Simposio SEAP Marcadores Moleculares Emergentes y Su Potencial Utilidad Clínica

Transcripción

1 Simposio SEAP Marcadores Moleculares Emergentes y Su Potencial Utilidad Clínica Fausto J. Rodríguez M.D. Profesor Asistente Departamento de Patología Clínica Mayo Rochester, MN

2 Resumen Nuevas Tecnologías (alto rendimiento) Matriz de hibridación genómica comparativa (a- CGH) Anomalias de BRAF en astrocitomas pilociticos Perfil de Expresión Génica Clasificación molecular de Glioblastoma Secuenciación de próxima generación IDH1 Proyectos Integrativos El Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA)

3 Matriz de hibridación genómica Comparativa (a-cgh) Técnica de alta resolución que permite evaluar alteraciones del número de copias de cualquier tejido (ADN) Utiliza BACs en vez de cromosomas completos Mayor resolución que la técnica anterior (CGH con cromosomas) Utiliza muestras anormales (e.g. tumor) y un control de referencia (ADN) Ventajas: alta resolución (<100Kb), tejido frizado o fijado en formalina Desventajas: no detecta translocaciones o mutaciones de un solo nucleótido, análisis relativamente complejo

4 Matriz de hibridación genómica Comparativa (a-cgh) Tumor Referencia ADN extraído hibridación Bioinformática Lamina con sondas

5 Astrocitoma Pilocitico Citogenética Usualmente un cariotipo normal diploide Ganancias de cromosomas (Chr 7 y 8) en aproximadamente un tercio de los casos Necesidad de usar plataformas de alta resolución para identificar aberraciones genómicas en estos tumores

6 Astrocitoma Pilocitico Duplicación de BRAF Duplicación en tándem del dominio de la quinasa de que resulta en la fusion KIAA1549:BRAF Multiples publicaciones independientes en 2008: Bar, E.E., et al., JNEN 2008 Jones, D.T., et al., Cancer Res, 2008 Pfister, S., et al., J Clin Invest, 2008 Sievert, A.J., et al., Brain Pathol, 2008

7 Frequent Gains at Chromosome 7q34 Involving BRAF in Pilocytic Astrocytoma Bar, E.E., et al., JNEN 2008

8 Figure. Tandem duplication at 7q34 produces a fusion gene between KIAA1549 and BRAF Jones, D. T.W. et al. Cancer Res 2008;68: Copyright 2008 American Association for Cancer Research

9 BRAF CEP7

10 Astrocitoma pilocitico Patología

11 Gliosis Piloide

12 Gliomas de bajo grado de tipo indeterminado

13 Perfil de Expresión Génica Utiliza ARN, en particular ARN mensajero La muestra anormal se hibridiza usando plataformas que pueden ser obtenidas comercialmente Ventajas: técnica de alto rendimiento, puede capturar cada gen expresado (teóricamente), refleja fuertemente el fenotipo Desventajas: requiere confirmación con técnicas alternativas (e.g. PCR), número alto de positivos falsos

14 Microarrays de Expresión Génica Tumor ARN extraído procesamiento Lamina con sondas

15 Glioblastoma: morfología variable Células giantes Fibrilar Gemistocitico p células pequeñas

16 Philips H, Kharbanda S, Chen R. Cancer Cell 2006.

17 NF1-associated pilocytic astrocytoma gene signature NF1-PA Sporadic-PA 7,516 differentially expressed (student t-test) 191 transcripts with FDR<0.05 Genes differentially expressed by region or nf1-/- vs wild type murine astrocytes excluded Rodriguez FJ et al. JNEN 2008

18 Técnicas de secuenciación y secuenciación de próxima generación Permite visualización de la secuencia completa de un tejido o tumor SPG: difícil de definir pero tecnologías que son rápidas, baratas, y de mas alta rendición Técnicas recientes han incrementado la velocidad de evaluación Ventajas: máxima resolución posible; translocaciones y substiciones de nucleótido único Desventajas: produce una cantidad enorme de datos, costos del procedimiento (decreciendo rápidamente), costos asociados con almacenamiento (la secuencia del genoma humano tiene 2 billones de pares de bases!)

19 Secuenciación de próxima generación Secuenciacion de Sanger clásica: 30 kb/día (1985) ABI 3700: 614 kb/día-de alta rendicion (1998) 454 (Roche): 100 Mbs/ dia 2008 (ahora mas de 500 Mb/dia) Otras máquinas (SOLID, Illumina) 454-costos de obtener la secuencia de un genoma completo: $1,000,000 (2008) Ahora en los miles de dólares!

20 Proyectos Integrativos Science 2008

21 Análisis Genómico Integrado de GBM Parsons et al. Science 2008

22 Science 2008

23 El Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) El propósito es catalogar y descubrir las principales alteraciones genómicas causantes de cáncer en grupos grandes de tumores humanos usando análisis integrados multi-dimensionales El primer cáncer estudiado es glioblastoma Muestras de ADN amplificadas son secuenciadas por el método de Sanger Análisis de número de copias de ADN Agilent 244K, Affymetrix SNP6.0 and Illumina 550K DNA Perfiles de expresión de ARN y micro-arn Affymetrix U133A, Affymetrix Exon 1.0 ST, custom Agilent 244K, and Agilent mirna array Metilación de CpG: Illumina GoldenGate assay.

24 Cancer Cell 17, , January 19, 2010

25 Integrated Genomic Analysis in GBM Cancer Cell 17, , January 19, 2010

26 Integrated Genomic Analysis in GBM Cancer Cell 17, , January 19, 2010

27 Conclusión Nuevas tecnologías van (y estan) impactando la práctica de la patología, incluyendo el análisis de tumores cerebrales Técnicas de alta resolución: resultan en hallazgos nuevos, no anticipados Fusion de KIAA1549:BRAF en astrocitomas pilociticos (acgh) IDH1 en gliomas infiltrativos (secuenciación comprensiva). Tumores idénticos fenotipicamente separados por perfil de expresión (clasificación molecular de GBM) Otras técnicas: análisis de micro-arn, SNPs Secuenciación global del genoma de cada cáncer es una posibilidad realista

28 Muchas Gracias a Todos!