UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO ELECTROFORESIS: UNA HERRAMIENTA APLICADA AL DIAGNÓSTICO CLÍNICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN

Transcripción

1 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN ELECTROFORESIS: UNA HERRAMIENTA APLICADA AL DIAGNÓSTICO CLÍNICO TRABAJO PROFESIONAL QUE PARA OBTENER EL TITULO DE: QUÍMICA FARMACEÚTICA BIÓLOGA PRESENTA: DIANA CORDERO SEVILLA ASESOR: Q.F.B. MARTHA PATRICIA CAMPOS PEON CUAUTITLAN IZCALLI, EDO. DE MÉXICO 2010

2 AGRADECIMIENTOS A la Universidad Nacional Autónoma de México y a la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, por mi formación profesional. A todos y cada uno de los profesores de la FESC que realizan su labor con convicción y por los cuales aprendí a amar profundamente esta profesión. A la profesora Martha Patricia Campos Peón por su tiempo, apoyo y enseñanzas. A los sinodales por su valiosa colaboración en la conclusión del presente trabajo. A CARPERMOR por brindarme la oportunidad de desempeñarme como profesionista, así como por su flexibilidad y apoyo para el desarrollo de este trabajo. A todas aquellas personas que son parte fundamental en mi vida y que contribuyeron a que lograra uno de mis más grandes sueños. Muchas gracias

3 DEDICATORIAS A mi madre: Este logro es principalmente gracias a ti, ya que nunca dejaste que mis sueños se desvanecieran. Gracias por tu inmenso amor, confianza, paciencia y sacrificios. Doy gracias a Dios por permitirme crecer y aprender al lado de una mujer como tú. TE AMO. A mis hermanos Angélica y José Luis: Gracias por darme todo su amor, confianza y consejos a lo largo de mi vida. A mis angelitos Santiago, Diego, Atzin y Angel, por darle alegría a mi vida. LOS AMO A mis amigos Gracias por estar conmigo, son tesoros invaluables en mi vida. A tí, que tuvimos un mismo sueño, y estoy segura que desde el cielo compartes mi alegría.

4 INDICE 1. OBJETIVO INTRODUCCION ELECTROFORESIS Antecedentes Principio HEMOGLOBINA Sintesis del grupo HEMO Síntesis de la globina Estructura y función de la hemoglobina Hemoglobinas normales Anormalidades cualitativas Hemoglobinopatías beta Anemia drepanocítica Rasgo drepanocítico Enfermedad de la Hemoglobina C Rasgo de la Hemoglobina C Hemoglobina D Enfermedad y rasgo de la Hemoglobina E Anormalidades cualtitativas Talasemias alfa Talasemias beta PROTEINAS Estructura proteica Función Clasificación Separación por electroforesis... 22

5 2.3.5 Fracciones de proteínas séricas Características electroforéticas de proteínas séricas en ciertas condiciones clínicas Proteínas urinarias Proteínas en Líquido cefalorraquídeo Inmunofijación de proteínas LIPOPROTEÍNAS Hiperlipoproteinemias primarias Hiperlipoproteinemias secundarias ISOENZIMAS DE FOSFATASA ALCALINA Isoenzima hepática Isoenzima ósea Isoenzima intestinal Isoenzima placentaria ISOENZIMAS DE CREATIN CINASA DESCRIPCIÓN DEL DESEMPEÑO PROFESIONAL METODOLOGIA Material, reactivo y equipo general Electroforesis de Hemoglobina alcalina Electroforesis de Proteínas en suero, líquido cefalorraquídeo y orina Electroforesis de Lipoporteínas Electroforesis de isoenzimas de CK Electroforesis de isoenzimas de Fosfatasa alcalina Inmunofijación, Bandas oligoclonales y Proteína de Bence Jones RESULTADOS: INTERPRETACIÓN Y ANÁLISIS Electorforesis de Hemoglobina Electroforesis de Proteínas Electroforesis de Lipoproteínas Electroforesis de isoenzimas de CK

6 3.2.5 Electroforesis de isoenzimas de Fosfatasa Alcalina Inmunofijación de Proteínas Bandas oligoclonales Proteína de Bence Jones CONCLUSIONES RECOMENDACIONES REFERENCIAS ANEXO 1. Valores de referencia de materiales de control empleados en electroforesis en gel de agarosa. 122 ANEXO 2. Rangos de referencia establecidos por el laboratorio para las diferentes determinaciones electroforéticas ANEXO 3. Abreviaturas

7 INDICE DE FIGURAS FIGURA 1. Molécula de hemoglobina... 8 FIGURA 2. Estructura de la Hemoglobina... 9 FIGURA 3. Concentrador Minicon para orina y LCR FIGURA 4. Equipo de electroforesis "Spife 3000" FIGURA 5. Interpretación de las diferentes bandas en la electroforesis de Hemoglobina en medio alcalino FIGURA 6. Corrimiento electroforético de las diversas variantes de hemoglobina en medio ácido y alcalino. 78 FIGURA 7. Gel de electroforesis de Hemoglobina en medio alcalino FIGURA 8. Gel de electroforesis de Hemoglobina en medio ácido FIGURA 9. Interpretación de las diferentes fracciones de proteínas en suero FIGURA 10. Gel de electroforesis de Proteínas en suero FIGURA 11. Interpretación de las diferentes bandas en Electroforesis de Lipoproteínas FIGURA 12. Gel de electroforesis de Lipoproteínas en suero FIGURA 13. Interpretación de las diferentes bandas de isoenzimas de CK FIGURA 14. Electroforesis de isoenzimas de CK por el método de QG Spife CK Vis FIGURA 15. Gel de electroforesis de isoenzimas de CK FIGURA 16. Interpretación de las diferentes bandas de Isoenzimas de ALP FIGURA 17. Gel de electroforesis de isoenzimas de Fosfatasa Alcalina (ALP) FIGURA 18. Paciente 1 y 2 de inmunofijación de proteínas en ausencia de componentes monoclonales FIGURA 19. Paciente 3 Inmunofijación de proteínas con presencia de componentes monoclonales (IgG/lambda) FIGURA 20. Paciente con bandas oligiclonales ausentes FIGURA 21. Paciente con bandas oligoclonales presentes FIGURA 22. Paciente con ausencia de la Proteína de Bence Jones FIGURA 23. Paciente con Proteína de Bence Jones Positiva...116

