PROCEDIMIENTO DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN POR NUMERO MAS PROBABLE (NMP) CON ETAPA DE PRE- ENRIQUECIMIENTO DE ENTEROBACTERIACEAE EN ALIMENTOS

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1 Página 1 de 5 1. OBJETIVO Estimar el número de Enterobacteriaceae presentes en el alimento. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Aplicar este procedimiento a todas las muestras de alimentos de consumo humano o animal. A muestras ambientales en el área de producción de alimentos y manipuladores de alimentos Se recomienda el uso de la técnica de NMP en muestras que se sospeche un bajo contenido de microorganismos presentes (1 a 100 por gramo o mililitros de muestra). 3. FUNDAMENTO Esta metodología tiene una etapa de enriquecimiento no selectivo, luego una etapa presuntiva de siembra en caldo de enriquecimiento y una etapa confirmativa. Para alimentos congelados se recomienda incubar a 30 ± 2 ºC. 4. REFERENCIAS 4.1 ISO Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal methods for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae -- Part 1: Detection and enumeration by MPN technique with pre-enrichment 5. TERMINOLOGÍA No Aplica 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 EQUIPOS Baño de agua 45 ± 1ºC Incubadora 30± 1 C o 37 ºC ± 1 C Vortex mixer 6.2 MATERIAL DE LABORATORIO Placas Petri de 15 x 100mm Pipetas estériles de 1 y 5mL Asa de nicrón o asa desechable (3mm de diámetro) Tubos estériles de 16 x 160 mm.

2 Página 2 de Mondadientes de madera o asa de vidrio Mecheros Bunsen Frascos de capacidad ± 160 ml. 6.3 MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS Caldo de pre-enriquecimiento no selectivo, Agua Peptonada Tamponada (APT) en tubos tapa rosca de 16 x 160 mm con 10 ml de medio Caldo de enriquecimiento Enterobacteriaceae (caldo EE) en tubos tapa rosca de 16x160mm con 10 ml de medio. (Almacenar hasta por 1 mes 5 ± 3 ºC.) Agar VRBG, este debe ser preparado justo antes de usar, debe ser usado dentro de 4 horas Agar nutritivo o agar BAB (en placa Petri con 15 a 18 ml) Agar glucosa en tubos con cantidad adecuada por ejemplo tubos de 16 x 160 mm con 10 ml de medio. Previo a su uso calentar en baño de agua hirviendo para eliminar el aire y luego enfriarlo rápidamente Reactivo comercial para detección de citocromo oxidasa Etanol 70%. 7. DESARROLLO 7.1 Detección Preparar una suspensión de la muestra en proporción 1/10 en APT Incubar a 37 o 30 ± 2 ºC x 18 ± 2 horas Traspasar 1 ml del cultivo a 10 ml de caldo de enriquecimiento (caldo EE) Incubar a 37 ± 2 ºC x 18 ± 2 horas Traspasar una asada de 3 mm del cultivo en agar VRBG para aislamiento 7.2 Número Más Probable Preparar una suspensión de la muestra de alimento en proporción 1/10 en APT Agregar porciones de 10 ml de esta dilución a 3 tubos de 16 x 160 mm.

3 Página 3 de Inocular 3 tubos con 1 ml de la misma dilución en tubos con 10 ml de APT Preparar diluciones decimales de la muestra de alimento Inocular 3 tubos con 1mL de la siguiente dilución decimal en tubos con 10 ml de APT Realizar por lo menos tres series de tres tubos Incubar a 30 o 37 ± 2 ºC x 18 ± 2 horas Traspasar 1 ml de cada tubo a caldo EE Agitar suavemente la gradilla para mezclar la muestra con el medio de cultivo Incubar a 30 o 37 ± 2 ºC x 18 ± 2 horas Pasar a la etapa de aislamiento. 7.3 Aislamiento Traspasar una asada de cada tubo en enriquecimiento selectivo en agar VRBG Incubar las placas de VRBG 30 o 37 ºC ± 1 C por 24 ± 2 horas Seleccionar por lo menos 1 colonia de cada morfología para confirmación bioquímica. (Colonias típicas: colonias de color rosa a rojo con o sin halo de precipitación, o mucoides e incoloras) Inocular una placa con una cepa de E. coli, otra con S. aureus Anotar en el RG En paralelo incubar una placa sin inocular como control de esterilidad del medio, anotar en el RG Etapa confirmativa Subcultivo Repicar las colonias seleccionadas en agar nutritivo en placa, para realizar pruebas bioquímicas confirmativas Incubar las placas a 37 ºC ± 1 C por 24 ± 2 hrs Agregar control positivo E. coli y control negativo S. aureus Seleccionar una colonia aislada desde cada una de las placas incubadas, para la confirmación bioquímica.

4 Página 4 de Prueba de oxidasa Usar asa de inoculación de platino/iridio o de vidrio, tomar una porción de cada colonia aislada y colocar en contacto con papel filtro recientemente humedecido con el reactivo de oxidasa. No se debe usar asa de inoculación de níquel /cromo Considerar que la prueba es negativa cuando el color del papel filtro o varilla reactiva no se ha tornado azul en 10 segundos. Las Enterobacterias son oxidasa negativa. Como control positivo de reacción se puede usar Pseudomona aeruginosa y como control negativo de reacción E. coli Anotar en el Registro RG Prueba de fermentación Repicar en profundidad, usando un asa de inoculación, las mismas colonias seleccionadas para la prueba de oxidasa (7.3.2) en tubos de agar glucosa previamente aireado y enfriado. Incluir una cepa de E. coli como control positivo y una cepa Pseudomona aeruginosa como control negativo Incubar a 35± 1 C o 37 ºC ± 1 C por 24 ± 2 hrs Si se desarrolla un color amarillo a lo largo del contenido del tubo, la reacción se considera positiva. La mayoría de las cepas producen gas Anotar en el Registro RG EXPRESIÓN DE RESULTADOS PARA DETECCION Informar los resultados como presencia o ausencia de Enterobacterias por g o por ml de muestra. 7.6 EXPRESIÓN DE RESULTADOS PARA NMP Contar el número de tubos que dan una reacción positiva para cada dilución Si una de las colonias seleccionadas es oxidasa negativa y glucosa positiva, el tubo del cual deriva el subcultivo es considerado positivo Usando la tabla de NMP, determinar el número de tubos positivos en las diferentes diluciones para calcular el índice de Número Mas Probable (NMP) En el caso de productos líquidos, el número de Enterobacteriaceae por ml es calculado dividiendo el índice NMP por 10.

5 Página 5 de En caso de otros productos donde se prepara una suspensión inicial, el número por gramo es igual al índice NMP Expresar los resultados en gérmenes/ g o ml de muestra Es conocido que amplias variaciones pueden ocurrir en la técnica de NMP. Los resultados obtenidos por este método deberían ser usados con precaución. Los límites de confianza están dados en el anexo A de la norma (ISO 7218/1996). 8. REGISTROS 8.1 Registro cepas Control de Incubadoras 8.2 Registro de resultados análisis de Enterobacterias en muestras de alimentos 8.3 Registro Control de Ambiente laboratorio 9. ANEXOS No Aplica.

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