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1 La herida induce cambios en las enzimas relacionadas con el metabolismo de especies reactivas de oxígeno en frutos de aguacate (Persea americana Mill. var. Hass) Yesenia Martínez Días, Elda Castro Mercado, Ernesto García Pineda Instituto de Investigaciones Químico Biológicas, Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas, UMSNH. Resumen La herida presenta un constante desafío para la sobrevivencia de la planta porque no solo destruye físicamente el tejido vegetal, sino que también provee una ruta para la invasión de patógenos. Las especies reactivas de oxígeno (ERO) son componentes comunes de la respuesta de las plantas en contra del ataque por patógenos y herbívoros. En este trabajo estudiamos enzimas que metabolizan ERO, tales como peroxidasa (POD), superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT), para analizar las respuestas de frutos de aguacate (Persea americana) al daño por herida. La actividad de POD se incrementó 24 h después del tratamiento, SOD y CAT mostraron un importante decremento 12 y 24 h después de la herida, respectivamente. Se observaron al menos 6 isoenzimas para POD y solo una de ellas se incrementó significativamente Ciencia Nicolaita No Julio de 2009

2 Abstract después de la herida. Dos isoenzimas para SOD se detectaron en todos los tiempos analizados y ambas actividades decrecieron después de la herida. Palabras clave. Especies reactivas de oxígeno, peroxidasa, catalasa, superóxido dismutasa, herida, aguacate. Wounding presents a constant threat to plant survival because it not only physically destroys plant tissue, but also provides a pathway for pathogen invasion. Reactive oxygen species (ROS) are common components of the defense responses of plants against pathogen and herbivore attacks. In this work we studied enzymes that metabolize ROS, like peroxidase (POD), superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), to understand avocado fruits (Persea americana) responses to wounding. POD activity increased to high levels 24 h after treatment, and SOD and CAT showed an important decrease 12 h and 72 after wounding, respectively. At least 6 isoenzymes were observed to POD and only one POD isoenzyme activity increased significantly after wounding. Two SOD isonzymes were detected in all times assayed and both activities decreased after wounding. Keywords. Reactive oxygen species, peroxidase, catalase, superoxide dismutase, wounding, avocado. Introducción La herida induce cambios en las enzimas relacionadas con el metabolismo... La herida es un daño común que ocurre en plantas como un resultado de factores abióticos como el viento, la lluvia y el granizo y de factores bióticos, especialmente la mordedura por insectos (Choeng et al., 2002). La herida representa una amenaza constante para la sobrevivencia de la planta porque no solo destruye físicamente el tejido vegetal, sino porque también provee un medio para la invasión de patógenos. Las plantas han desarrollado mecanismos que integran las respuestas a herida y a patógenos porque se ha demostrado que la herida regula la expresión de genes que también son regulados durante la respuesta a patógenos y también comparten componentes en sus rutas de señalización (Reymond y Farmer, 1998; Durrant et al., 2000; Reymond et al., 2000; Maleck y Dietrich, 1999). Las respuestas de defensa incluyen la explosión oxidativa, la cual se caracteriza por una generación rápida de peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ), de anión superóxido (O 2 - ) y de radical hidroxilo (OH. ) y contribuyen a restringir la invasión del tejido por patógenos (Rushton y Somssich, 1998; Scheel, 1998). También se ha observado la acumulación de H 2 O 2 inducida por herida tanto local como sistémicamente en hojas de plantas (Bergey et al., 1999; Orozco-Cárdenas y Ryan, 1999). El O 2 - reacciona con facilidad con los lípidos que componen la membrana plasmática, generalmente rompiendo y generando daños irreversibles a esta estructura. Este radical puede actuar como oxidante o como agente reductor y por lo tanto puede ser capaz de oxidar una gran variedad de moléculas orgánicas tales como proteínas, carbohidratos y lípidos. El O 2 - se puede dismutar en H 2 O 2 yo 2.ElH 2 O 2 es un oxidante relativamente Julio de Ciencia Nicolaita No. 51

