proof of the Direct Coombs test used to diagnose ABO incompatibility in newborns is sometimes insufficient. Due to the simplicity of the antigens of the newborn and low density compared with the adult, the affinity constant of antibody is low and after washing, Direct Coombs test is usually negative, and consequently should implement Hemolysis Time Technical Media (THM) which is simple, requires minimal laboratory equipment such as photocolorimeter, and could be used as a predictive tool in pregnant group O with ABO incompatible pairs and / or babies group A, B or AB. This will allow risk infants be considered for observation and avoid to be moved again to a hospital and readmission for treatment.

8 TRIBUNALES ASIGNADOS Dra. Msc. Adela Panozo Bioquímica Farmacéutica Tribunal Dr. Javier Salinas Medicina Interna - Hematología Tribunal Dr. José Macias A Dra. Msc. Ana T. Ugarte C. Medicina Interna Hematología Bioquímica Farmacéutica Tribunal Tutor

9 Dedicatoria: A mi Querido Padre Celestial que aunque no lo puedo ver; puedo sentir su presencia y su gran amor reflejado en un Papá maravilloso que una vez más me apoyo para culminar esta Formación Profesional. A mi Mamá; la Mujer que me apoyó, con su infinito amor, cariño, comprensión y apoyo. Por soportar que todo este tiempo este lejos de ella y de mi hijita, por acompañarme en los buenos y malos momentos, por ayudarme a que este momento llegara. A mi hijita Marielita que es mi inspiración y mi razón de ser y a la Memoria de mi sobrino Marcelito; que su espíritu, su bondad y su sentido del humor sigan tocando mi vida.

10 AGRADECIMIENTOS Mis más sinceros agradecimientos: A mi tutora Msc. Tayita Ugarte Cuba, por brindarme su colaboración, entrega de sus cocimientos y por toda su dedicación en tiempo y constante apoyo a lo largo del trabajo. Al Dr. Ricardo Antezana Director del Hospital Maternológico Germán Urquidi y a la Jefe del Laboratorio Dra. Msc. Neva Tapia, por la ayuda brindada. A la Dra. Cinthia Diaz por su colaboración y esfuerzo en la recolección de muestras. A todo el personal del Laboratorio y Estadística del Hospital Maternológico Germán Urquidi porque de alguna manera me apoyaron durante la realización de esta tesis. A mis Padres por su infinito amor y apoyo durante este tiempo. A mis Hermanos y Sobrinos por sus palabras de aliento que en algún momento supieron darme.

11 TABLA DE CONTENIDO DEDICATORIA AGRADECIMIENTOS RESUMEN I.- INTRODUCCION Pág. 1 II.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Pág. 3 III.- JUSTIFICACION Pág. 3 IV.- HIPOTESIS Pág. 4 V.- OBJETIVO GENERAL Pág. 4 VI.- OBJETIVOS ESPECIFICOS Pág. 4 VII.- MARCO TEORICO Pág SISTEMAS DE GRUPOS SANGUINEO Pág Antígenos de grupo sanguíneo Pág Características químicas Pág Clasificación de los antígenos Pág Anticuerpos de grupo sanguíneo Pág Visión general de la estructura del anticuerpo Pág Descripción de inmunoglobulinas más significativas en inmunohematología Pág. 12 a) Inmunoglobulina M Pág. 12 b) Inmunoglobulina G Pág Clasificación de los anticuerpos Pág. 14 a) Según el origen del Antígeno Pág. 14 b) Según la Frecuencia de presentación Pág. 14 c) Según causa de aparición Pág. 14 d) Según las características de la reacción con el antígeno celular Pág SISTEMA DE GRUPO SANGUINEO ABO Pág. 16

12 Genética del sistema ABO Pág Formación y control genético de las sustancias ABO Pág Expresiones fenotípicas del sistema ABO Pág Antígenos del sistema ABO Pág Anticuerpos del sistema ABO Pág ENFERMEDAD HEMOLITICA FETONEONATAL (EHFN) Pág Etiopatogenia de la EHFN Pág Enfermedad hemolítica producida por incompatibilidad ABO Pág Diagnostico de la EHFN-ABO en el recién nacido Pág Diagnóstico de laboratorio Pág. 39 VIII.- METODOLOGIA O DISEÑO DE ESTUDIO Pág TIPO DE INVESTIGACION Pág IDENTIFICACIO DE VARIABLES Pág SELECCIÓN DEL INSTRUMENTO Pág RECURSOS DISPONIBLES Pág Población y Muestra Pág. 43 a) Criterios de inclusión Pág. 44 b) Criterios de exclusión Pág Teorema del Límite Central Pág Materiales y Métodos Pág PRUEBAS DE LABORATORIO Pág Tipificación ABO y Rh (D) Pág Anticuerpos Aglutinantes Pág. 48 a) Anticuerpos Totales Pág. 48 b) Anticuerpos en suero tratado con 2-ME Pág. 49 c) Anticuerpos fijadores y activadores del complemento Pág. 49 d) Anticuerpos Transplacentarios Test de Coombs Directo Pág Determinación de Hemolisinas - THM Pág Determinación de Sensibilidad y Especificidad del Coombs Directo y la Determinación de Hemolisinas Pág. 51

13 IX.- RESULTADOS Pág Tipificación del Grupo Sanguíneo Pág Determinación de Anticuerpos Aglutinantes Pág Determinación de Anticuerpos Totales Pág Determinación de anticuerpos IgG Pág Determinación de anticuerpos fijadores y activadores del complemento Pág Determinación del Tiempo Medio de Hemolisis Pág Determinación de Anticuerpos Transplacentarios Pág Relación de resultados con la frecuencia de EHRN Pág Determinación de Sensibilidad y Especificidad del Coombs Directo y la Determinación de Hemolisinas Pág. 63 X.- DISCUSION Pág. 65 XI.- CONCLUSIONES Pág. 67 XII.- RECOMENDACIONES Pág. 69 XIII.- BIBLIOGRAFIA Pág. 70 ANEXOS

14 INDICE DE TABLAS Tabla 1.- Principales grupos eritrocitarios de importancia clínica Pág. 6 Tabla 2.- Determinación Globular y sérica del grupo ABO y frecuencia de fenotipo Pág. 18 Tabla 3.- Sistema ABO Genotipos posibles para cada fenotipo Pág. 25 Tabla 4.- Características de la EHRN por incompatibilidad Rh y ABO Pág. 30 Tabla 5.- Anticuerpos relacionados con la EHRN Pág. 32 Tabla 6.- Frecuencia del grupo sanguíneo en el papá Pág. 52 Tabla 7.- Frecuencia grupo sanguíneo en el bebe Pág. 53 Tabla 8.- Titulación de anticuerpos totales (IgM-IgG) Pág. 54 Tabla 9.- Titulación de Anticuerpos IgG Pág. 55 Tabla 10.- Titulación de anticuerpos fijadores y activadores del complemento frente a eritrocitos A Pág. 56 Tabla 11.- Detección de Hemolisinas por THM Pág. 57 Tabla 12.- Test de Coombs Directo en el Recién Nacido Pág. 58 Tabla 13.- Presencia de EHRN Pág. 59 Tabla 14.- EHFN según anticuerpos totales de la madre Pág. 60 Tabla 15.- EHFN según prueba de Coombs Directo Pág. 61 Tabla 16.- EHFN según presencia de Hemolisinas Pág. 62 Tabla 17.- Sensibilidad y Especificidad del Coombs Directo en EHFN Pág. 63 Tabla 18.- Sensibilidad y Especificidad de la Determinación de Hemolisinas por THM en EHFN Pág. 64

15 INDICE DE FIGURAS Figura 1.- Esquema IgM Pág. 13 Figura 2.- Esquema IgG Pág. 13 Figura 3.- Esquema de antígenos del sistema de grupo sanguíneo ABO Pág. 17 Figura 4.- Esquema de la membrana celular Pág. 19 Figura 5.- Esquema de la transmisión hereditaria del grupo sanguíneo ABO Pág. 21 Figura 6.- Estructura del antígeno H, Antígeno A y Antígeno B Pág. 23 Figura 7.- Distribución normal y sesgada de una muestra Pág. 45 Figura 8.- Suspensión de Glóbulos Rojos al 5% Pág. 46 Figura 9.- Materiales y Equipos usados Pág. 47 Figura 10.- Determinación de grupo sanguíneo Pág. 48 Figura 11.- Presencia de Anticuerpos Aglutinantes Pág. 48 Figura 12.- Ausencia de anticuerpos aglutinantes con 2-ME Pág. 52 Figura 13.- No hemolisis, Hemolisis parcial y Hemolisis total Pág. 53