8 INDICE DE GRÁFICAS GRÁFICA 1. Control de Hemoglobina FASC en medio alcalino GRÁFICA 2. Paciente con patrón de hemoglobina normal GRÁFICA 3. Paciente con incremento en la fracción de Hb A GRÁFICA 4. Paciente con incremento en la fracción de Hb A GRÁFICA 5. Paciente con un patrón anormal con presencia de Hb A, Hb F y Hb S GRÁFICA 6. Paciente con un patrón anormal con presencia de Hb A y Hb F GRÁFICA 7. Control Normal de Proteínas GRÁFICA 8. Control Anormal de Proteínas GRÁFICA 9. Paciente en el cual se observa la presencia de una banda monoclonal GRÁFICA 10. Paciente en el cual se observa un incremento en las fracciones alfa 2, beta y gamma GRÁFICA 11. Paciente con un patrón de electroforesis de Proteínas normal GRÁFICA 12. Paciente en el cual se observa la presencia de una banda monoclona GRÁFICA 13. Paciente el cual se observa un incremento de las fracciones Alfa 2, Beta y Gamma GRÁFICA 14. Control de Lipoproteínas LIPOTROL GRÁFICA 15. Paciente que presenta un incremento en la fracción alfa de Lipoproteínas GRÁFICA 16. Paciente el cual presenta un incremento de la fracción Pre-beta de Lipoporteínas GRÁFICA 17. Paciente con patrón normal de Lipoporteínas GRÁFICA 18. Paciente con incremento en la fracción alfa de Lipoporteínas GRÁFICA 19. Control de isoenzimas de Creatin cinasa (CK) GRÁFICA 20. Paciente que presenta una CK atípica y una CK-MB GRÁFICA 21. Paciente con un patrón de isoenzimas de CK normal GRÁFICA 22. Paciente que presenta la fracción de CK-BB GRÁFICA 23. Paciente de isoenzimas de fosfatasa alcalina con presencia de las fracciones ósea, hepática y macrohepática GRÁFICA 24. Paciente de isoenzimas de fosfatasa alcalina con presencia de las fracciones hepática y ósea GRÁFICA 25. Electroforesis de Proteínas de paciente con proteína de Bence Jones

9 INDICE DE TABLAS TABLA 1. Fracciones proteicas obtenidas mediante electroforesis TABLA 2. Descripción de las funciones del Químico Analista en Carpermor TABLA 3. Factores de Concentración para Proteínas en orina TABLA 4. Límites de referencia establecidos para el control FASC en medio alcalino TABLA 5. Límites de referencia establecidos para el control Normal de Proteínas TABLA 6. Límites de referencia establecidos para el control Anormal de Proteínas TABLA 7. Límites de referencia establecidos para el control LIPOTROL TABLA 8. Límites dereferncia establecidos para el control CK/LD TABLA 9. Rangos de referencia para las fracciones de Hemoglobina en medio alcalino TABLA 10. Rangos de referencia para las fracciones de Proteínas en suero TABLA 11. Rangos de referencia para las fracciones de Lipoproteínas TABLA 12. Rangos de referencia para las fracciones de isoenzimas de CK TABLA 13. Rangos de referencia para las fracciones isoenzimas de Fosfatasa Alcalina

10 2. INTRODUCCIÓN 2.1 ELECTROFORESIS ANTECEDENTES El término electroforesis fue creado por Michaelis en el año de 1909, para describir la migración de los iones por la influencia de un campo eléctrico.(27) En 1879, Helmholz sugirió la existencia de una doble capa eléctrica en la interfase de solvente y sólido, pero fue hasta 1930 cuando un grupo de físicos suecos lo llevó a la práctica, diseñando los primeros instrumentos electroforéticos. Theorell y Tiselius desarrollaron aparatos para electroforesis preparativa y analítica en fase líquida, la cual consistió en la separación de proteínas disueltas en una solución de electrolitos mediante la aplicación de una corriente eléctrica a través de un tubo de cuarzo en forma de U que contenía la solución proteica. A ph 7.6 fueron identificadas cuatro fracciones proteicas en el suero, denominadas albúmina, α, β y γ y se cuantificaron ópticamente por modificaciones en el índice de refracción en los límites entre estas bandas. Debido a que la separación se realizó en una separación homogénea, sin medio de soporte sólido, las fuerzas convectivas evitaron las resolución en distintas zonas. Sin embargo esta técnica resultaba costosa, difíciles de manejar, y requerían grandes cantidades de muestra. El uso de la electroforesis en la práctica clínica avanzó notablemente cuando se introdujo a principios de la década de 1940 la idea de utilizar un soporte poroso. (electroforesis de zona). El primer medio de soporte fue papel y durante decenios se emplearon numerosos materiales para separar prácticamente cualquier molécula cargada. Hoy en día los soportes más ampliamente utilizados son el acetato de celulosa, almidón, acrilamida, agar y agarosa.(1) PRINCIPIO Se denomina electroforesis al método de separación mediante el transporte de partículas en un campo eléctrico. Cualquier ión o molécula cargada eléctricamente migrará cuando se someta a la 2

11 acción de dicho campo. A un ph determinado, muchas moléculas biológicas poseen carga eléctrica, cuya magnitud depende del ph y composición del medio en que se encuentren. (17) La electroforesis se aplica en el campo de la Bioquímica a la separación de compuestos que poseen grupos ionizables (aminoácidos, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos) teniendo en cuenta que la carga neta de estas sustancias depende del ph del medio en que se encuentren. Si la molécula tiene carga positiva migrará hacia el cátodo y si tiene carga negativa, hacia el ánodo. La fuerza iónica de la solución tampón tiene una importancia fundamental en la electroforesis, puesto que cuando es baja, permite velocidades de migración de los solutos más rápidas y con menor desprendimiento de calor.(27) Las proteínas están compuestas de aminoácidos que poseen grupos ionizables (principalmente - COO- y -NH3+) y pueden encontrarse cargadas positiva o negativamente, o bien permanecer eléctricamente neutras según la proporción de los diversos grupos ionizados a un determinado ph. En su punto isoeléctrico (pi ó phi), la proteína tiene carga neta cero. Por debajo de pi las proteínas estarán cargadas positivamente y por encima del pi negativamente. (27) Es decir, cuando una molécula cargada se coloca en un campo eléctrico se moverá hacia uno u otro electrodo dependiendo de: 1) La carga eléctrica: La presencia de aminoácidos de diferentes grupos bioquímicos otorga a una determinada proteína una carga neta totalmente diferente a otra, compuesta por diferentes grupos de aminoácidos. Debido a que en la electroforesis, las muestras son sometidas a un determinado campo eléctrico, la migración de las proteínas en el gel dependerá básicamente de su carga y no de su peso molecular. Para evitar este efecto, es importante igualar la carga neta de todas las proteínas aprovechando sus propiedades anfotéricas. En ese sentido, el SDS evita el efecto de diferencias de carga entre las proteínas, a fin de favorecer la separación de ésta únicamente por su peso molecular. (27) 2) El tamaño: Las proteínas tienen características moleculares que actúan como factores intrínsecos durante la electroforesis alterando su migración y generando bandas de diferentes tamaños, que no necesariamente van acorde al peso molecular real del polipéptido. Ciertas modificaciones 3