3 estable, tiene una capacidad más baja que el O - 2 para reaccionar con moléculas biológicas y es capaz de cruzar las membranas celulares debido a la ausencia de carga eléctrica de su molécula. Se ha reportado que el H 2 O 2 modula la expresión de varios genes relacionados con la defensa de las plantas (Scandalios, 2005). El OH. es un agente altamente oxidante, es el derivado reactivo de oxígeno más tóxico que se produce. Los ácidos grasos no saturados de las membranas celulares son particularmente susceptibles a la oxidación por el radical hidroxilo lo que repercute en la pérdida de la integridad de la membrana y finalmente, muerte celular (Esterbauer et al., 1991). Debido a la naturaleza tóxica de las ERO, sus niveles deben estar bajo un control estricto, para lo cual las plantas poseen eficientes sistemas de defensa antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos que evitan el daño oxidativo. Estos sistemas forman una unidad versátil de control de la acumulación de ERO en espacio y tiempo, como resultado de sus propiedades bioquímicas y de su inducción a nivel enzimático y genético (Alscher y Hess, 1993). Durante el estrés en plantas el incremento en la producción de ERO puede ser resultado del incremento y/o de la expresión genética de las enzimas generadoras (NADPH oxidasa, peroxidasa, oxalato oxidasa, etc.), desactivación y/o inhibición de la expresión de enzimas antioxidantes (catalasa, glutatión peroxidasa, superóxido dismutasa) y decremento en componentes antioxidantes no enzimáticos (ascorbato, glutatión, etc). De esta manera, dependiendo del modelo de estudio (planta, agente- estresante), la producción de ERO puede ser regulada por una o varias enzimas citosólicas y/o apoplásticas y amortiguada por uno o varios de los sistemas antioxidantes. El aguacate (Persea americana Mill) es una fruta que pertenece a la familia de las lauráceas. La variedad Hass es particularmente importante por su alta comercialización (Olavarrieta, 1993). En estudios previos se ha reportado la producción de especies reactivas de oxígeno en fruto de aguacate en respuesta al daño por herida, utilizando DAB y NBT para la detección in vivo de H 2 O 2 yo - 2, respectivamente (Castro-Mercado, 2006). En este trabajo fue de nuestro interés estudiar enzimas relacionadas con el metabolismo de especies reactivas de oxígeno tales como catalasa, superóxido dismutasa y peroxidasa en frutos de aguacate tratados por herida. Materiales y métodos Material biológico Frutos de aguacate (Persea americana Mill cv. Hass) fisiológicamente determinado como verde (Castro-Mercado, 2006). Reactivos Fosfato de potasio, fosfato de sodio, citrato de sodio, cloruro de potasio, EDTA (ácido etilen diamino tetracético), riboflavina, polivinilpolipirrolidona (PVPP), nitro blue tetrazolium Ciencia Nicolaita No Julio de 2009

4 (NBT), guaiacol, diaminobenzidina (DAB), catalasa (CAT), superóxido dismutasa (SOD), peroxidasa (POD), riboflavina, isopropanol, todos de la marca Sigma (St. Louis, MO, USA). Tris, glicina, glicerol, acrilamida, Bis-acrilamida, TEMED, Ditiotreitol, glicerol, de la marca GibcoBRL (Grand Island, N.Y). Bradford (BIO RAD). Peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ) 30% de la marca Caledon laboratories LDT (Georgetown, Ont., Canadá), persulfato de amonio, fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF), de la marca Promega (Grand Island, N.Y). Tratamiento Se utilizó el mesocarpio de los frutos para obtener círculos de tejido de 0.5 cm de diámetro los cuales fueron incubados a diferentes tiempos. Posteriormente el tejido se colectó, se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80ºC hasta su utilización. Extracción de las enzimas Las diferentes enzimas se extrajeron de la siguiente manera: 0.5 g de tejido de mesocarpio de aguacate se hicieron un polvo fino en un mortero con nitrógeno líquido, el polvo se homogenizó en 1 ml de amortiguador conteniendo lo siguiente, para catalasa, Tris-HCl 50 mm, ph 7.8, Manitol 0.3 M, PMSF 1 mm, EDTA 1 mm (De Gara et al., 2000), para peroxidasa, fosfato de sodio 100 mm, ph 7 (Cipollini, 1998), y para superóxido dismutasa, KH 2 PO 4 50 mm, ph 7, EDTA0.1 mm, PVPP (p/v) al 1% (Gupta et al., 1993). Las muestras se agitaron en vortex durante 20 segundos y se centrifugaron a 10,000 g durante 20 minutos a 4 C. Finalmente, se recuperó el sobrenadante el cual fue utilizado para los ensayos enzimáticos. Ensayo de la actividad enzimática Peroxidasa. La actividad de peroxidasa fue analizada por la formación del tetraguaiacol (Cipollini, 1998). Cada mezcla de reacción (1 ml) consistió de 10 ìl del extracto de la enzima y 990 ìl de una solución de guaiacol contiendo lo siguiente: Guaiacol al 0.25 %, NaH 2 PO 4 10 mm ph 6.0, y H 2 O 2 al %. La actividad se midió por un incremento en la absorbencia a 470 nm durante 3 minutos, en un intervalo de 30 segundos. Superóxido dismutasa. Para el ensayo de la actividad se mezclaron en un tubo Eppendorf los siguientes reactivos en volumen final de 1 ml (Beauchamp y Fridovich, 1971): 600 ml KH 2 PO 4, M, ph 7.8, 40 ml EDTA 0.1 M, 20 ml NBT 1.5 mm, 10 ml Extracto de proteína, y 50 ml Riboflavina 0.12 mm. Posteriormente, esta mezcla se expuso a una lámpara incandescente de 40 W durante 10 minutos, pasado este tiempo se midió la absorbencia a 560 nm. La actividad de la enzima fue determinada por la inhibición de la reducción del NBT. Catalasa. El ensayo de la actividad enzimática se realizó de acuerdo al protocolo reportado por De Gara et al., (2000) en un volumen final de 1 ml en un tubo Eppendorf, en una mezcla de reacción conteniendo lo siguiente: 10 ml del extracto de la enzima, 630 ml agua destilada desionizada estéril, 326 ml KH 2 PO 4 50mM,pH7,y4mldeH 2 O M. La activi- Julio de Ciencia Nicolaita No. 51