16 Abreviaturas EHFN: EHRN: IgG: IgM: IgA: RTH: ISBT: CD: CI: NH: HT: HP: THM: Enfermedad Hemolítica Feto Neonatal Enfermedad Hemolítica del Recién Nacido Inmunoglobulina G Inmunoglobulina M Inmunoglobulina A Reacción Transfusional Hemolítica Sociedad Internacional de Transfusión de Sangre Coombs Directo Coombs Indirecto No Hemolisis Hemolisis Total Hemolisis Parcial Tiempo de Hemolisis Media

17 DETECCION PRECOZ DE HEMOLISINAS MATERNAS DEL SISTEMA ABO Y SU RELACION CON LA ENFERMEDAD HEMOLITICA FETONEONATAL EHFN EN EL HOSPITAL MATERNOLOGICO GERMAN URQUIDI COCHABAMBA AGOSTO A OCTUBRE DEL 2010 I.- INTRODUCCION La enfermedad hemolítica del feto y del recién nacido es una afección inmunológica autoinmune, en la cual la sobrevida del hematíe fetal y del recién nacido está acortada debido a la acción de anticuerpos maternos que pasan a través de la placenta y que son específicos contra antígenos de origen paterno ausentes en la madre y presentes en las células rojas fetales y del recién nacido. 22 Es común asociar la enfermedad hemolítica del recién nacido con incompatibilidad Rh(D). Sin embargo los conocimientos actuales han permitido precisar que no solo son importantes los anticuerpos específicos contra este antígeno, sino también los dirigidos contra otros antígenos del sistema Rh, ABO y otros sistemas antigénicos presentes en los eritrocitos humanos. 5 En la parte clínica, dos tercios de los casos de enfermedad hemolítica (EHFN) del recién nacido son debidos a anticuerpos del sistema ABO esta incompatibilidad se conoce como EHFN-ABO. 22 El hecho de que los anticuerpos involucrados en la enfermedad, estén presentes de forma natural, en todas las personas que carecen del antígeno correspondiente, sin inmunización previa, explica porque el primer hijo puede ser a menudo afectado. Los individuos del grupo O, presentan una mayor proporción de IgG anti-a y anti-b que los otros grupos, por lo tanto la incompatibilidad mas frecuente se produce en madres grupo O. 13

18 Estadísticamente, alrededor del 20% de la totalidad de las gestaciones ofrecen incompatibilidad ABO y de este grupo el 75% está integrado por madres del grupo O que llevan en su seno hijos del grupo A ó B. sin embargo, solo en una pequeña proporción de las gestaciones ABO incompatibles, se manifiesta la enfermedad hemolítica, y, prácticamente, tales casos de enfermedad quedan limitados a los hijos A ó B nacidos de madres del grupo O. Aunque en la mayoría de los casos no representa riesgo para el feto y el recién nacido, se han presentado casos graves de hidrops y muerte en madres con altos títulos de IgG anti-a y/o anti- B. Además, se ha propuesto la incompatibilidad ABO como causa de infertilidad. 22 La EHFN presenta diferencias entre las razas y su distribución no es igual en todos los continentes. Diferentes trabajos estiman que la incidencia es mayor en negros que en blancos, con frecuencia relativa de 6:1. En los países anglosajones, se presenta en forma benigna. Mientras que en los países de Sudamérica, América central, Oriente Medio, Asia y Africa, puede llegar a ser severa. 20,22 La importancia transfusional del sistema ABO radica en las características de sus anticuerpos, naturales, regulares y activos a 37 grados centígrados, capaces de activar el complemento y provocar lisis intravascular. 1

19 II.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA La Enfermedad Hemolítica Fetoneonatal (EHFN) es debida a una agresión inmune de eritrocitos fetales por anticuerpos maternos, el diagnóstico en el recién nacido se realiza por la presencia de un test de Coombs Directo positivo ante una madre O y un hijo A o B pero existen casos en los que esta prueba da negativa lo cual dificulta su diagnóstico. Por este motivo se plantea la interrogante de la siguiente manera: Existe relación entre la determinación precoz de hemolisinas maternas del Sistema ABO y la posible presentación de EHFN? III.- JUSTIFICACION Los protocolos de estudios de la embarazada, no incluyen la investigación de incompatibilidad ABO. Además los estudios inmunológicos, en el recién nacido presentan ciertas particularidades. En primer lugar el test de Coombs directo no siempre es positivo, solo del 20% al 40% de los casos, debido a que los reactivos comerciales solo permiten detectar cantidades mayores a 100 moléculas de IgG fijadas a la superficie del eritrocito, por lo que los resultados son débilmente positivos y pueden ser negativos a menos que se utilice una prueba muy sensible. 8 La literatura indica que la presencia de hemolisis en una mezcla de suero materno/ hematíes fetales, es indicativa de enfermedad hemolítica 15 Las pruebas empleadas para diagnosticar la incompatibilidad ABO a veces resultan insuficientes. Es posible establecer el diagnóstico, si el suero materno es capaz de hemolizar los hematíes del recién nacido a 37 C. La técnica de hemolisis utilizada pone de manifiesto la presencia de anticuerpos maternos fijadores y

20 activadores del complemento, que podrían estar involucrados en la destrucción inmune de los eritrocitos fetales 11 IV.- HIPOTESIS "Existe relación entre la determinación precoz de hemolisinas maternas del Sistema ABO y la posible presentación de EHFN" V.- OBJETIVO GENERAL Determinar la relación existente entre la detección precoz de hemolisinas maternas del Sistema ABO y la posible presentación de EHFN en el Hospital Maternológico Germán Urquidi en Cochabamba de Agosto a Octubre del VI.- OBJETIVOS ESPECIFICOS Determinar anticuerpos aglutinantes anti-a y anti-b en mujeres embarazadas. Determinar anticuerpos anti-a y anti-b fijadores y activadores del complemento en mujeres embarazadas Evaluar la posible aplicación de la técnica de tiempo hemolisis media (THM) Relacionar la evolución clínica de los recién nacidos con los anticuerpos encontrados en sus madres.

21 VII.- MARCO TEORICO 7.1 SISTEMAS DE GRUPOS SANGUINEOS Los diversos grupos sanguíneos se definen por la presencia de determinados antígenos eritrocitarios, plaquetarios, leucocitarios y séricos. Dichos antígenos son el producto directo o indirecto de la actividad de los genes y se transmiten hereditariamente según las leyes mendelianas. 11 Los genes determinantes de los grupos sanguíneos transmiten generalmente caracteres codominantes, es decir, que se expresan tanto en individuos homocigotos como heterocigotos. No obstante, se admite que existen genes, denominados amorfos que intervienen en la herencia de los grupos sanguíneos pero no generan productos que puedan identificarse como antígenos. 11 Cuando la herencia de unos de sus antígenos está relacionada con la de otros se dice que todos ellos constituyen un sistema de grupo sanguíneo. Los genes que intervienen en la producción de los antígenos de cualquier sistema de grupo sanguíneo suelen ocupar un loci equivalentes en pares de cromosomas homólogos. 6 Se denomina genotipo a la suma de los genes heredados, y fenotipo, al conjunto de caracteres que se expresan en un determinado individuo. Todos los antígenos de los grupos sanguíneos han sido definidos serológicamente por el hallazgo de los anticuerpos correspondientes. 11 Cabe señalar que las combinaciones posibles entre los diferentes antígenos sanguíneos son tantas, que el tipo sanguíneo puede considerarse una característica peculiar de cada individuo prácticamente irrepetible. 11

22 El estudio de los grupos sanguíneos es de gran interés para la etnología y para la medicina forense. Por otra parte, el tipo sanguíneo de cada individuo, por ser indeleble y hereditario, tiene utilidad en la investigación de la paternidad, sobre la base de que nadie puede heredar lo que sus padres no poseen, pero es en medicina clínica donde su papel es trascendental, especialmente en la prevención y tratamiento, tanto de reacciones transfusionales como en la EHFN. 16 Tabla1.- SISTEMA PRINCIPALES GRUPOS ERITROCITARIOS DE IMPORTANCIA CLÍNICA ANTIGENOS MAS IMPORTANCIA CLINICA DE LOS IMPORTANTES ANTÍGENOS RTH EHFN ABO A, B, AB, O Si Si Rh D, C, c, E, e Si Si MNSs M, N, S, s, U Si Si Lewis Le a, Le b Muy raro No P P 1.P 2 Raro No Lutheran Lu a, Lu h Raro Raro Kell K, k, Kp a, Kp b Si Si Duffy Fy a,fy b Si Si Kidd Jk a, Jk b Si Si RTH: reacciones transfusionales hemolíticas; EHFN enfermedad hemolítica Fetoneonatal Fuente."Hematológica Clínica", Sans-Sabrafen", 3 a ed.. Barcelona-España, 1994

23 Se han descrito en la bibliografía unos 700 antígenos eritrocitarios y se han organizado por la Sociedad Internacional de Transfusión de Sangre (ISBT) en 29 sistemas de grupo sanguíneo. 26 Muchos antígenos eritrocitarios descriptos son antígenos de alta frecuencia o antígenos públicos expresados por la mayoría de los donantes, mientras que otros extremadamente raros se denominan antígenos privados. 6 El conocimiento de las características de los antígenos y anticuerpos eritrocitarios es de gran trascendencia, puesto que muchos de los antígenos eritrocitarios se hallan también ampliamente expresados en otras células y fluidos del organismo ANTÍGENOS DEL GRUPO SANGUÍNEO Antígeno eritrocitario es toda estructura presente en la membrana del eritrocito que reúne las características necesarias (tamaño, complejidad, accesibilidad, etc.) para que al ponerse en contacto con las células inmunocompetentes de un sistema inmunitario lo reconozca como extraño, dando lugar a la activación de dichas células. 15 La mayoría de los antígenos eritrocitarios se hallan bien expresados en el recién nacido (Rh, Kidd, Duffy, MN), otros se expresan mucho más débilmente que en el adulto (A, B) y algunos están prácticamente ausentes (Lewis, I). Su distribución es variable así los antígenos del sistema ABO se encuentran en todas las células de la sangre, tejidos y fluidos corporales mientras que los pertenecientes a Rh se localizan exclusivamente en el eritrocito. 11 Los antígenos que son producidos por alelos en un locus de un solo gen o por un grupo de loci estrechamente ligados componen un sistema antigénico de grupo sanguíneo.