12 postraduccionales, multimerización y formación de complejos con otro tipo de moléculas generan modificaciones en el tamaño de la proteína dando pesos moleculares aparentes en el momento del análisis.(27) 3) La intensidad del campo eléctrico: Es la fuerza que determina el movimiento o migración de la proteína a través del campo eléctrico. Su unidad de medición es voltios/cm y es por esa razón que la tasa de migración de una proteína puede ser alterada cambiando tanto la distancia comprendida entre los electrodos (cm) como el potencial eléctrico del sistema (Voltaje). Del mismo modo, los valores de la intensidad del campo eléctrico dependen de la fuerza direccional (Fa) y de la carga neta de la molécula (Q). (27) Puede ser calculada a través de la siguiente fórmula: E = Fa/Q E= v/d Donde: Fa = Fuerza direccional. v = voltios. d = distancia de los electrodos (en centímetros) Q = carga en (coulomb)(26) 4) La temperatura del medio: Depende básicamente del voltaje de la electroforesis, la concentración de sales (poder de conductancia) del tampón y del ph.(27) La velocidad de migración (V) de la partícula es directamente proporcional al producto de su carga efectiva (q) y el gradiente de potencial eléctrico (E) e inversamente proporcional al coeficiente de fricción (f) relativo al tamaño y forma de la molécula, es decir, a la resistencia que le ofrece el medio.(18) V = qe/f 4

13 Existen varios tipos de electroforesis, sin embargo en el presente trabajo nos enfocaremos a una en específico, electroforesis de zona.(17) En esta técnica, la muestra está obligada a desplazarse sobre un soporte sólido de papel, celulosa o gel. La pequeña cantidad necesaria de muestra permite que las moléculas migren en discretas zonas o bandas. La electroforesis zonal de biomoléculas cargadas, generalmente se lleva a cabo en una disolución estabilizada con un medio que sirve de soporte.(17) Un gel es un medio de soporte que se encuentra en un estado intermedio entre el sólido y el líquido. Este tipo de electroforesis se halla entre los métodos más resolutivos y convenientes empleados en la separación de macromoléculas. Los geles de uso más generalizado son: poliacrilamida y agarosa. Éstos poseen poros de diferentes dimensiones moleculares que delimitan la velocidad de migración y moléculas trasladadas durante el proceso electroforético. De esta forma, la separación no se produce sólo por las diferentes cargas de las moléculas, sino también por las diferencias de tamaño. Los geles están formados por un reticulado de polímeros (constituyendo una red enmarañada) y el líquido intersticial en el que se encuentra inmerso esta red.(17) Los geles de poliacrilamida se forman por la copolimerización de la acrilamida y la bis-acrilamida en presencia de persulfato de amonio y tetrametiletilendiamina (TEMED), siendo este último un catalizador de la liberación de radicales libres del persulfato, e iniciador de la polimerización. La combinación adecuada de acrilamida y bis-acrilamida, permitirá determinar características tales como densidad, elasticidad, resistencia mecánica y tamaño de los poros. Estas cualidades permiten definir el tamaño de las moléculas que migraran a través del gel. En general, se puede decir que las cualidades más atractivas para hacer uso de la poliacrilamida son la presencia de mayor poder de resolución, amplia variación en el diámetro de los poros, cuantificación de la concentración proteínica y de la actividad enzimática, a través de las técnicas de densitometría. Sin embargo, estos monómeros son compuestos extremadamente tóxicos en solución, y requieren de un manejo muy cuidadoso por parte del usuario. (27) La agarosa es un polisacárido extraído de las algas marinas, empleado a una concentración de %. (27) 5

14 Existe una gran variedad de tipos de electroforesis en gel, que se pueden agrupar en dos categorías: Electroforesis en gel en una dimensión (continuo o discontinuo) o PAGE-nativa o SDS-PAGE o Isoelectroenfoque Electroforesis en gel en dos dimensiones (bidimensional)(17) Según las aplicaciones u objetivos que se pretendan conseguir en una práctica o experimento, se utilizará un tipo u otro de electroforesis en gel. Los geles discontinuos mejoran la resolución de la electroforesis pues se consigue agudizar las bandas en gran medida por el uso de dos geles y dos tampones diferentes.(17) La PAGE-nativa se utiliza para separar proteínas en condiciones no desnaturalizantes, por tanto, en función de la carga intrínseca de las mismas. La SDS-PAGE es muy útil para calcular el peso molecular de una proteína concreta ya que separa las proteínas según su tamaño, es una técnica muy utilizada para investigación en biología molecular y debido a su alto poder de resolución y separación de proteínas en multitud de subunidades, esta técnica no se utiliza de modo rutinario en el laboratorio clínico (1). El isoelectroenfoque es un tipo de PAGE en una dimensión que se basa en la separación de moléculas de acuerdo a sus diferentes puntos isoeléctricos. (17) Mediante esta técnica las proteínas migran a través de un gel que contiene un gradiente de ph establecido con una mezcla de anfolitos. A medida que cada proteína alcanza su localización en el gel, en la que el ph es igual a su pi, la carga neta se convierte en cero; cesa la fuerza electromotriz que actúa sobre ella y queda en reposo. De este modo el patrón final depende estrictamente del punto isoeléctrico. (1) La aplicación más importante de la electroforesis en clínica es la separación de constituyentes del plasma y otros líquidos corporales. Si bien con esta técnica es posible la separación de moléculas que difieren en sus cargas, la combinación con otras produce un aumento del poder analítico de este método. Así, la combinación de electroforesis y reacciones inmunológicas posibilita la identificación de distintos componentes que poseen movilidad electroforética semejante, pero determinantes antigénicos diferentes.(17) 6