5 dad se midió por una disminución en la absorbencia a 240 nm en un espectrofotómetro Beckman DU Serie 500 (CA, USA) durante 3 minutos a intervalos de 30 segundos. En todos los experimentos se utilizó albúmina de suero bovino como estándar para cuantificar la concentración de proteína utilizando el método de Bradford (1976). Los experimentos se realizaron por cuadruplicado y los resultados se graficaron con la media aritmética y la desviación estándar. Actividad enzimática en gel de poliacrilmida no desnaturalizante Peroxidasa. Se aplicaron 30 µg de proteína en un gel de poliacrilamida y la electroforesis se realizó a voltaje constante (100 V) durante 8 horas a 4ºC en una fuente de poder Modelo EC 105. Para detectar la actividad, el gel fue sumergido en un amortiguador de citrato de sodio 50 mm, ph 5.5, durante 30 minutos en agitación a temperatura ambiente. Después, el líquido se reemplazó por el mismo amortiguador conteniendo diaminobenzidina 1 mm y 0.03%deH 2 O 2, hasta observar bandas de color café características de la actividad de la enzima (Christensen et al., 1998). Los resultados se documentaron tomando fotografías de los geles. Enfoque isoeléctrico para superóxido dismutasa. 125 µg de proteína se mezclaron en una proporción 1:1 con el buffer de carga (glicerol, anfolina en un rango de ph de 3.5 a 9.5, y agua destilada y desionizada estéril). La mezcla se centrifugó durante 5 minutos a 10,000 g a temperatura ambiente. Las condiciones de desarrollo del enfoque fueron de 2.5 h a 200 V. Para revelar la actividad enzimática, el gel se sumergió en 50 ml de un amortiguador de KH 2 PO 4 32 mm, ph 7.8, riboflavina 28 mm y TEMED 28 mm durante 25 minutos en agitación, después, el líquido se reemplazó con 50 ml de una solución de amortiguador de KH 2 PO 4 36 mm, ph 7.8 conteniendo NBT 2 mm y se incubó durante 30 minutos, pasado este tiempo manteniéndose en el amortiguador, el gel fue iluminado con una lámpara de 40 W du- Figura 1. Efecto de la herida sobre la actividad de peroxidasa en frutos de aguacate. Discos de mesocarpio de aguacate fueron tratados a diferentes tiempos por herida y la actividad enzimática se analizó por espectrofotometría como se describe en Material y Métodos. Los datos representan la media ± DE. n=4. Ciencia Nicolaita No Julio de 2009