24 Muchas estructuras asociadas a la membrana de las células sanguíneas y los componentes del plasma pueden ser definidas como antígenos porque tienen la capacidad de reaccionar con un anticuerpo complementario o con un receptor celular. La mayoría de estos antígenos son también inmunógenos, ya que son capaces de provocar una respuesta inmunológica mediada por anticuerpos si son introducidos como sustancias extrañas dentro de un huésped sensible. 11 La capacidad de un antígeno de provocar una respuesta inmune se conoce como inmunogenicidad. La inmunogenicidad viene determinada no sólo por sus características innatas sino también por la inmunosensibilidad genéticamente determinada del huésped. Las características del antígeno que determina su inmunogenicidad incluyen el grado de extrañeza, el tamaño y configuración molecular, que pueden cambiar con la temperatura, ph y el ambiente iónico; y la complejidad antigénica, determinada por el número de epítopos o determinantes antigénicos disponibles. 6 Los antígenos de grupo sanguíneo varían grandemente en su capacidad de provocar una respuesta inmune. Los antígenos D y otros (Rh) y el K (Kell) son ciertamente los más inmunogénicos y por lo tanto en todas las transfusiones sanguíneas debiera cotejarse la compatibilidad en cuanto a estos antígenos entre el donante de sangre y el receptor CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS La composición y complejidad química y el tamaño molecular de un antígeno determinan muchas de sus propiedades físicas y biológicas, incluyendo la inmunogenicidad. Por regla general, los polisacáridos puros no son inmunogénicos, excepto en ciertas especies como los humanos y los ratones (Goodman, 1994). 6 Además, los lípidos o ácidos nucleicos puros no son inmunogénicos, pero pueden ser antigénicos, ya que pueden servir como haptenos. Los haptenos son

25 grupos químicos bien definidos que son demasiado pequeños para ser inmunogénicos por sí mismos, pero son capaces de reaccionar con un anticuerpo específico inducido cuando el hapteno está unido a una proteína transportadora. 6 Aunque las proteínas puras pueden ser inmunogénicas, los inmunógenos más potentes son generalmente glicoproteínas o lipoproteínas macromoleculares complejas. Por lo tanto no sorprende que los antígenos eritrocitarios cuya composición química ha sido determinada sean generalmente glicoproteínas. lipoproteínas o glucolípidos. En las glicoproteínas, la inmunogenicidad también puede estar influenciada por la extensión de la ramificación en las cadenas laterales del polisacárido. 6 Mientras que la inmunogenicidad de un antígeno se relaciona con la estructura molecular compleja total, las zonas donde el antígeno se combina con el anticuerpo específico (esto es, los epítopos) están generalmente limitadas a uno o a unas pocas estructuras simples como azúcares terminales o residuos amínicos o de ácidos grasos con frecuencia localizados en el exterior y que corresponden a las superficies más móviles de la molécula. 6 El número de sitios antigénicos de una sustancia extraña, ya sea una molécula o una célula compleja, contribuirá a la fuerza y al resultado final de una respuesta inmunológica. Los estudios de antígenos del grupo sanguíneo han demostrado que la densidad antigénica contribuye a la eficacia de la fijación del anticuerpo y también a la amplitud de la activación del complemento, determinando por lo tanto la posibilidad de hemolisis. 6

26 CLASIFICACIÓN DE LOS ANTÍGENOS 14 Antígenos celulares: Se encuentran ampliamente difundidos en la naturaleza (vegetales, animales y humanos). Antígenos pluritisulares: Se encuentran dentro de un mismo individuo en todos sus tejidos. Antígenos marcadores de una línea celular: Se encuentran presentes sólo en un tipo de células sanguíneas. Antígenos solubles: Son estructuras glúcidicas no están unidas a un polipéptido, están ancladas sobre estructuras lipídicas, presentes en plasma, saliva, lágrimas, plasma seminal, etc ANTICUERPOS DEL GRUPO SANGUÍNEO Los anticuerpos son inmunoglobulinas producidas específicamente por el sistema inmunitario tras una estimulación antigénica. Las inmunoglobulinas son moléculas proteicas producidas en respuesta a estimulaciones antigénicas y que demuestran actividad específica de anticuerpo, y se encuentran en varias localizaciones anatómicas: 14 Los anticuerpos están presentes dentro de compartimientos unidos a la membrana citoplasmática. Presentes en el plasma de la sangre y, en menor grado, en el líquido donde se acumulan los anticuerpos secretados por células B. Presentes en líquidos secretados como el moco y la leche, a las cuales se transportan de forma específica.

27 VISIÓN GENERAL DE LA ESTRUCTURA DEL ANTICUERPO Desde de los primeros estudios de las moléculas de anticuerpo se determinaron varias características estructurales y funcionales: Todas las moléculas de anticuerpo tienen una estructura general similar, responsable de ciertas características fisicoquímicas comunes como su carga y su solubilidad. 14 Todos los anticuerpos tienen una estructura central común de dos cadenas ligeras idénticas (kappa o lambda) y dos cadenas pesadas idénticas (alpha, gamma, delta, mu, o epsilon) se mantienen unidas mediante interacciones no covalentes que se encuentran estabilizadas por puentes disulfuro. 14 El anticuerpo o innmunoglobulina es una glicoproteina en forma de "Y" y presenta una región bisagra; que permite al anticuerpo una flexibilidad para acceder a más sitios antigénicos. Fragmentos Fab; que contienen las porciones variables del anticuerpo, sitios de unión al antígeno. Fragmento Fe; contiene la porción constante del anticuerpo y el sitio de activación del Complemento. 14 La especificidad de un anticuerpo está determinada por las regiones hipervariables o determinantes de complementariedad de una molécula de inmunoglobulina, hay tres regiones hipervariables en cada una de las cadenas ligera y pesada de que consta la molécula de inmunoglobulina: La heterogeneidad de la secuencia de aminoácidos en las regiones hipervariables determina la especificidad de combinación para cada anticuerpo. El sitio de combinación de un anticuerpo, donde está en contacto físico con un determinante antigénico o epítopo, se denomina parátopo. Para antígenos lineales simples, el sitio de combinación puede estar en contacto con cinco o seis aminoácidos o unidades de hexosa. 6

28 La fijación supone la formación de múltiples enlaces no covalentes entre el antígeno y aminoácidos del parátopo. Las fuerzas entre el antígeno y el anticuerpo, que incluyen fuerzas electrostáticas, fuerzas de Van der Waals, puentes de hidrógeno interacciones hidrofóbicas, se convierten en significativas cuando la distancia entre los grupos que interactúan es pequeña. Como resultado; cuanto mejor sea el ajuste físico entre el epítopo y el parátopo, más alta es la energía total de unión, y más grande es la afinidad de la reacción entre anticuerpo y antígeno. 6 La mayoría de los anticuerpos de grupo sanguíneo clínicamente significativos se encuentra dentro de las clases de inmunoglobulinas IgG o IgM; ocasionalmente hay formas IgA entre autoanticuerpos y contra antígenos en ciertos sistemas de grupo sanguíneo DESCRIPCIÓN DE INMUNOGLOBULINAS MÁS SIGNIFICATIVAS EN INMUNOHEMATOLOGÍA. a) Inmunoglobulina M: IgM Son moléculas de gran tamaño ya que comprende 5 subunidades de inmunoglobulina (pentámero). Son anticuerpos completos No atraviesan la placenta Son activos a temperaturas comprendidas entre 4 o C y 20 C, por lo que tienen escasa trascendencia clínica, pero algunos son activos a 37 C y pueden ocasionar accidentes transfusionales graves. Producen hemolisis intravascular. Aglutinan en medio salino Son muy buenos activadores del complemento