15 De esta manera, con técnicas electroforéticas, es posible separar los diferentes componentes de una mezcla de aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos y otras biomoléculas cargadas.(1) En el presente trabajo se presentaran los principales analitos separados por electroforesis en el área clínica, como son Hemoglobina, Proteínas, Lipoproteínas y algunas Isoenzimas, por lo que es importante conocer algunos antecedentes referentes a las mismas. 2.2 HEMOGLOBINA La Hemoglobina es una molécula integrada por dos pares de cadenas polipeptídicas. Cada cadena está ligada al grupo HEMO, el cual está compuesto por un núcleo tetrapirrólico (porfirina) al que está unido un átomo de hierro. Es un grupo de proteínas que tienen la función de transportar oxígeno desde pulmones a los tejidos y dióxido de carbono en sentido contrario.(2) La síntesis del grupo Hemo se lleva a cabo en la mayoría de las células corporales, excepto en los eritrocitos maduros, pero sobre todo en los precursores eritroides(3) SINTESIS DEL GRUPO HEMO La succinilcoenzima A se condensa con la glicina para formar un compuesto intermedio inestable, el ácido α- amino-β-cetoadípico, que es descarboxilado para dar ácido δ- aminolevulínico (ALA). Esta condensación requiere de fosfato de piridoxal (Vitamina B6) y tiene lugar en las mitocondrias.(3) El ALA se excreta normalmente por la orina en pequeñas cantidades y su excreción aumenta en ciertas anormalidades de la síntesis de Hem (Por ejemplo, intoxicación con plomo). Dos moléculas de ALA se condensan para formar monopirrol, porfobilinógeno, catalizado por la enzima ALA-deshidrasa. El porfobilinógeno también se excreta por la orina en pequeñas cantidades. Para formar Uroporfirinógeno III o I, reaccionan cuatro moléculas de porfobilinógeno. El isómero tipo III se convierte por la vía de coproporfirinógeno III y protoporfirinógeno en protoporfirina.(3) La protoporfirina se suele encontrar en los eritrocitos maduros. El hierro se inserta en la molécula de protoporfirina mediante la enzima mitocondrial ferroquelatasa para formar parte de la molécula Hem completa (Fig 1) (3). 7

16 FIG No. 1 Molécula del grupo hemo SÍNTESIS DE LA GLOBINA La síntesis de globina se produce en el citoplasma de los eritroblastos y de los reticulocitos. Las cadenas de polipéptidos se sintetizan en los ribosomas. Las pequeñas moléculas específicas de RNAt (RNA transferencia) se unen a cada aminoácido y determinan el lugar del mismo de acuerdo con el código de RNAm (RNA mensajero). El crecimiento progresivo de la cadena de aminoácidos empieza en el grupo amino final. Este proceso de síntesis proteica sucede en los ribosomas que están agregados como polirribososmas. Estos se mantienen juntos mediante la unión del RNAm. Ya que el retículo puede sintetizar Hemoglobina durante algunos días después de perder su núcleo, parece que el RNAm para la Hemoglobina es bastante estable. Las cadenas polipéptidicas liberadas de los ribosomas se pliegan de forma espontánea en una configuración tridimensional (3). El control de la síntesis de Hemoglobina se ejerce primariamente por la acción del grupo Hem. El aumento de Hem inhibe la síntesis de este grupo al inhibir la actividad y síntesis de ALA-sintetasa. El Hem también estimula la síntesis de globina, sobre todo en la zona de comienzo de la cadena, y la interacción de los ribosomas con el RNAm.(3) ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LA HEMOGLOBINA La Hemoglobina A del adulto normal consta de cuatro grupos Hem y cuatro cadenas de polipéptidos (dos cadenas alfa y dos cadenas beta) (Fig. 2). Los átomos de hierro ferroso tienen 6 enlaces de unión, cuatro para los nitrógenos pirrólicos del Hem, uno para el nitrógeno imidazólico de histidina de la cadena globínica y uno que se une reversiblemente con el oxígeno. A medida de que se incrementa la presión parcial de 8

17 oxígeno, los cuatro grupos Hem se unen respectivamente a una molécula de oxígeno. En este proceso se da un cambio en la configuración general de molécula de Hemoglobina, lo que permite la fijación del oxígeno. El dióxido de carbono (CO 2 ) es transportado por los eritrocitos y en el plasma. Una pequeña parte de CO 2 eritrocitario se disuelve, otra se fija a los grupos amino de Hemoglobina como Carbamino-CO 2, pero la mayor parte se encuentra en forma de bicarbonato. La enzima anhidrasa carbónica cataliza la transformación de dióxido de carbono en bicarbonato dentro del Hematíe mientras está en el lecho capilar de los tejidos, y cataliza la rección inversa (liberación de dióxido de Carbono a partir del bicarbonato) en el eritrocito, cuando se haya en el lecho capilar pulmonar. (3) FIG. No. 2 Estructura de la Hemoglobina HEMOGLOBINAS NORMALES La estructura Hem es común a todas las Hemoglobinas y sus variantes. El tipo de Hemoglobina está determinado por la fracción proteica, llamada globina. Las cadenas polipeptídicas α, β, γ y δ constituyen las Hemoglobinas humanas normales: Hemoglobina A (α2β2). Es la más importante de las Hemoglobinas en el adulto normal. Las cadenas de polipéptidos de la parte globínica de las moléculas son de dos tipos: dos cadenas α idénticas, cada una con 141 aminoácidos, y dos cadenas β, también idénticas de 146 aminoácidos cada una. Cada cadena está ligada a un grupo Hem. La molécula es elipsoidal, con los cuatro grupos Hem en su superficie, donde funcionan combinándose reversiblemente con el oxígeno.(3) 9

18 Hemoglobina A 2 (α2 δ2). Constituye del 1.5 al 3.5 % de la Hemoglobina del adulto normal.(7) Sus dos cadenas α son iguales que las de la HbA y HbF; sus dos cadenas δ difieren de las cadenas β en solo 8 de sus 146 aminoácidos. La síntesis de cadenas δ se inicia tarde en la vida fetal y se produce sólo en normoblastos. El nivel de HbA 2 aumenta de forma gradual durante el primer año de vida, periodo en que se consigue el nivel de adulto. Esta Hemoglobina se encuentra incrementada en algunas talasemias â. La deficiencia de hierro, causa una reducción en la síntesis de HbA 2. (3). Hemoglobina F (fetal) (α2γ 2). Es la Hemoglobina principal del feto y del recién nacido debido a la alta producción de cadenas α y γ. A los 6 meses suele ser menos del 8% y a los 12 meses menor del 5%, entre los 12 y 24 meses en menor al 3%, tras los 2 años de edad es menor al 2%. En adultos se observan indicios y debe ser menor al 1%. (7) La estructura espacial de las Hemoglobinas (como de todas las proteínas), dependen de la secuencia de aminoácidos que constituyen las cadenas. La sustitución de aminoácidos por mutación es la causa de la formación de variantes de Hemoglobina, las cuales tienen una carga superficial diferente y por tanto movilidades electroforéticas distintas, que también dependen del ph y la fuerza iónica del tampón. La separación electroforética de las Hemoglobinas humanas en medio alcalino sirve para determinar la presencia de variantes de Hemoglobina.(4) Las Hemoglobinopatías son alteraciones monogénicas cada vez más frecuentes en el mundo y tienen un patrón de herencia autosómico recesivo. Se dividen en: 1. Anormalidades cualitativas o Hemoglobinopatías estructurales, producidas por la síntesis de una cadena de globina estructuralmente anormal 2. Anormalidades cuantitativas o síndromes talasémicos, que manifiestan una disminución de la síntesis de una de las cadenas de globina de estructura normal. (11) En América Latina se pueden encontrar ambas patologías; en México son más frecuentes en las costas del Golfo y del Pacífico.(10) ANORMALIDADES CUALITATIVAS: HEMOGLOBINOPATÍAS Se presentan por la sustitución por mutación de un aminoácido en uno de los 4 tipos de cadenas polipeptídicas. El significado clínico de tales cambios depende del tipo de aminoácido involucrado y de su posición. En las enfermedades clínicamente significativas, pueden estar afectadas las cadenas α y β. (3) 10

