Análisis Funcional Orgánico. Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC/CLAR)
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- Arturo Sáez Cuenca
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1 Análisis Funcional Orgánico Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC/CLAR) PARTE A Introducción Técnicas instrumentales cromatográficas 1. Gaseosa líquida (CGL) o sólida (CGS) 2. Líquida de Alta Resolución (HPLC/CLAR)
2 Introducción Aplicabilidad La muestra debe disolverse en la FM Amplio espectro de compuestos Ventajas - Alta resolución, eficiencia y reproducibilidad - Análisis rápidos, analíticos y preparativos -Resultados cuantitativos buenos δ std < 5% - Automatización -Límites de detección buenos UV-Vis (depende de λ) g Fluorescencia g Desventajas -Costo inicial alto y operacional medio -Muestra debe ser soluble -Requiere uso de patrones -Difícil resolución en muestras complejas -Detectores universales Índice de refracción poco sensible 10-6 g EM inversión inicial alta Introducción Teoría: Conceptos básicos 1. Eficiencia (N platos teóricos) r Respuesta del Detector t R Tiempo de retención W t Ancho de pico en la base W 1/2 Ancho de pico a media altura A mayor valor de N mayor eficiencia Parámetros que afectan la eficiencia: Flujo Longitud de la columna Diámetro de partícula (relleno) Distrución del diámetro partícula
3 Introducción Teoría: Conceptos básicos 2. Factor de retención (factor de capacidad) r Respuesta del Detector Mide el período de tiempo que la muestra reside en la fase estacionaria relativo al tiempo que lo hace en la fase móvil. Se calcula en función t R y t 0. Parámetros que afectan a k: Fase móvil (tipo de solvente de elución) Composición de la fase móvil Fase estacionaria Naturaleza del analito Introducción Teoría: Conceptos básicos 3. Selectividad o factor de separación r Respuesta del Detector α= selectividad k 2 = Factor de retención de 2 K 1 = Factor de retención de 1 Parámetros que afectan la selectividad: Fase estacionaria Naturaleza del analito Aditivos del solvente de elución Temperatura de trabajo Composición fase móvil (analitos ionizables) α=1 los analitos eluyen juntos
4 Introducción Teoría: Conceptos básicos 4. Resolución Parámetros que afectan la resolución: El valor de α es el más influyente en el cambio de la resolución. Los parámetros que influencian a α lo hacen sobre R s Valores de R s 0,6 valle entre picos. Muy bajo. 1,0 mínimo valor para cuantificar. 1,2 valor práctico de trabajo. 1,6 valor ideal. Introducción Teoría: Conceptos básicos Ecuación de Van Deemter Partícula chica Valores de H menores hacen el proceso más eficiente Altura de plato teórico Partícula grande Suma: Curva de Van Deemter Resistencia a la transferencia de masa FM y FE H disminuye al reducir el tamaño de partícula Difusión longitudinal Proceso multipaso o difusión Eddy Velocidad Lineal
5 Introducción Componentes del equipo 4. Inyector 1. Reservorio de Fase móvil 2. Bombas 3. Mezclador 5, Columna 3. Mezclador 4. Inyector 5. Columna 2. Bombas 2. Bombas 6. Control Temparatura 6. Control de temperatura 7. Detector 8. Sistema de adquisición y procesado de datos 1. FM 7. Detector 1. Solventes 8. Adquisición y Procesado de datos 1. Fase móvil Requisitos Pureza grado HPLC/UV Compatible con el detector Solubilice el analito Baja viscosidad Libre de impurezas sólidas Precio accesible Fase normal: principalmente no polar Fase reversa: água + otro solvente orgánico (metanol, acetonitrilo, THF) Preparación Filtración al vacío. Desgasificación
6 1. Fase móvil Mezclas de solventes Generalmente se usan mezclas de solventes. En modo isocrático dependiendo de la complejidad no se utiliza el sistema de mezclado del equipo. Siempre consultar tablas de propiedades y miscibilidades para evitar inconvenientes 1. Fase móvil Longitud de onda de corte (cut off) Es la longitud de onda a la que la absorbancia del solvente es igual a 1 UA (unidades de absorbancia) usando agua en la celda de referencia (1 cm longitud de camino óptico) Solvente λ de corte Acetonitrilo 190 Pentano 190 Agua 190 Hexano 195 Metanol 205 Etil alcohol 210 Ácido trifluoroacético 210 Solvente λ de corte Tetrahidrofurano 212 Diclorometano 233 Cloroformo 245 Acetato de etilo 256 Iso-Octane 215 Isobutyl Alcohol 220
7 1. Fase móvil Para compuestos ionizables, como los ácidos o bases orgánicas, se recomienda controlar el ph y la fuerza iónica. El rango de ph recomendado es de ph 2-4 El ph de trabajo es +/- 1 unidad de ph con respecto al pka o pkb de los analitos. Se trabaja generalmente con un predominio de la especie no ionizada. El ph se ajusta siempre en el componente acuoso 1. Fase móvil Preparación Membrana de Nylon La fase móvil no debe tener partículas en suspensión filtrarla cuidadosamente cada vez que se usa Importancia desgasificación Equipo para filtrar solventes de HPLC Métodos 1. Ultrasonido 2. Vacío 3. Saturación con He o N 2 4. Desgasificación on-line
8 2. Bombas y tuberías Tipos de bomba A. Reciprocante Bomba a diafragma Tuberías B. Bomba jeringa Modos de utilización A. Isocrático B. Gradiente 4. Inyector A. Flujo normal B. Agregado de muestra bomba Jeringa punta roma Manual y automático bomba C. Ingreso al sistema columna loop bomba columna columna
9 5. Columna Tipos Analítica: Interesa saber cuántos componentes hay, cuánto hay de cada uno (cuantificar), pero no me interesa colectarlos por separado. Cantidad de muestra < 0.1 mg Preparativa: Interesa separar todos los componentes y colectarlos por separado para después analizarlos individualmente. Cantidad de muestra desde 1 mg hasta mg UHPLC (Ultra high pressure liquid chromatography): Para reducir los tiempos de análisis y con resolución mejorada. Columnas de 1,8-2 µm de tamaño de partícula, columnas cortas (5 cm). Mejor resolución y eficiencia. La presión aumenta a bar. 5. Columna
10 5. Columna Características 5. Columna Fabricación de las fases Silanoles libres Uniones hidrógeno entre silanoles vecinales uniones siloxano Superficie de la sílica
11 5. Columna Estrategias de cobertura No cubierta Impedimento estérico. No cubierta Recubierta en dos etapas. Endcapped Recubierta
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