29 Fig.1 Esquema de IgM Fuente: Inmunohematología. Sistema del complemento 3.bp.blogspot.com/.../s400/Imagen1igm.png b) Inmunoglobulina G: IgG Es la inmunoglobulina que se encuentra en mayor concentración en el plasma. Son moléculas relativamente pequeñas ya que comprenden una sola subunidad de inmunoglobulina (monómero). Son anticuerpos incompletos o sensibilizantes que se fijan en la membrana del eritrocito sin aglutinarlo. Son capaces de atravesar la placenta. Son activos a 37 C. Pueden causar hemolisis extravascular. Se activa en condiciones óptimas Fig. 2. Esquema de IgG

30 Fuente: biomodel.uah.es/model1j/prot/igg-estruct.gif CLASIFICACIÓN DE LOS ANTICUERPOS 14 a) S egún el origen del antígeno Heteroanticuerpos: son anticuerpos dirigidos a antígenos de otra especie. Aloanticuerpos: son aquellos producidos por un individuo contra antígenos de otro individuo de la misma especie, son los más frecuente e importantes en inmunohematología. Autoanticuerpos: las inmunoglobulinas son originadas en un individuo contra antígenos presentes en sus propias células. b) Según frecuencia de presentación Anticuerpos Regulares: Son aquellos que aparecen de forma constante en los individuos que no poseen el antígeno correspondiente. Anticuerpos Irregulares: Son aquellos que no aparecen de forma regular, pueden o no estar presentes cuando falta el antígeno. c) Según causa de aparición Anticuerpos Naturales: Son aquellos en los que no puede demostrarse el estímulo que ha desencadenado su formación, se supone que la aparición ha tenido lugar como respuesta a la exposición a ciertas sustancias que están presentes en el medio ambiente o en la dieta y que muestran una estructura

31 similar al antígeno eritrocitario en cuestión. Son habitualmente de tipo IgM pero también pueden ser de clase IgG. Anticuerpos Inmunes: Son aquellos que se producen como respuesta a un estímulo antigénico, provocado por transfusiones o embarazos. La incidencia viene dada por la frecuencia del antígeno en la población y por su inmunogenicidad. Son predominantemente de clase IgG aunque pueden encontrarse IgM y/o IgA. d) Según las características de la reacción con el antígeno celular Anticuerpos Aglutinantes: cumplen la primera etapa de fijación sobre la célula y casi simultáneamente, la segunda etapa que es la formación del aglutinado Anticuerpos No Aglutinantes: se fijan sobre los antígenos pero no alcanzan a establecer contacto con otras células y completar el aglutinado Anticuerpos Fijadores y activadores de Complemento: se fijan sobre los antígenos y activan luego los factores del complemento desencadenando la hemolisis. Los anticuerpos pueden reaccionar de diferentes maneras con su antígeno correspondiente, pero siempre de forma específica y reversible. La producción de anticuerpos es más elevada en mujeres multíparas (cada embarazo supone un estímulo antigénico) en estados hiperinmunes y en el curso de enfermedades que afectan el sistema inmunitario, pero su formación depende también de la susceptibilidad individual. 17

32 Para evitar el desarrollo de efectos adversos es indispensable que los eritrocitos transfundidos no posean antígenos capaces de reaccionar con anticuerpos presentes en el receptor. 6 La mayoría de los aloanticuepos de grupo sanguíneo se producen como resultado de la inmunización a antígenos eritrocitarios extraños. La presencia de dichos aloanticuerpos eritrocitarios u otros antígenos de célula sanguínea hace necesaria la selección de componentes específicos antígeno negativo para la transfusión SISTEMA DE GRUPO SANGUÍNEO ABO El sistema ABO fue el primer sistema de grupo sanguíneo que se descubrió. Una serie de pruebas publicadas por Kart Landsteiner en 1900 llevó al descubrimiento del sistema de grupo sanguíneo ABO y el desarrollo de procedimientos de tipificación de rutina. Landsteiner analizó muestras de sangre propia y de varios colegas y combinó los sueros con suspensiones de glóbulos rojos de cada uno. La observación de aglutinación en algunas mezclas, pero no en otras, le permitió clasificar los tipos de sangre en tres grupos, denominados A, B y O. Landsteiner advirtió que la presencia o ausencia de sólo dos antígenos, A y B. era suficiente para explicar la existencia de tres grupos y predijo la de un cuarto. También demostró que el suero de todas las personas contiene anticuerpos contra los antígenos ausentes en los glóbulos rojos. En 1902, dos discípulos de Landsteiner, von Decastello y Stürli, identificaron el grupo AB. 1 El sistema ABO presenta singularidades con respecto a otros sistemas de grupos, como son la ubicuidad de sus antígenos en el organismo y la presencia de anticuerpos de manera natural, recíprocos constantes y previsibles contra los antígenos que no poseen. Ambos hechos le confieren características diferenciales con gran trascendencia en su significado clínico, que se traducen en importancia

33 desde el punto de vista transfusional, en los transplantes y en otros procesos patológicos. 10 A causa de estos anticuerpos, la transfusión de sangre ABO incompatible podría provocar hemolisis intravascular grave, así también las otras manifestaciones de reacciones hemolíticas transfusionales agudas y frecuentemente la muerte inmediata. 10 El sistema de grupo sanguíneo ABO consiste en tres antígenos A B y H. y cuatro fenotipos: Grupo A. B. AB y O, A y B son antígenos autosómicos codominates y se expresan en los eritrocitos de los grupos A 1 B y AB 1 respectivamente. En cambio, el fenotipo del grupo O es un fenotipo autosómico recesivo, reflejando la ausencia de un gen funcional A o B. Fig. 3: Esquema de antígenos del Sistema de grupo sanguíneo ABO Fuente: htp;// Los individuos del grupo O expresan el antígeno H, precursor biosintético de los antígenos A y B. El grupo O es el fenotipo ABO más frecuente en todas las poblaciones. La expresión de los antígenos ABO en los eritrocitos se acompaña siempre de la presencia regular de anticuerpos naturales frente al antígeno(s) antitético que falta. 6

34 Tabla 2.- Determinación globular y sérica del grupo ABO y frecuencia de fenotipo PRUEBA GLOBULAR PRUEBA SERICA FRECUENCIAS % EN POBLACION DE E.E.U.U. Anti-A Anti-B Eritrocitos Interpretación Blanca Negra Nativa Americanos A B O A B AB < Fuente: "El Laboratorio en el Diagnostico Clínico", Jhon Bernard Henry.MD, Ediciones Marban, 20 ed, Madrid - España El sistema ABO está compuesto por aloantígenos A y B, que pueden estar presentes en la membrana del eritrocito, en otras células y en secreciones. Los antígenos A y B fueron inicialmente identificados sobre células de los eritrocitos humanos, no obstante, ellos fueron subsecuentemente hallados en secreciones y sobre la superficie de células epiteliales y endoteliales también. Además de los humanos, similares estructuras antigénicas fueron también identificadas en una variedad de organismos, incluyendo microbios y plantas. Las sustancias A y B empiezan a formarse en las primeras semana del desarrollo fetal, pero no adquieren toda su expresión hasta pasado varios meses, incluso meses después del parto. Esto es debido a que el número de veces que se repite la sustancia en la membrana del eritrocito al principio es reducido, adquiriendo la densidad máxima de una forma paulatina. La densidad de estos puntos antigénicos puede llegar hasta 1-1,2 x 10 6 por célula en el adulto. 15

35 Fig. 4 Esquema de la membrana celular y ubicación de algunos antígenos de grupo sanguíneo Fuente: La localización de estos antígenos es extramembranal. En su composición podemos diferenciar dos partes: una, formada por oligosacáridos, donde se presentan las variaciones antigénicas y otra menos conocida, que podemos llamar soporte, formada por glucoproteinas, cuando el antigeno se encuentra en secreciones, o por glucolípidos, cuando está fijado a la membrana de eritrocitos, leucocitos u otras células epiteliales o endoteliales. 15 La importancia transfusional del sistema ABO radica en las características de sus anticuerpos: naturales, regulares activos a 37 C y capaces de activar el complemento y de provocar una hemolisis intravascular de los eritrocitos, por lo que, si no se respetan escrupulosamente las reglas de compatibilidad, pueden producirse reacciones graves, incluso fatales, ya en la primera transfusión. 17

36 En los últimos años se ha avanzado de manera muy importante en el conocimiento integral de este sistema. Por una parte se ha determinado no sólo la estructura bioquímica de sus antígenos sino también la de los diferentes subgrupos. El uso de anticuerpos monoclonales ha permitido la identificación de diferente isotipos, con diferencia inmunoquímicas en sus epitopes; además, se han localizado en los diferentes tejidos del organismo. Otro avance importante ha sido la descripción de las bases moleculares genéticas de este sistema, tanto de los grupos como de los subgrupos, la expresión en un determinado tejido de un isotipo está relacionada con propiedades celulares tales como la maduración, la diferenciación y la migración celular. Este hecho es parte de un proceso ontogénico, gobernado por un programa genético que pude alterarse en procesos tales como la carcinogénesis. 21