19 En las talasemias, se forman cadenas de globina de estructura normal, pero son producidas a una velocidad menor. La talasemia β se refiere a una menor producción de cadenas β; por tanto cabría esperar que la HbF (α 2 γ 2 ) o la HbA 2 (α 2 δ 2 ) aumenten relativamente respecto a la HbA (α 2 β 2 ). (3) En las Hemoglobinopatías β homocigóticas están presentes los dos genes alélicos de las cadenas β anormales, de manera que no se produce ninguna cadena β normal ( y por lo tanto no hay producción de HbA). Ejemplos de esto, son la anemia drepanocítica (HbS) y la enfermedad por la Hemoglobina C (HbC). Dado que los genes α, γ y δ ( y la producción de las cadenas) son normales, la HbF y HbA 2 formadas tienen una estructura normal, aunque puede haber una aumento en la cantidad.(3) No se han descrito Hemoglobinopatías α homocigóticas(3) En las Hemoglobinopatías β heterocigóticas, la Hemoglobina anormal está presente junto a la HbA; también la HbF y la HbA 2 tienen una estructura normal. Ejemplos de esto son el rasgo drepanocítico (HbS) y el rasgo de la Hemoglobina C (HbC). La HbA supera en cantidad la Hemoglobina anormal presente, debido a una producción mas lenta de cadenas β anormales que de cadenas β normales, destrucción selectiva precoz de los Hematíes con concentraciones mas altas de Hemoglobina anormal o eliminación selectiva de Hemoglobina anormal de la célula.(3) En las Hemoglobinopatías α heterocigóticas, la anomalía de la cadena α afectará los tres tipos de Hemoglobina. Ejemplos de esto son HbD Baltimore, Hb Ann Arbor y HbM Boston.(3) Existen combinaciones de anomalías. Los heterocigotos dobles para dos anormalidades de la cadena β producen dos cadenas β anormales y distintas; por ello hay dos Hemoglobinas anormales y no existe HbA; un ejemplo es la enfermedad de HbSC. Son raros los heterocigotos dobles para anomalías de cadenas β y δ y para las de las cadenas α y β.(3) Los heterocigotos dobles para la Hemoglobinopatía β y para la talasemia β son bien conocidos. Aquí, la cantidad de Hemoglobina anormal supera la de la normal, a diferencia de las Hemoglobinopatías β heterocigóticas, en las que ocurre lo contrario. (3) 11

20 HEMOGLOBINOPATÍAS β Anemia drepanocítica La enfermedad homocigótica HbS es una anemia Hemolítica crónica cuya gravedad aumenta progresivamente desde la infancia, y suele ser fatal antes de los 30 años de edad. Sin embargo con cuidados médicos, muchos pacientes viven mas tiempo. La HbS se encuentra casi exclusivamente en la población de raza negra; 0,1 a 0,2 % de los individuos de raza negra nacidos en Estados Unidos presentan anemia de células falciformes.(3) En la HbS, el ácido glutámico en la sexta posición sobre la cadena β es sustituido por valina. Esta sustitución se efectúa en la superficie de la molécula y cambia su carga, de ahí su movilidad electroforética. (4) La HbS es soluble cuando está completamente oxigenada; cuando se elimina el oxígeno de la HbS, aparece la polimerización de la Hb anormal formando tactoides (cristales líquidos) que son rígidos y deforman la célula dándole la forma que su mismo nombre indica. (3) En la enfermedad de HbS homocigótica aparece la drepanocitosis en tensiones fisiológicas del oxígeno y la rigidez de los eritrocitos es la responsable de la Hemólisis, así como de la mayoría de las complicaciones. Las células rígidas son más vulnerables a los traumatismos, y son fácilmente atrapadas por el sistema reticuloendotelial, en especial por el bazo, lo que explica la Hemólisis. Como resultado de la Hemólisis, la hiperplasia medular grave y continuada durante la infancia produce cambios óseos: expansión de los espacios medulares óseos, adelgazamiento de la cortical ósea y estriaciones radiales observadas en las radiografías craneales. (3) Complicaciones: En la infancia se produce a causa de las células falciformes y la estasis capilar un edema doloroso bilateral del dorso de las manos y pies denominado síndrome mano-pie o dactilitis de células falciformes. Persiste alrededor de dos semanas, se acompaña de periostitis, y no se manifiesta después de los 4 años de edad.(3) El bazo es el centro de tres complicaciones: una crisis de secuestro, implica una acumulación repentina de sangre y un rápido aumento del volumen del bazo, lo que da lugar a un shock hipovolémico. Puede ocurrir en la infancia, cuando existe esplenomegalia. En ciertas alteraciones, la asplenia funcional consiste en una respuesta inadecuada de los anticuerpos y una incapacidad del sistema retículoendotelial para eliminar las bacterias de la sangre, lo cual se debe probablemente a un bloqueo de dicho sistema. Esto puede explicar 12