6 rante 15 minutos o hasta observar las bandas acromáticas características de la actividad de la enzima (Gonzáles et al., 1998). Resultados Peroxidasa. La actividad de la enzima se estudió a diferentes tiempos después del daño por herida. Se observó un incremento en la actividad a partir de las 8 h, el cual continuó hasta las 24 h (Fig. 1). Se ha reportado que en plantas existen múltiples isoenzimas de peroxidasas, por lo tanto, para analizar la composición y el comportamiento en actividad de las diferentes isoenzimas que pudieran estar presentes en este fruto, se realizó una separación en gel de poliacrilamida no desnaturalizante, los resultados obtenidos se muestran en la figura 2. Se observaron al menos 6 isoenzimas (designadas como POD1, 2, 3, 4, 5,y6enorden de incremento en su movilidad) las cuales se conservaron en todos los tiempos analizados, con Figura 2. Isoenzimas de peroxidasa de mesocarpo de fruto de aguacate tratado a diferentes tiempos por herida. Muestras de tejido de mesocarpio se separaron en gel de electroforesis no desnaturalizante después de los tiempos indicados, y la actividad enzimática se reveló como se describe en Material y Métodos. A. Peroxidasas totales. B. Análisis de POD1 a tiempos largos de tratamiento. KD=marcador de peso molecular; POD=peroxidasa comercial de rábano. La figura muestra datos representativos de al menos tres repeticiones. Julio de Ciencia Nicolaita No. 51

7 excepción de POD5, la cual no se observa 24 h después del tratamiento. La intensidad de algunas isoenzimas varía con respecto al tiempo de tratamiento, así, la intensidad de POD6 disminuyó con respecto al tiempo de tratamiento. POD3, 4y5nomostraron cambios en su intensidad. La intensidad de POD2 mostró un ligero incremento en relación al tiempo de tratamiento, más notable entre las 8 y las12 horas. Interesantemente POD1 mostró un fuerte incremento en intensidad que correlacionó con el tiempo de tratamiento (Fig. 2A). Este incremento en intensidad también correlacionó con el incremento en la actividad analizada por espectrofotometría (Fig.1). De acuerdo con los resultados observados es probable que POD1 pudiera estar contribuyendo mayoritariamente a la actividad total de peroxidasa. Para conocer el comportamiento de la actividad enzimática a tiempos largos, se realizaron ensayos enzimáticos hasta las 72 h de tratamiento, y se obtuvo un incremento constante de la actividad hasta el final del tiempo analizado (Fig. 2B). Superóxido dismutasa. Se determinó la actividad de la superóxido dismutasa por espectrofotometría a diferentes tiempos después del tratamiento por herida. En los resultados se observó una disminución de la actividad a partir de las 4 h del tratamiento, siendo más evidente a las 12 h (Tabla 1). TABLA 1 Efecto de la herida en fruto de aguacate sobre la actividad de la enzima superóxido dismutasa. Tejido de mesocarpio se colectó a los tiempos de tratamiento establecidos en el experimento y se analizó la actividad de la enzima por espectrofotometría como se describe en Materiales y Métodos. Los datos representan la media DE.N=4. Tiempo (h) Superóxido dismutasa (unidades/ mg de prot.) Se realizó un análisis por enfoque isoeléctrico para conocer las posibles SOD presentes en el tejido de fruto de aguacate y su comportamiento durante el tratamiento por herida (Fig. 3). El análisis reveló con mayor claridad la presencia de 2 isoenzimas (designadas SOD1, y SOD2, las cuales migraron hasta un ph de 6.4 y 6.0, respectivamente), en orden de incremento de su movilidad (Fig. 3A). Estas dos bandas se observaron a lo largo de todo el experimento, pero su intensidad decreció en relación al tiempo de tratamiento, si bien no de la misma manera. Catalasa. La actividad específica de la catalasa se midió a diferentes tiempos de estimulación por herida (Fig. 3B). Se observó una disminución de la actividad a las 24 h, la cual permaneció hasta las 72 h. Ciencia Nicolaita No Julio de 2009

8 Figura 3. Efecto de la herida en fruto de aguacate sobre las enzimas superóxido dismutasa y catalasa. A. Enfoque isoeléctrico para superóxido dismutasa. La figura muestra datos representativos de al menos tres repeticiones. B. Actividad enzimática de catalasa. Los datos representan la media ± DE. n=4. Discusión En un trabajo previo en nuestro laboratorio se detectó la producción de ERO en respuesta al daño por herida en frutos de aguacate (Castro-Mercado, 2006). La producción de ERO puede contribuir a la activación de otras respuestas de defensa, pero cuando sus concentraciones se incrementan excesivamente puede ocasionar daño celular porque pueden dañar a los lípidos, proteínas y moléculas de ADN (Scandalios, 2005). El incremento de ERO puede ser controlado a través de cambios en la actividad de enzimas antioxidantes para proteger al tejido vegetal. La herida en el fruto de aguacate incrementó la actividad de peroxidasa (Fig. 1). En plantas, las peroxidasas se agrupan en una familia de proteínas, por lo que en nuestra investigación fue de interés conocer cuántas isoenzimas estaban presentes en el mesocarpio de aguacate. Los resultados experimentales detectaron 6 isoenzimas y la intensidad de la banda de algunas de ellas varía con respecto al tiempo de estimulación (Fig. 2). POD 1 fue inducida en respuesta al daño por herida. Julio de Ciencia Nicolaita No. 51