37 7.2.1 GENÉTICA DEL SISTEMA ABO El grupo sanguíneo ABO se transmite hereditariamente siguiendo las leyes de Mendel. Intervienen tres genes alelomórficos independientes, denominados A, B y O, que se sitúa en el mismo locus del cromosoma Fig. 5: Esquema de la Transmisión hereditaria del grupo sanguíneo ABO Fuente: Los glucoesfingolípidos portadores de oligosacáridos A o B son componentes integrales de la membrana de los eritrocitos y células epiteliales y endoteliales; también existen en forma soluble en el plasma. Las secreciones como la saliva contienen moléculas glucoproteicas que en las personas con gen Se pueden transportar oligosacáridos idénticos. En la leche y la orina también se encuentran oligosacáridos A y B no fijados a proteínas de transporte ni moléculas lipídicas. Los genes A y B son codominantes y producen enzimas que actúan como transferasas específicas, capaces de transformar parcialmente una sustancia presente en los eritrocitos denominada H, fijando sobre ella un azúcar determinado que le confiere la especificidad antigénica final, A o B. El gen O parecía ser amorfo

38 puesto que no expresa ningún producto ni siquiera en estado homocigoto. hoy se sabe que el gen O posee una deleción, codifica para una enzima inactiva incapaz de transferir ningún azúcar, por lo que no modifica la sustancia H. Por ello, en los eritrocitos de los individuos del grupo O se encuentran grandes cantidades de sustancia H. 17 Los genes de tres loci (ABO, Hh y Se) controlan en conjunto la aparición de los antígenos ABH en eritrocitos y secreciones. 1 Los eritrocitos de los lactantes presentan oligosacáridos lineales, con un solo extremo para la fijación de glúcidos H y más tarde A y/o B. En los adultos, en cambio la proporción de oligosacáridos ramificados es elevada. La ramificación proporciona cadenas de oligosacáridos adicionales para la conversión potencial a antígenos H y luego A y B FORMACIÓN Y CONTROL GENÉTICO DE LAS SUSTANCIAS ABO En la base de la construcción de los antígenos ABH y asociados se encuentra un disacárido Galactosa-N-acetilglucosamina que se presenta de dos formas: unión 1-3 en la sustancia de Tipo 1 y unión 1-4 en la sustancia de Tipo 2 15 El eritroblasto construye sus antígenos sobre la sustancia de tipo 2. El gen H controla la formación y acción de una fucosiltransferasa, dando lugar a la unión de una fucosa a la galactosa final de la sustancia precursora. El gen A controla la formación y acción de la N-acetilgalactosaminiltransferasa que agrega una N-acetilgalactosamina a la sustancia H; así se forma la sustancia A. El gen B controla la formación y acción de una galactosiltransferasa, que agrega una galactosa a la sustancia H, con formación de la sustancia B. 15 Si en la

39 dotación genética se encuentras ambos genes A y B, sobre el eritrocito aparecen las dos sustancias A y B. Si en la dotación genética no se encuentran los genes A ni B, por ser homocigoto OO, sobre el eritrocito no habrá sustancia ni A ni B quedando sólo la sustancia H sin modificar. La célula salivar construye los antígenos principalmente sobre sustancia de Tipo 1. El antígeno H es en este caso aportado por una enzima producida por un gen vecino al H, el gen Se Fig.6 Estructura del Antígeno H, Antígeno A y Antígeno B Fuente:

40 El gen H es dominante y de muy alta frecuencia mientras que el gen h es muy raro y se considera silencioso o amorfo, ya que no se le atribuye ningún producto. 9 El fenotipo h (hh) se denomina Bombay y es extremadamente raro, los individuos que poseen este fenotipo carecen del gen H y por lo tanto no pueden producir sustancias A o B y en sueros se detectan anti-a. anti-b y anti-h, estos anticuerpos anti- H actúan a 37 C y activan el complemento, por lo que tienen significación clínica. 9 El carácter secretor está determinado genéticamente por un sistema de transmisión mendeliana constituido por dos alelos: Se, de carácter dominante, y sé que es recesivo. El 80 % de los individuos de raza blanca son secretores porque poseen el gen Se de forma homocigoto o heterocigoto. y el 20 % restante son No secretores por ser homocigotos para el gen Se. 9 Los antígenos del sistema HhSese están situados uno al lado del otro en el brazo largo del cromosoma 19. Cada uno construye una enzima donde una es copia casi idéntica de la otra, ambas transportan una mucosa; pero lo hacen sobre distinto sustrato, molécula de tipo 2 para el H y de tipo 1 para el Se. Las dos producen el mismo antígeno, el antígeno H que es sustrato para el ABO. Pero H y Se funcionan en distintas células, el primero se especializó en eritroblastos y es un grupo sanguíneo, el otro se especializó en células mucosas y es un grupo tisular base del grupo ABO en saliva. 9

41 7.2.3 EXPRESIONES FENOTÍPICAS DEL SISTEMA ABO. Cada individuo hereda 2 genes del sistema ABO, uno de cada progenitor, los cuales determinan que antígenos están presentes en los hematíes. Del fenotipo A pueden distinguirse 2 subgrupos principales Ai y A2 que dan expresión de 2 alelos. Ambas formas antigénicas son reconocidas por los anticuerpos anti-a naturales del grupo B y del grupo O, aunque los Ai reaccionan más intensamente que los A2.Serológicamente se diferencian entre sí de manera diferente frente a extractos vegetales (lectina anti- Ai de Dolichos bijlorus). 17 El 99% de los individuos del grupo sanguíneo A pertenecen a los subgrupos A 1 y A 2, de los cuales el 80% son A 1 y el 20% A 2. Existen grupos más débiles, (A 3, A x, A el, A m, etc) que se presentan en el 1% de la población. Del fenotipo B se pueden distinguir cuatro tipos que son BI, BII, BIII, BIV. Tabla 3: Sistema ABO. Genotipos posibles para cada fenotipo FENOTIPO A 1 A 2 B A 1 B A 2 B O GENOTIPOS POSIBLES A 1 A 1 A 1 A 2 A 1 O A 2 A 2 A 2 O BB BO A 1 B A 2 B OO FRECUENCIAS % 45,56% 8,65% 3,57% 42,10%

42 Fuente: Hematologica Clinica, Sans-Sabrafen, 3ª ed., Barcelona-España ANTÍGENOS DEL SISTEMA ABO A diferencia de los otros sistemas de grupo sanguíneo, en que los genes se codifican directamente para los correspondientes antígenos, en este sistema los genes A y B codifican para unas enzimas que posteriormente, son responsables de la síntesis del antígeno correspondiente mediante la unión de determinados carbohidratos o precursores glicoproteicos o glicolípidos. 17 Los antígenos del sistema ABO tienen una amplia distribución en el organismo, se encuentran en la membrana de los eritrocitos, de la plaquetas y de leucocitos, aunque la expresión antigénica es menor en estos dos últimos casos. También se ha demostrado la presencia de estos antígenos en el endotelio vascular, en los epitelios digestivo, urinario, respiratorio, genital y cutáneo, en el glomérulo renal y en las glándulas mucosas del tubo digestivo y de los aparatos respiratorio y genital. Se encuentran también en forma soluble en el plasma de todos los individuos y también en la saliva y otras secreciones de los sujetos secretores. 11 Sus correspondientes anticuerpos causan dañinas reacciones inmunes, de este modo, actúan como barreras de histocompatibilidad ante diferentes sucesos de transfusión no sólo de eritrocitos sino también trasplante de tejidos y órganos. Aún no se conoce totalmente el papel biológico de los antígenos ABH. La disminución de la expresión de los antígenos A y B puede producirse en neoplasias y con frecuencia está asociada con un incremento del potencial metastásico. Además, los múltiples estudios han asociado tipos ABO específicos con una mayor incidencia de determinadas enfermedades, incluyendo trastornos autoinmunes, neoplásicos e infecciosos. 6

43 7.2.5 ANTICUERPOS DEL SISTEMA ABO Los anticuerpos de los antígenos ABO son los más importantes en la medicina transfusional. En general, los anticuerpos ABO son naturales, surgiendo en ausencia de estimulación inmune por transfusión o embarazo. Se cree que el estímulo para la formación de anticuerpos ABO puede ser la exposición a sustancias del tipo-abh encontradas en la naturaleza, en particular en las paredes celulares bacterianas. La distribución de las bacterias es muy amplia y su presencia en la flora intestinal, el polvo, los alimentos y otros sustratos asegura la exposición constante de todas las personas a sustancia ABO-símiles, es decir similares a los antígenos de tipo A o B. 6 Los individuos inmunocompetentes reaccionan contra los antígenos ambientales produciendo anticuerpos contra aquellos ausentes en el organismo. Así, las personas de los grupos O y B sintetizan anticuerpos anti-a y las de los grupos O y A. anti-b. Las de los grupos AB. que exhiben ambos antígenos no generan anticuerpos. Esta explicación "ambiental" de la emergencia de los anticuerpos anti-a y anti-b sigue siendo presuntiva. 1 En general, los anticuerpos anti-a y anti-b se detectan en suero después de los primeros meses de vida. En ocasiones, algunos lactantes producen estos anticuerpos desde el momento del nacimiento, pero la mayor parte de los anticuerpos presentes en sangre de cordón son de origen materno. La síntesis de anticuerpos aumenta, alcanza los niveles del adulto a los 5-10 años de edad y solo descienden ligeramente en edades avanzadas (Auf der Maur, 1993). 6