21 parcialmente el riesgo de infección en niños con esta enfermedad. Las infecciones por Salmonella y neumococos suelen predominar en niños con anemia drepanocítica.(3) La autoesplectomía es el resultado de episodios vasooclusivos que dan lugar a infartos progresivos, fibrosis y retracción del bazo. Aunque la esplenomegalia se produce en el niño, un pequeño remanente fibroso es lo normal en el adulto. Desde la infancia, los pacientes no pueden producir orina concentrada, aparentemente como resultado de una lesión anóxica en la zona medular renal. La Hematuria como resultado de una necrosis papilar es común. (3) Las crisis vasooclusivas son episodios debilitantes de dolor abdominal, óseo o articular, acompañados de fiebre debida probablemente al taponamiento de los pequeños vasos sanguíneos por masas de células falciformes. Se produce una necrosis ósea que puede actuar como foco para la osteomieliltis por salmoneras. La necrosis aséptica, de la cabeza del fémur representa una complicación ocasional, mientras que las diversas complicaciones que se producen como resultado de crisis vasooclusivas recurrentes afectan muchos sistemas.(3) Las crisis aplásicas pueden afectar en ocasiones a los pacientes con anemia Hemolítica crónica. La incapacidad temporal para producir eritrocitos que quizá no se observe en una persona con una vida media eritrocítica normal puede causar un descenso importante en la concentración de Hemoglobina en la anemia Hemolítica. Es posible que esto sea resultado de la infección, exposición a fármacos tóxicos o déficit de ácido fólico; en ocasiones no puede encontrarse ninguna causa. (3) En sangre: La anemia es normocítica normocrómica. La policromasia está aumentada y hay normoblastos presentes. Las células Diana son numerosas y se ven regularmente los corpúsculos de Howel-Jolly como resultado de la asplenia. En el frotis, se encuentran con frecuencia células falciformes. La fragilidad osmótica suele estar disminuída. Son habituales la neutrofilia y la trombocitosis. En la médula se observa una hiperplasia normoblástica y un aumento del hierro depositado. (3) Prueba del fenómeno falciforme con metabisulfito: La adición de metabisulfito (agente reductor) a la sangre, aumenta la desoxigenación de la Hemoglobina y la aparición del fenómeno falciforme de la HbS. Se coloca una gota de sangre en un portaobjetos, se agrega el metabisulfito, se tapa con un cubreobjetos y se sella. En pocos minutos se observa al microscopio. El fenómeno es más rápido cuanta más Hemoglobina S existe. Se pueden observar pruebas positivas con otras Hemoglobinas anormales raras (p. ej. HbC Harlem y con la Hb 13

22 de Bart) Se dan resultados falsos negativos cuando la concentración de HbS es inferior al 10% o la desoxigenación es inadecuada por deterioro del reactivo.(10) Prueba de solubilidad con ditionito: en esta prueba los eritrocitos se lisan, la HbS es reducida por el ditionito (hidrosulfito sódico) y la HbS reducida es insoluble en tampones inorgánicos concentrados. Los polímeros de desoxi-hbs producen opacidad (10). Las reacciones positivas se ven cuando hay numerosos cuerpos de Heinz, como en los trastornos de inestabilidad de Hemoglobina tras esplecnetomía y en los trastornos de las proteínas de la sangre por precipitación de las proteínas plasmáticas. Las reacciones negativas tienen lugar con Hb normales y con la mayoría de las Hemoglobinas anormales, y también cuando la concentración de HbS es demasiado pequeña, como ocurre en la anemia grave, o si el reactivo está deteriorado. (3) Electroforesis de Hemoglobina: Por la sustitución de un ácido glutámico de la cadena β por una valina (aminoácido neutro) su movilidad electroforética se ve disminuida, y en el gel de Hemoglobina alcalina la Hemoglobina S migra entre las fracciones A y A 2. En la electroforesis a ph 8.6 no se encontrará HbA si el paciente no ha recibido una transfusión recientemente; más del 80% de la Hemoglobina será HbS, del 1 al 2 % HbF y del 2 al 4.5 % HbA 2. La HbF está distribuida de forma irregular en los Hematíes. La HbS y la HbD tienen la misma movilidad electroforética a ph alcalino; sin embargo, en la electroforesis en gel de agarosa a ph ácido (6.2) la HbD migra con la HbA, de forma diferente a la HbS, lo que permite su distinción. (3) Rasgo drepanocítico (HbAS) La drepanocitemia es la Hemoglobinopatía mas frecuente en Estados Unidos. En circunstancias normales no hay signos clínicos de enfermedad ni anomalías Hematológicas. Sin embargo una acidosis o hipoxia producidas por vuelos aéreos, infección respiratoria, anestesia o insuficiencia cardiaca congestiva pueden causar una crisis drepanocítica y complicaciones vasculares, incluyendo Hematuria. En adultos con este rasgo hereditario se observa incapacidad para concentrar la orina. Los frotis son normales, excepto acaso algunas células diana. La formación de células falciformes es positiva, y casi todos los eritrocitos se convierten en falciformes finalmente. La prueba de solubilidad es positiva.(3) Electroforesis de Hemoglobina: HbA, del 50 a 65 %; la HbS, del 35 a 45 %; HbF normal; HbA 2 normal a ligero aumento hasta 4.5 %. Menos del 35 % de HbS suele indicar coexistencia de uno o más genes de talasemia α, que se asocian también con microcitosis. (3) 14

23 Enfermedad de la Hemoglobina C La enfermedad homocigótica de la Hemoglobina C es una anemia hemolítica leve con esplenomegalia, que a menudo es asintomática, pero a veces ocasiona ictericia y molestias abdominales. (3) En sangre: Se observa una anemia leve normocrómica y normocítica con una mezcla de microcitos y esferocitos, un aumento mínimo de reticulocitos y numerosas células diana. La fragilidad osmótica es difásica, con aumento y disminución.(3) En el frotis pueden apreciarse cristales hexagonales o en forma de bastoncitos en los eritrocitos. Los eritrocitos están deshidratados debido a la pérdida de cationes y de agua como resultado de la interacción de la Hemoglobina normal con la membrana de los eritrocitos. Como consecuencia las células son más rígidas y menos deformables de lo normal, incrementándose su posibilidad de ser retenidas y destruidas en el bazo. El VCM es normal o está dimninuído y la CHCM es normal o está incrementada. (3) Electroforesis de Hemoglobina: Un ácido glutámico de la cadena β es sustituido por lisina (aminoácido básico). Su movilidad se ve fuertemente reducida. En el gel de Hemoglobina alcalina C, E y A 2 se superponen. Cuando esta fracción es > 15 %, debe sospecharse la presencia de Hemoglobinas C y E. (4) No existe HbA; más del 90% es HbC, y menos del 7% es HbF. La Hb E y la Hb O Arab tienen la misma movilidad electroforética que la Hb C a ph alcalino, pero pueden ser separadas por medio de una electroforesis en gel de agarosa a ph ácido, donde la Hb E migrará junto con la HbA. (3) Rasgo de la Hemoglobina C El estado heterocigoto es asintomático, sin anemia y muestra hipocromía leve y células diana (hasta un 40%)(3) Electroforesis de Hemoglobina: La HbA representa del 50 a 60%; la Hemoglobina C del 30 al 40 %. Proporciones inferiores de HbC y microcitosis se asocian con talasemia α.(3) 15