9 Se ha reportado que el incremento de la actividad de peroxidasa se debe a la síntesis de novo de la proteína más que por la activación de la enzima (Lagrimini y Rothstein, 1987). Además, son codificadas por una gran familia de genes. En Arabidopsis más de 100 secuencias expresadas codifican para diferentes isoenzimas (Hiraga et al., 2001). Las peroxidasas están involucradas en múltiples procesos fisiológicos. Lagrimini y Rothstein (1987) reportaron que en el tabaco existen diferencias en el patrón de isoenzimas en órganos específicos; también encontraron 13 isoenzimas en raíz, 5 en hojas y 8 en callo y éstas variaron con el tipo de estrés ocasionado. En arroz, los genes de pox responden diferencialmente a la infección por patógenos y al daño por herida, el patrón de expresión fue de 21 genes, los cuales fueron altamente divergentes con respecto a su distribución en órganos y la respuesta al estímulo ambiental (Hiraga et al., 2001). Las peroxidasas se han propuesto como candidatas a catalizar el último paso en la polimerización de monolignoles como ñ-coumaroil alcohol, coniferil alcohol, 5-hidroxiconiferil alcohol y sinafil alcohol para la formación de la lignina (Campbell y Sederoff 1996; Hatfield y Vermerris, 2001). La acumulación de esas macromoléculas refuerza la pared celular, por lo tanto, restringen la expansión celular, la difusión de nutrientes del hospedero, las toxinas microbianas, la invasión de patógenos oportunistas y le confiere reforzamiento al cuerpo de la planta (Hiraga et al., 2001). En el análisis de la superóxido dismutasa se observó una disminución en la actividad enzimática de las dos isoenzimas encontradas (Tabla 1). Se ha reportado que el H 2 O 2 inactiva a esta enzima (Casano et al., 1997), por lo tanto, es posible que la disminución de la actividad observada en este estudio se deba a la acumulación de H 2 O 2, la cual se demostró por Castro-Mercado (2006) como respuesta al mismo tratamiento utilizado en este trabajo. La actividad de catalasa disminuyó después del tratamiento por herida (Fig. 3B). En plantas, las catalasas son enzimas tetraméricas que están involucradas en regular la acumulación de H 2 O 2 en la célula. Están presentes en todos los organismos aerobios y convierten el H 2 O 2 en H 2 OyO 2, así protegen a la célula de los efectos dañinos del H 2 O 2 (Sánchez-Casas y Klessing, 1994). Se podría sugerir que debido a la disminución de su actividad se acumula H 2 O 2 en la célula. Esto es apoyado por experimentos previos realizados en el laboratorio por Castro-Mercado (2006) donde observó un incremento en la acumulación de H 2 O 2 con respecto al tiempo de estimulación en fruto de aguacate dañado por herida. La acumulación de H 2 O 2 por si mismo puede crear un ambiente antimicrobiano en el apoplasto (Peng y Kúc, 1992; Legendre et al., 1993). Agradecimientos. Los autores agradecen enormemente el apoyo financiero otorgado por el CONACYT para la realización de este proyecto de investigación. YMD y ECM recibieron una beca complementaria de este apoyo para la terminación de su tesis de Maestría en Ciencias. Ciencia Nicolaita No Julio de 2009