44 La determinación de anti-a y anti-b en suero de recién nacidos o lactantes menores de 4 a 6 meses no puede considerarse válida porque algunos o todos los anticuerpos de los lactantes son adquiridos por transferencia placentaria de la IgG anti- A y anti-b materna. 1 Las inmunoglobulinas anti-a predominantes en los individuos del grupo B y anti-b en los grupos A, son IgM, aunque se advierten montos menores de IgG. Los individuos del grupo O presentan cantidades mayores de IgG que los otros grupos. Como la IgG atraviesa placenta con facilidad y la IgM no, en los hijos de las madres del grupo O el riesgo de EHFN es mayor que en los hijos de madres del grupo A o B. 1 En general, los anticuerpos del ABO son detectados como aglutininas salinas a temperatura ambiente, con reactividad óptima a 4 o C. La mayoría de los anticuerpos ABO naturales son de isotipo IgM, aunque también existen anticuerpos IgA e IgG. Por estímulos como vacunas o sueros conteniendo sustancias de origen porcino o equino, pueden aparecer anticuerpos de tipo inmune. A diferencia de las aglutininas naturales, los anticuerpos ABO inmunes son predominantemente de tipo IgG y son reactivos a 4 o C y 37 C. Además dichos anticuerpos son generalmente de titulo más alto y menos fácilmente neutralizados por sustancias solubles de grupo sanguíneo. Los anticuerpos ABO pueden fijar el complemento y pueden causar hemolisis in vivo e in vitro. 6 Clínicamente, los anticuerpos ABO son causa de reacciones hemolíticas transfusionales y de EHFN. Los anticuerpos ABO son también causa de rechazo agudo en trasplantes de órganos sólidos, como consecuencia, los transplantes de órgano sólido deben ser compatibles con el suero del receptor. 12

45 7.3 ENFERMEDAD HEMOLITICA FETONEONATAL (EHFN) En un principio el síndrome fue denominado Eritroblastosis Fetal porque el rasgo típico era el exceso de eritroblastos circulantes. La hemolisis determina la presencia de eritrocitos nucleados en circulación, en diferentes estados de maduración. 13 Más tarde el nombre original fue sustituido por Enfermedad Hemolítica del Recién Nacido (EHRN)y finalmente por EHFN que define en forma más completa el cuadro de esta patología.. 13 La EHFN es debida a una agresión inmune de eritrocitos fetales como consecuencia del paso transplacentario de anticuerpos maternos. Normalmente, la placenta es impermeable al paso de células sanguíneas y macroglobulinas (IgM), pero permiten el paso de globulinas de bajo peso molecular (IgG). Durante el embarazo son frecuentes pequeñas hemorragias que facilitan la entrada de eritrocitos fetales en la circulación materna. Si los eritrocitos fetales poseen un antígeno extraño incompatible con el de la madre, esta puede inmunizarse y producir anticuerpos. 11 Las consecuencias fisiopatológicas de estas incompatibilidades dependen del grado de inmunización materna, de la clase de Inmunoglobulina producida, de la afinidad de ese anticuerpo por el antígeno fetal, etc. Pueden ser tan graves que ocasionen la muerte intrauterina, generalmente con anemia y edema, o pueden ser bastante benignas para permitir la prosecución de la gestación hasta el término de la misma y poder presentar o no una hiperbilirrubinemia. La bilirrubina, debido a su carácter liposoluble, tiende a depositarse en diferentes tejidos, pero especialmente en el SNC, provocando trastornos neurológicos (ictericia nuclear o kemicterus) que pueden llegar a ocasionar la muerte del recién nacido. 13

46 Tabla 4: Características de la enfermedad hemolítica fetoneonatal por incompatibilidad Rh y ABO RH ABO Grupos sanguíneos: Madre Rh negativo O Niño Rh positivo A o B Gravedad de la enfermedad Grave Leve Ictericia Grave Leve Esferocitos en extendido de sangre periférica Ninguno Por lo general presentes Anemia Grave Si hay, es leve Prueba de Coombs directa Positiva Negativa o positiva débil Fuente: "Hematológica Fundamentos y aplicaciones Clínicas". Rodak Bernadette F..2"ed. Buenos Aires-Argentina ETIOPATOGENIA DE LA EHFN Las etapas de la EHFN comienzan con la exposición, en algún momento de la vida de la madre, a antígenos extraños (por transfusión incompatible, hemorragia fetomaterna, trasplante, aborto, amniocentesis, etc). Dependiendo del estado de inmunocompetencia, la futura madre puede responder a esos estímulos con la producción de anticuerpos específicos. Los anticuerpos IgG de subclase 1 y 3 pueden atravesar la placenta. Si los anticuerpos están dirigidos contra antígenos presentes en el eritrocito fetal, se fijan a la membrana eritrocitaria y transforman a los hematíes en células blanco que son eliminadas por los macrófagos tisulares.

47 El abanico de expresión de la EHFN se extiende desde una forma subclínica hasta la muerte del feto o del recién nacido. En la etapa prenatal puede haber anemia y hasta edema (hidrops fetcilis), o puede ser bastante benigna para permitir la prosecución de la gestación hasta el término de la misma. El recién nacido ya no puede eliminar la bilirrubina a través del hígado materno, pudiendo presentar hiperbilirrubinemia. La bilirrubina es de carácter liposoluble y tiende a depositarse en diferentes tejidos, es tóxica, especialmente en el Sistema Nervioso Central. Los consecuentes trastornos neurológicos (ictericia nuclear o Kernicterus) pueden llegar a ocasionar 15, 13 la muerte o dejar en el recién nacido secuelas de espasticidad, ceguera, etc. La aceleración de la destrucción eritrocitaria por anomalías intrínsecas o adquiridas de los eritrocitos es común en el periodo perinatal. La enfermedad hemolítica isoinmune es característica del recién nacido. Las manifestaciones clínicas habituales de la hemolisis se ven modificadas o agravadas por ciertos factores fisiológicos característicos del periodo perinatal. 27 Dentro de las EHFN graves, la más frecuente es la que involucra al antígeno Rh(D) y luego el antígeno K del Sistema Kell y otros antígenos del Sistema Rh. La causa más frecuente de EHFN es sin embargo la isoinmunización a antígenos del Sistema ABO.

48 Tabla 5: Anticuerpos relacionados con la enfermedad hemolítica perinatal Sistemas Anticuerpos ABO Anti-A, -B, -AB Rh Anti-D, -c, -C, -C w, -C x, -e, -E, E w, - ce, -Ce s, -Rh32, -Go a, -Be a, -Evans, - LW Otros Anti-K, -k, -Ku, -Kp a, -Kp b, -Js a, -Js b, -Fya, -Fy3, -Jk a, -Jk b, -M, -N, -S, -s, - U, -Vw, -Far, -M v, -Mit. -Mt a, -Mur, - Hil, -Hut, -Ena, -PP,P k, -Lu a, -Lu b, - Lu9, -Di a, -Di b, -Yt a, -Yt b, -Do a, -Co a, - Wr a Antígenos de baja incidencia Anti-Bi, -By, -Fr a -Good, Rd, -Re a, - Zd Antígenos de alta incidencia Anti-At\ -Jr a, -Lan, -Ge Fuente: "Hematológica Fundamentos y aplicaciones Clínicas". Rodak Bernadette F..2"ed. Buenos Aires-Argentina La exposición materna (por transfusión de sangre, hemorragia feto-materna, amniocentesis o aborto) a antígenos extraños de la sangre fetal lleva a la producción y paso transplacentario de anticuerpos IgG específicos que pueden destruir los glóbulos rojos fetales. 26 Algunas de las alteraciones anatomopatológicas son las consecuencias finales de la hemolisis y regeneración de la sangre, y algunas de las ictericias y de la lesión hepática. Las consecuencias de las excesivas destrucciones y regeneración de la sangre son la esplenomegalia y la hepatomegalia. La anemia fetal desempeña un