24 Hemoglobina D Un ácido glutámico de la cadena β es sustituido por glutamina.(4) La homocigosis y heterocigosis para la HbD no manifiestan anomalías clínicas o Hematológicas, a excepción de unas pocas células diana en el frotis de individuos que son homocigotos para HbD.(3) Electroforesis de Hemoglobina: La HbD tiene una movilidad en la electroforesis alcalina idéntica a la de la HbS, pero una solubilidad y una prueba drepanocítica negativas (3). Al contrario de la Hemoglobina S, la Hemoglobina D no se separa de la Hemoglobina A en tampón ácido, esta propiedad permite diferenciar S y D.(4) Enfermedad y rasgo de Hemoglobina E La HbE es la segunda Hemoglobina mas frecuente en el mundo. Un ácido glutámico de la cadena β es sustituido por lisina (aminoácido básico). (8) Se encuentra principalmente en el sudeste asiático y en especial en población tailandesa y birmana. El rasgo HbE (HbAE) es asintomático, con microcitosis y no hay anemia. La enfermedad de la HbE, también es asintomática; se parece al rasgo talasémico con microcitosis y eritrocitosis y, si la hay, ligera anemia. Las células diana son numerosas en el frotis sanguíneo. (3) Electroforesis: La HbE migra de manera similar a la HbA 2, HbC y HbO Arab en la electroforesis alcalina. A ph ácido, la HbE migra con la HbA, la Hb O Arab tiende a separarse de la A y la HbC es distinta. En el homocigoto, la Hemoglobina E representa mas del 90% de la Hemoglobina, la HbF del 1 al 10%, no existe HbA y la HbA 2 es normal. En el heterocigoto, la HbA representa del 65 al 70% de la Hemoglobina total y la HbE, del 30 al 35%. Si también hay uno o mas genes de talasemia α, la proporción de HbE disminuye. (3) ANORMALIDADES CUANTITATIVAS: TALASEMIAS Constituyen un grupo heterogéneo de enfermedades que proceden de mutaciones en los genes de globina que reducen o anulan totalmente la síntesis de una o mas de dichas cadenas. Origina hipocromía y microcitosis, y en las formas mas severas anemia. Hay dos tipos de síndromes talasémicos: talasemias alfa y talasemias beta.(4) 16

25 Talasemias alfa Se caracterizan por una disminución en la síntesis de las cadenas α, que afecta por consiguiente la síntesis de todas las Hemoglobinas normales.(4) Las formas mas frecuentes de α-talasemias proceden de la deleción de uno, dos, tres o los cuatro loci de genes de la zona α-globina procedentes de las dos copias del cromosoma 16 presentes en los humanos normales. Es extremadamente común en Asia y la cuenca mediterránea, así como en la población indígena americana. (5) Fisiopatología y genética Los tipos de alfa talasemia clásicos se han definido por el número de genes afectados. La α-talasemia 2, es el estado de portador silencioso, es debido a la deleción de uno de los cuatro alelos. Es asintomática pero transmisible como un rasgo que puede añadir severidad en la desendencia con herencia adicional de alelos de α-talasemia del otro progenitor. (5) La α-talasemia 1 procede de la deleción de las dos copias unidas de los genes de la α-globina del mismo cromosoma. Se observan cambios hipocrómicos moderados y microcíticos y pueden parecerse al rasgo β talasémico, pero sin elevación de la HbA 2 y normalmente con cambios menos dramáticos. (5) El exceso de síntesis de cadenas β y γ en relación con las cadenas α induce la formación de tetrámeros, como la Hemoglobina de Bart (γ 4) y la Hemoglobina H (β 4).(4) Enfermedad de Hemoglobina H Afecta a la herencia de la α-talasemia 1 de un progenitor y a la α-talasemia 2 del otro, por lo tanto tres de los cuatro alelos de la α-globina no están. Solo se forma una pequeña cantidad de HbA. El exceso de cadenas β provocan la formación del tetrámero (β4) Hb H, que se comporta como una Hemoglobina inestable. Estos pacientes presentan de una anemia Hemolítica de moderada a severa.(5) 17

26 Hemoglobina de Bart Afecta a la herencia de los dos cromosomas de la α-talasemia de ambos progenitores, originando una ausencia total de los genes de globina y por lo tanto hay ausencia total de la síntesis de la Hemoglobina fetal y adulta. La Hemoglobina de Bart consiste sólo en cadenas γ acumuladas, y tiene una afinidad extremadamente alta con el oxígeno y no hay liberación de este a los tejidos. Los niños desarrollan una insuficiencia cardiaca congestiva severa y normalmente mueren intraútero. Hay una tasa aumentada de polihidramnios y de morbilidad materna durante las primeras etapas del embarazo.(5) α-talasemia con Hb Constant spring Procede de una mutación en el codón de transducción terminal del gen de la α-globina; por lo tanto se incorporan 31 aminoácidos extras en la zona carboxilo-terminal de la cadena de α-globina. (5) Diagnóstico El rasgo α-talasémico se reconoce como una microcitosis en pacientes con anemia mínima o sin ella y un frotis característico con poblaciones microcíticas hipocrómicas con un número excesivo de dianocitos y anisocitosis. El rasgo de α-talasemia 2 puede permanecer silente en lo que se refiere a hallazgos de laboratorio y a los síntomas. Los pacientes con Hb H presentan evidencias de Hemólisis, a veces con ictericia neonatal. Los neonatos que tienen una Hb de Bart en niveles altos tienen anemia microcítica con estigmas de Hemólisis.(5) La Hb H se detecta rápidamente con técnicas de hibridación molecular. Los estudios de DNA o la valoración de la síntesis de globina pueden confirmar el diagnóstico intraútero. El hidrops fetal se diagnostica por la presencia de un niño hidrópico en ausencia de compatibilidad inmune Rh o ABO y predominio de la Hemoglobina de Bart por electroforesis, así como la microcitosis e hipocromía características halladas en el frotis. (5) 18