10 Literatura citada Alscher, G.R., Hess, J.L Antioxidants in higher plants. Boca Raton: CRC Press. Beauchamp, C., Fridovich, I Superoxide dismutase: Improved assays and an assay applicable to acrylamide gels. Analytical Biochemistry 44: Bergey, D.R., Orozco-Cárdenas, M., De Moura, D.S., Ryan, C.A A wound- and systemin-inducible polygalacturonase in tomato. USA 96: Campbell, M.M., Sederoff, R.R Variation in lignin content and composition; mechanisms of control and implications for the genetic improvement of plants. Plant. Physiology 110: Casano, M.L., Goméz, D.L., Lascano, R.H., Gonzáles, A.C., Trippi, S.V Inactivation and degradation of Cu-Zn SOD by active oxygen species in wheat chloroplasts exponed to photooxidative stress. Plant and Cell Physiology 38: Castro-Mercado, E Producción de especies reactivas de oxígeno en respuesta al daño por herida en frutos de aguacate (Persea americana Mill cv Hass. Tesis de Maestría. Cheong, Y.H., Chang, H.S., Gupta, R., Wang, X., Zhu, T., Luan, S Transcriptional profiling reveals novel interactions between wounding, pathogen, abiotic stress, and hormonal responses in Arabidopsis. Plant Physiology 129: Christensen, H.J., Bauw, G., Welinder, G.K., Montagu, V.M., Boerjan, W Purification and characterization of peroxidases correlated with lignification in poplar Xylem. Plant Physiology 118: Cipollini, F.D The induction of soluble peroxidase activity in bean leaves by wind-induced mechanical perturbation. American Journal of Botany 85: De Gara, L., Paciolla, De Tullio., C.M., Motto, M., Arrigoni, O Ascorbate-dependent hydrogen peroxide detoxification and ascorbate regeneration during germination of a highly productive Maite hybrid: Evidence of an improved detoxification mechanism against reactive oxygen species. Plant Physiology 109: Durrant, W.E., Rowland, O., Piedras, P., Hammond-Kosack, K.E., Jones, J.D.G cdna-aflp reveals a striking overlap in race-specific resistance and wound response gene expression profiles. Plant Cell 12: Esterbauer, H., Schaur, R.J., Zollner, H Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal malonaldehyde and related aldehydes. Free Radical Biology and Medicine11: Gonzales, A., Steffen, L.K., Lynch, P.J Light and excess manganese. Implications for oxidative stress in common bean. Plant Physiology 118: Gupta, S.A., Webb, P.R., Holaday, S.A., Allen, D.R Overespression of superoxide dismutase protected plants from oxidative stress. Plant Physiology 103: Julio de Ciencia Nicolaita No. 51

11 Hatfield, R., Vermerris, W Lignin formation in plants. The dilemma of linkage specificity. Plant Physiology 126: Hiraga, S., Sasaki, K., Ito, H., OACI, Y., Matsui, H A large family of class III plant peroxidase. Plant and Cell Physiology 42: Lagrimini, M.L., Rothstein, S Tissue specificity of tobacco peroxidase isozymes and their induction by wounding and tobacco mosaic virus infection. Plant Physiology 8: Legendre, L., Rueter, S., Heinstein, P.F., Low, P.S Characterization of the oligogalacturonide-induced oxidative burst in cultured soybean (Glycine max) cells Plant Physiology 102: Maleck, K., Dietrich, R.A Defense on multiple fronts: How do plants cope with diverse enemies? Trends in Plant Science 4: Olavarrieta, C Entrevista al Director del Centro de Investigaciones Científicas y tecnológicas sobre el Aguacate en el estado de México, en conservas, año 3, núm.6, México, pp Orozco-Cárdenas, M., Ryan, C.A Hydrogen peroxide is generated systemically in plant leaves by wounding and systemin vía the octadecanoid pathway. USA. 96: Peng, M., Kúc, J Peroxidase-generated hydrogen peroxide as a source of antifungal activity in vitro and on tobacco leaf discs. Phytopatology 82: Reymond, P., Farmer, E.E Jasmonate and salicylate as global signals for defense gene expression. Current Opinion in Plant Biology 1: Reymond, P., Weber, H., Damond, M., Farmer, E.E Differential gene expression in response to mechanical wounding and insect feeding in Arabidopsis. Plant Cell 12: Rushton, P.J., Somssich, I.E Transcriptional control of plant genes responsive to pathogens. Current Opinion in Plant Biology 1: Sánchez-Casas, P., Klessing, F.D A salicylic acid-binding activity and a salicylic acid-inhibitable catalase activity are present in a variety of plant species. Plant Physiology 106: Scandalios, J.G Oxidative stress: molecular perception and transduction of signals triggering antioxidant gene defenses. Journal of Medical Biology 38: Scheel, D Resistance response physiology and signal transduction. Current Opinion in Plant Biology 1: Ciencia Nicolaita No Julio de 2009

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