49 papel importante en la génesis de la hidropesía fetal o del edema universal del recién nacido ENFERMEDAD HEMOLÍTICA PRODUCIDA POR INCOMPATIBILIDAD ABO Los anticuerpos anti A y anti B de tipo IgG se presentan naturalmente por estimulación ambiental o como respuesta a vacunas conteniendo sustancias ABOsímiles de cerdo o caballo, de allí la alta frecuencia de casos de EHFN debidos a incompatibilidad ABO. En general, se asume que la enfermedad hemolítica ABO es subclínica, leve o moderada y que habitualmente la hiperbilirrubinemia se controla bien con fototerapia. Sin embargo algunos casos requieren varios días de tratamiento con luminoterapia e incluso deben llegar al tratamiento de exanguineotransfusión. La EHFN-ABO puede aparecer en la primera gestación sin necesidad de sensibilización previa. El cuadro clínico no se va agravando en las gestaciones sucesivas. En muchas partes del mundo, particularmente en Sudamérica, Africa y Asia la EHRN debida a incompatibilidad ABO es la causa más importante de ictericia neonatal y la causa más frecuente de transfusiones de recambio en recién nacidos. El diagnóstico de EHRN ABO generalmente es hecho en niños nacidos a término que no están severamente anémicos, pero que desarrollan ictericia durante las primeras 24 horas de vida. La incompatibilidad ABO no se presenta in útero y nunca causa hidrops. 38 Característicamente, la madre es de grupo 0 con anticuerpos IgG anti-a o anti-b que pueden atravesar la placenta a la sangre fetal: el grupo sanguíneo fetal es A o B. El test de antiglobulina directo usualmente es positivo con reactivos de antiglobulina (Coombs) de buena calidad. El frotis sanguíneo muestra un número aumentado de esferocitos. El tratamiento debe ser iniciado rápidamente ya que

50 estos niños pueden desarrollar ictericia lo suficientemente severa para llevar al kernicterus. 38 El neonato debe recibir fototerapia y terapia de sostén. Las unidades de sangre para transfusión de recambio deben ser de grupo 0, con bajo título de anti- A y anti-b sin lisinas de tipo IgG. Un recambio de dos volúmenes (aproximadamente 170 ml/kg) es más efectivo para remover la bilirrubina. Si la bilirrubina aumenta nuevamente a niveles peligrosos, puede efectuarse un nuevo recambio de dos volúmenes. 38 Estadísticamente, alrededor del 20% de la totalidad de las gestaciones ofrecen incompatibilidad ABO y de este grupo el 75% está integrado por madres de grupo O e hijos de grupo A ó B, sin embargo solo en una pequeña proporción de las gestaciones ABO incompatibles, se manifiesta la enfermedad hemolítica, y prácticamente, tales casos de enfermedad quedan limitados a hijos A ó B de madres del grupo 0. 25, 4 La EHFN- ABO podría presumirse por el cuadro clínico. Dado que en la mayoría de los casos la prueba de la antiglobulina (Test de Coombs) directa es negativa. A diferencia de lo que ocurre con la aloinmunización por Rh, en la EHFN- ABO, el test de Coombs directo es positivo solo en el % de los casos lo cual dificulta su diagnostico. 25

51 7.3.3 DIAGNÓSTICO DE LA EHFN EN EL RECIÉN NACIDO El Test de Coombs Directo o prueba de la antiglobulina es positivo sólo en un bajo porcentaje de recién nacidos A o B hijos de madre O con EHFN, debido a la escasa representación de antígenos y a la baja afinidad lo que hace lábil la unión antígeno-anticuerpo. El diagnóstico se realiza por la presencia de un Test de Coombs positivo. También puede ayudar al diagnóstico la presencia de esferocitos en la extensión de sangre periférica ya que los hematíes que tiene anticuerpos anti A o anti B en su membrana pierden parte de esta al pasar por el bazo. Solamente el 10 % de los niños con Test de Coombs directo positivo por isoinmunización ABO desarrollan ictericia significativa donde deba indicarse luminoterapia. Se han descrito casos de kernicterus después de isoinmunización ABO por lo que si los niveles de bilirrubina aumentan hasta cifras en las que está indicada la exanguinotransfusión esta se debe realizar. 32 La EHFN debida a incompatibilidad ABO fue descubierta y descrita por primera vez por Halbrecht en 1944 el cual lo llamo "ictericia precoz" para designar a la ictericia dentro de las primeras veinticuatro horas de vida, antes de manifestarse la ictericia fisiológica. Este autor observó que la mayoría de estos niños pertenecía a un grupo sanguíneo diferente del de sus madres y llegó a la conclusión de que existía una relación de causa a efecto entre la ictericia y la heteroespecificidad. 4 Halbrecht encontró 90 casos de ictericia precoz entre , es decir, uno por cada 180 nacimientos. La característica peculiar del suero del grupo O reside en la naturaleza y las dimensiones moleculares de los anticuerpos en él existentes. ABESON y RASGÓN demostraron que la actividad anti-a y anti-b de los sueros O se localizaba, fundamentalmente, en la fracción de globulinas gamma 7S (IgG), en tanto que tales

52 actividades, en los sueros procedentes de personas del grupo A o del grupo B. estaban localizadas en la fracción de las macroglobulinas 19S (IgM). Si se tiene en cuenta que los anticuerpos de tipo 7S son capaces de atravesar la placenta, cosa que no pueden hacer los anticuerpos de tipo 19S, se comprenderá la causa de las diferencias observadas, según sea el grupo de la madre. Además, la presencia repetidamente comprobada de anticuerpos del tipo 7S en el suero de mujeres que no han sido sensibilizadas por gestaciones previas, explica el por qué se produce frecuentemente la enfermedad hemolítica ABO ya en el primer hijo, en contrataste con lo que sucede con la enfermedad hemolítica por Rh, que raramente afecta al primogénito. 4 Además del tamaño molecular, los anticuerpos Anti -A y Anti-B poseen diversas propiedades serológicas que han conducido a su clasificación en dos grupos: "naturales" e "inmunes". Los anticuerpos naturales aglutinan mejor en medio salino, no causan hemolisis in vitro y son neutralizados por las sustancias de grupo A y B. Por el contrario, los anticuerpos inmunes aglutinan mejor en medio proteico, causan frecuentemente hemolisis in vitro y son resistentes a la neutralización por las sustancias A y B. Los sueros de las madres del grupo O, cuyos hijos han padecido una enfermedad hemolítica ABO, muestran anticuerpos IgG 4 Los anticuerpos del sistema ABO se producen generalmente a partir de los seis meses de vida extrauterina. Por lo tanto, se asume que la presencia de anticuerpos anti- A o anti-b en el recién nacido, se debe a un pasaje transplacentario. Si los anticuerpos maternos transplacentarios poseen la especificidad correspondiente a los eritrocitos fetales, podrán producir hemolisis.

53 Relación entre los anticuerpos y los hematíes fetales para producir hemolisis: Aparición de esferocitos: únicamente en la incompatibilidad ABO Disminución en la capacidad de transporte de oxígeno. Disminución de la utilización de glucosa. Aumento de la fragilidad osmótica. Aumento de la capacidad de fosfato. Disminución de la actividad de la acetilcolinesterasa en los casos de la incompatibilidad por ABO. Aumento de la concentración de carboxihemoglobina, lo cual constituye un índice inespecífico de hemolisis y degradación de la hemoglobina. Concentraciones inferiores a las habituales de Hb F. La ausencia de hemoglobina libre en el suero de los niños afectados de la enfermedad hemolítica, sugiere que la hemolisis se produce en territorio extravascular (Allen y Diamon, 1975). Lo más probable es que la destrucción se produzca, en su totalidad, o cuando menos en su mayor parte a nivel del bazo. 32 La EHFN-ABO ha sido siempre más frecuente, pero su relación con muerte fetal o neonatal es menor que la de la EHFN-Rh o Kell. En este tipo de EHFN los anticuerpos son inmunes y de clase IgG. A la luz de los conocimientos actuales, el diagnóstico de esta enfermedad puede efectuarse precozmente, es posible incluso hacerlo antes del nacimiento e indicar la transfusión fetal intrauterina como método de salvamento de los fetos con hematocrito (Hto) menores o iguales al 30 %. En los recién nacidos se emplean la fototerapia y la exanguinotransfusión para disminuir los niveles séricos de bilirrubina producida por la hemolisis y evitar el kernícterus. Siempre que se sospeche la enfermedad deberá actuarse con rapidez y precisar los anticuerpos involucrados, para de esta forma disminuir su incidencia y morbimortalidad. 8