27 Talasemias beta Se caracterizan por un descenso en la síntesis de las cadenas β, que es acompañada por el incremento de la síntesis de las cadenas γ y δ.(4) Las formas de talasemia surgen de mutaciones que afectan casi cada paso de la expresión de los genes de globina. El descenso o la ausencia en la síntesis de β-globina impide la acumulación de Hemoglobina en las células y por lo tanto son hipocrómicas y microcíticas. Las cadenas libres de α-globina se acumulan y precipitan durante el desarrollo inicial de los eritroblastos por que las cadenas α son muy insolubles. Las inclusiones de α-globina son altamente tóxicas para los eritroblastos, originando la destrucción intramedular de los mismos (eritropoyesis ineficaz). Los pocos precursores que sobreviven a la fase reticulocito eritrocito tienen una vida media muy corta (anemia Hemolítica). La anemia estimula a la eritropoyetina, que estimula todavía más el crecimiento ineficaz de la médula ósea; con frecuencia existe invasión del hueso cortical y en algunos casos se forman focos de Hematopoyesis extramedular, que se presentan clínicamente como masas semejando a los linfomas.(3) Los pacientes talasémicos homocigotos severamente afectados presentan una facies característica mongolide, debida al crecimiento de la médula ósea en los maxilares y el cráneo. También presentan anemia profunda con insuficiencia cardiaca congestiva, estigmas de Hemólisis, hepatomegalia, cálculos biliares, exceso de absorción de hierro y el frotis demuestra hipocromía y microcitosis con muchas formas anómalas, glóbulos rojos nucleados y eritroblastosis masiva. Sin transfusiones, los pacientes severamente afectados mueren en la infancia temprana de insuficiencia cardiaca congestiva o infección. Los pacientes talasémicos heterocigotos son totalmente asintomáticos.(3) Diagnóstico El rasgo β-talasémico se reconoce por una hipocromía y microcitosis significativa en pacientes con anemia moderada o mínima. El hierro y la ferritina son normales.(5) Electroforesis de Hemoglobina: los porcentajes de HbF y HbA 2 se incrementan con respecto a la Hemoglobina A. En estado homocigoto existe anemia severa, la HbF esta muy elevada y la HbA 2 moderadamente elevada. En heterocigotos la producción es normal o moderadamente disminuida de HbA, la cual es compensada por HbF (3-6%) y HbA 2.(5) 19

28 La δ β-talasemia, es menos frecuente y se asocia a la elevación de la HbF (normalmente sobre un 5 10%), pero con una Hb A 2 normal o baja. Otras formas raras de talasemia, como la Hb lepore, han sido descritas. Estas formas ya son reconocidas en los laboratorios clínicos.(5) 2.3 PROTEÍNAS Las proteínas son biomoléculas que constan de cadenas continuas de átomos de carbono y nitrógeno unidos mediante enlaces peptídicos entre aminoácidos adyacentes. En un extremo hay un grupo amino libre (aminoterminal) y en el otro un grupo carboxilo libre (carboxiloterminal). Mientras el esqueleto del péptido es cualitativamente invariable entre las diferentes proteínas (su longitud total es equivalente al número total de aminoácidos que se encuentran en una determinada proteína) las proteínas tienen una identidad estructural en virtud de los grupos laterales o restos de aminoácidos constituyentes. El peso molecular medio de un aminoácido es 120 daltons. Las proteínas séricas tienen un tamaño que varía aproximadamente de 66 a mas de 700 KDa. Estas cadenas laterales de aminoácidos se agrupan, convencionalmente de acuerdo a su naturaleza química: hidrógeno (glicina), alifáticas (alanina, valina, leucina, isoleucina), hidroximetilamina (serina y treonina), aromáticas (tirosina, fenilalanina y triptófano), imino (prolina e hidroxiprolina), ácidas (aspartato y glutamato), básicas (arginina, histidina y lisina), amidas (asparragina y glutamina) y con azufre (cisteína y metionina). Estas cadenas laterales diferentes son cargadas, polares o hidrófobas, dando como resultado su tendencia a ser relativamente solubles o insolubles en agua.(1) ESTRUCTURA PROTEÍNICA Estructura primaria Es la secuencia lineal de aminoácidos, la cual determina la identidad de una proteína, su estructura molecular, que funciones puede realizar, como puede unirse a otras moléculas y como puede participar en los procesos de reconocimiento entre moléculas y células. Estas acciones biológicas están dirigidas mediante reacciones entre los grupos cargados de una molécula y los de otra y de modo similar, mediante interacciones hidrófobas entre las moléculas. Procesos analíticos como la electroforesis, dependen de la secuencia primaria de los aminoácidos (1). 20

29 Estructura secundaria Se refiere a las conformaciones tridimensionales regulares específicas en las que se pliegan las partes de la cadena polipeptídica. Existen tres estructuras. La primera es hélice α, en la cual la cadena forma una hélice regular de tal forma que el grupo C=O en posición i del esqueleto del péptido se une mediante puentes de hidrógeno al grupo N-H en posición (i + 4) de la unidad peptídica. La segunda es la estructura en hojas plegadas β, en estructuras extendidas completamente, en las cuales la cadena forma una estructura plana en la que las cadenas laterales de los aminoácidos adyacentes se sitúan en direcciones opuestas; en esta conformación pueden asociarse dos o mas cadenas extendidas de tal modo que se formen un número máximo de enlaces C=O H-N entre ellas. La hoja plegada β puede tener sus cadenas β individuales en orientaciones paralelas o antiparalelas. Por último un tercer grupo de estructuras, es la conformación en giro, en la cual la dirección de la cadena polipeptídica se invierte sobre si misma, permitiendo así que las largas estructuras primarias se doblen hacia atrás y sobre ellas mismas, adoptando configuraciones compactas(1). Estructura terciaria La estructura tridimensional real o el patrón de plegamiento de la proteína, determinado únicamente por su secuencia de aminoácidos, se denomina estructura terciaria, es decir, se refiere a las relaciones espaciales entre los elementos de la estructura secundaria (1). Estructura cuaternaria Proteínas individuales o subunidades monoméricas pueden formar complejos más estables como dímeros, trímeros, tetrámeros, etc. lo cual se denomina estructura cuaternaria (1). Los aminoácidos ácidos y básicos determinan la carga neta de una proteína y por tanto su movilidad electroforética. La carga de los grupos carboxilo y amino depende del ph (es decir, si un hidrógeno está unido o disociado del grupo) combinando todos los grupos laterales, y sus distintos grados de disociación, se denomina punto isoeléctrico (pi) de una proteína al ph en el cual esta tiene carga neta igual a cero. Las proteínas con un pi inferior a 7 son ácidas y tienden a tener grupos laterales carboxilo disociados, mientras que las que tienen un pi superior a 7 son básicas (1). 21