54 Se ha puesto de manifiesto que un exceso de, anticuerpo materno, demostrado por titulaciones extraordinariamente altas de anti-a o anti-b en la circulación materna o fetal no es el factor decisivo entre la enfermedad hemolítica o su ausencia. Y seguramente es cierto que los anticuerpos descubiertos en la enfermedad hemolítica difieren realmente de los anticuerpos naturales en varios aspectos. 13 Kaplan y colaboradores establecen varios índices para la distinción de la enfermedad hemolítica ABO. La enfermedad se sospechará cuando: La ictericia aparece luego de las 24 horas El nivel de bilirrubina excede los 12 mg/dl antes de las 72 horas La enfermedad ABO se presentó en un hermano anterior Se encuentran esferocitos, microesferocitosis y macrocitos normales del recién nacido. Puede apreciarse un aumento de la fragilidad osmótica. Para no confundir con esferocitosis hereditaria debe hacerse un diagnostico diferencial estudiando a los padres. Los reticulocitos exceden del 10% El Test de Coombs Directo puede ser positivo franco o débilmente positivo, aunque en la mayoría de los casos es negativo debido a la baja afinidad del anticuerpo por la escasa densidad y la menor complejidad antigénica Cuando se demuestra la presencia de anticuerpos IgG anti-a en un niño del grupo A ó anti-b en un niño del grupo B, puede presumirse la existencia de una enfermedad hemolítica ABO. La prueba con el eluato de los eritrocitos del niño puede ser positiva al enfrentarlo a eritrocitos de adulto del mismo grupo ABO, demostrando la especificidad del anticuerpo. La concentración de hemoglobina es normal o baja (raro por debajo de 10 gr%)

55 Disminución de la actividad de la acetilcolinesterasa eritrocitaria. se ha demostrado una disminución de la actividad de esta enzima en los bebés que presentan enfermedad hemolítica ABO comprobada (Kaplan y col. 1964), siendo normal su actividad en los casos estudiados en grupos de niños con enfermedad hemolítica por Rh DIAGNOSTICO DE LABORATORIO En cuanto al Diagnostico de laboratorio, por lo común son normales la cantidad de hemoglobina y el número de eritrocitos, aunque en los casos graves estos valores pueden disminuir. 13 La anemia es rara. La concentración de hemoglobina es, por regla general normal, descendiendo ocasionalmente y solo muy raramente alcanza valores del orden de los 10 gr%. 30 Los datos que demuestran un trastorno hemolítico de mediana intensidad son la policromasia, la reticulocitosis, existe un incremento de los reticulocitos y los valores pueden variar entre 10 y hasta el 30 %, como evidencia de un proceso hemolítico compensado. 27 En relación con el recuento de eritroblastos. se citan cifras variables, entre 8 y 15 %. Generalmente en los casos de enfermedad hemolítica ABO, hay una evidente microesferocitosis (80%). Tal microesferocitosis no es, sin embargo, generalizada, es decir, que se observa, junto a un número mayor o menor de esferocitos un resto, más o menos importante, de eritrocitos macrocíticos normales del recién nacido. Acompañando a la esferocitosis y como secuela de la misma, puede apreciarse un aumento de la fragilidad osmótica, datos ambos que posibilitan la no rara confusión de esta alteración con una esferocitosis hereditaria. Para hacer el diagnostico diferencial puede ser necesario estudiar la sangre de los padres para ver si padecen la tara esferocítica, y aún, en ocasiones, no se consigue de esta forma tal

56 diagnostico, siendo necesario vigilar al niño durante varios meses antes de llegar a una conclusión. 31 Determinación de la Incompatibilidad de grupo. Por regla general se trata de una madre del grupo O y un hijo del grupo A ó B. Prueba de Coombs directa con los eritrocitos del bebé. En la mayoría de los casos es negativa o sólo débilmente positiva. Se han propuesto diversas modificaciones técnicas de la prueba de Coombs. Mediante técnicas de elución por calor o congelación - descongelación se puede aislar el anticuerpo y proceder a su identificación. 25

57 VIII METODOLOGIA O DISEÑO DEL ESTUDIO 8.1 TIPO DE INVESTIGACION.- E l tipo de investigación a utilizar en este trabajo será observacional no experimental, cuantitativo, correlacional, cualitativo y transversal. El enfoque fue cuantitativo, correlacional puesto que se midió la variación de las variables seleccionadas en el presente estudio, observacional puesto que no se participo en la generación de la información, transversal en virtud de que partió de un corte en el tiempo como límite temporal de estudio. 8.2 IDENTIFICACION DE VARIABLES Las variables identificadas para el estudio, y posteriormente clasificadas fueron las siguientes: a) Variable dependiente Enfermedad Hemolítica Feto neonatal (EHFN-ABO): es una variable cualitativa, nominal Dependiente. b) Variables independientes Tipificación ABO Test de COOMBS Directo en el Recién Nacido Titulación de anticuerpos Presencia o ausencia de Hemolisinas maternas c) Definición y Operacionalización de Variables Variables Def. Conceptual Def. Operacional Categoría Indicador Instrumento

58 V. Depend. EHFN - ABO Afección inmunológica Según diag. a) Frecuencia a) Pruebas aloinmune, en la Clínico y Prese inmunohem cual la sobrevida del resultado de nta at. hematíe del recién laboratorio b) b) Historia nacido esta acortado inmunohemat No clínica debido a la acción. presen de anticuerpos ta maternos que atraviesan la placenta. V. Independ. Tipificacion Determinación de la Según pruebas 1.- A Frecuencia Pruebas ABO presencia de inmunohemat 2.- B inmunologic antígenos. 3.- O as eritrocitarios, 4.- AB plaquetarios, leucocitarios y proteínas séricas Titulacion de Anticuerpos totales y de Según su 1.- Frecuencia Pruebas anticuerp presentación regular presencia y Prese inmunohem os Titulo ncia at. totales 2.- Ausen cia Presencia de Anticuerpos IgG con Según su 1.- Frecuencia Pruebas anticuerp capacidad presencia Prese inmunohem os IgG Hemolítica ncia at. 2.- Ausen cia Test de Detección de anticuerpos Según su 1.- Positiv Frecuencia Pruebas Coombs fijados a la superficie presencia 2.- inmunohem Directa de los Glóbulos Negati at. Rojos v

59 8.3 SELECCIÓN DEL INSTRUMENTO Se diseño fichas de registro como instrumento de recolección de datos en función a las variables seleccionadas y a los objetivos planteados al inicio del estudio. Para la organización de introducción de datos se cuenta con: Consentimientos Informados; firmados por las Mujeres embarazadas en estudio. (Ver Anexo 1) Ficha de resultados de Grupos Sanguíneos tanto de la Mamá, Papá, y del Recién Nacido. (Ver Anexo 2) Planilla de resultados de los procedimientos de laboratorio. (Ver Anexo 3). 8.4 RECURSOS DISPONIBLES POBLACION Y MUESTRA Para el muestreo de esta investigación se utilizara las siguientes poblaciones: Mujeres embarazadas del servicio de Gineco-Obstetricia (GOB) que asistieron al Hospital Maternológico Germán Urquidi de Agosto a Octubre del En este tiempo se definió un universo de estudio de 151 mujeres en trabajo de parto con grupo sanguíneo diferente al de su pareja, de las cuales solo se tomo como población muestra a las mujeres con grupo sanguíneo O que en número representan un total de 75 mujeres. Recién nacidos con grupo sanguíneo A, B o AB de madres con grupo sanguíneo O del Servicio de Neonatología del Hospital Maternológico Germán Urquidi, que en número representan un total de 75 Recién Nacidos. Padres de los Recién Nacidos en estudio. a) Criterios de Inclusión

60 Mujeres embarazadas del grupo sanguíneo O con pareja del grupo sanguíneo A, B o AB. b) Criterios de Exclusión Mujeres embarazadas con grupo sanguíneo A, B, O o AB con pareja del mismo grupo sanguíneo y/o bebes con isogrupo o del grupo sanguíneo O. Mujeres embarazadas que se negaron a firmar el consentimiento informado TEOREMA DEL LÍMITE CENTRAL Definida la población se procedió a la determinación del tamaño de la muestra participante en estudio, para lo que se utilizo el Teorema del Limite Central. Este teorema es la base para estimar parámetros de poblaciones y probar hipótesis: A medida que aumenta el tamaño de la muestra, la distribución de muestreo de las medias de las muestras se acerca a una distribución normal 39 Si se seleccionan muestras aleatorias de n observaciones de una población con media y desviación estándar, entonces, cuando n es grande, la distribución muestral de medias tendrá aproximadamente una distribución normal con una media igual a y una desviación estándar de. La aproximación será cada vez más exacta a medida de que n sea cada vez mayor. 39

61 Fig. 7: Distribución normal y sesgada de una muestra Fuente: Estadística Elementa Mario F. Friola México 2000 Para muestras de tamaño n mayor que 30, la distribución de las medias de muestras se puede aproximar razonablemente bien con una distribución normal. La aproximación es más exacta a medida que aumenta el tamaño de muestra n. Para este estudio nuestro tamaño de muestra es de n= MATERIALES Y METODOS a) Reactivos y materiales Los reactivos que se utilizaron fueron: Solución Salina de ClNa 0.15M. Solución al 2 % y 5 % de Glóbulos Rojos de Grupo sanguíneo A, B, O. 2 Mercaptoetanol. Suero de Anti-Globulina Humana (COOMBS).