Biotecnologías XIII Congreso reproductivas: Internacional sincronización. embriones. Redacción. Sincronización de celos

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1 Biotecnologías XIII Congreso reproductivas: Internacional sincronización de ANEMBE celos y de transferencia Medicina Bovina de embriones Redacción Las últimas cuatro décadas han visto la adaptación comercial de cuatro generaciones de biotecnologías reproductivas, en particular con el ganado. Empezó con la inseminación artificial y la sincronización de celos y pasó a un segundo nivel cuando se recolectaron y transfirieron embriones obtenidos in vivo. La tercera generación consistió en los embriones fecundados in vitro, la selección del sexo de los espermatozoides, recogida de los embriones para la clonación y, por último, estamos en una etapa en la que se usan para delecciones y adiciones funcionales de genes específicos en el genoma de los descendientes, mediante la transgénesis, en combinación con técnicas de biología molecular potentes de ARNsi (ARN interferentes pequeños) y el uso de vectores virales. Revisamos en estas páginas algunas las biotecnologías reproductivas que se usan a nivel práctico. APLICACIONES DE LAS BIOTECNOLOGÍAS REPRODUCTIVAS EN GANADO VACUNO Inseminación artificial y congelación de semen -eliminación y disminución de enfermedades sexuales -uso intensivo de un macho de alto valor genético -aumento de la eficiencia de la estimación del valor genético (test de progenie) Sincronización e inducción a la ovulación -aumento de la eficiencia de la producción de terneros -aumento de la eficiencia del manejo productivo y reproductivo Superovulación, transferencia y congelación de embriones -uso intensivo de la hembra de alto valor genético -recuperación más eficaz de individuos exóticos y razas en peligro de extinción -formación de bancos de germoplasma -importación y exportación de material genético Micromanipulación de embriones para producir mellizos homocigotos y quimeras -aumento del número de animales nacidos por embrión -aumento de la eficiencia del valor genético -creación de modelos óptimos de experimentación Determinación y selección del sexo de embriones y espermatozoides -producción de la descendencia con el sexo seleccionado Producción in vitro de embriones -uso de hembras que no responden a tratamientos superovulatorios -producción de embriones con ovarios de matadero -uso experimental Clonación de animales por medio de transferencia nuclear -eliminación de la variabilidad de genotipos individuales -aumento de la eficiencia de la transgénesis Sincronización de celos Los resultados reproductivos de un rebaño dependen, básicamente, de tres factores: 46

2 Biotecnologías reproductivas: sincronización de celos y transferencia de embriones La sincronización del celo y la ovulación se desarrolló en un primer momento con el objetivo de acortar el anestro postparto y la lactación, facilitando así el reinicio de las hembras a la actividad reproductiva. Esta técnica estableció la base endocrina para el desarrollo de los programas de superovulación y transferencia de embriones. La sincronización disminuye e incluso evita el tiempo de detección de celo y permite el uso más efectivo de la inseminación artificial. En la actualidad existen varios tipos de programas para la sincronización de celos: 1) los que únicamente usan prostaglandinas: bien aplicadas en vacas que han superado su periodo de espera voluntario y a las cuales se les detecta por palpación un cuerpo lúteo o utilizadas de forma programada cada 14 días (mucho más habitual), 2) programas que inseminaciones programadas y 3) programas que combinan el uso de progestágenos con Para entender como funcionan los diferentes procedimientos es importante conocer la base fisiológica. En los rumiantes la dinámica folicular ocurre de forma continúa en oleadas. Habitualmente, las vacas lecheras exhiben dos oleadas de crecimiento folicular, sin embargo puede haber tres (animales jóvenes) o más oleadas por ciclo. Cada oleada comienza con el crecimiento de un grupo de folículos, uno de los cuales continúa su crecimiento mientras los otros se atresian. En función de si el cuerpo lúteo regresa o no, el folículo dominante ovula o se atrofia (folículo anovulatorio). Tras la ovulación, las diferentes células que forman el folículo ovulatorio cambian su función y se transforman en células luteínicas que constituyen el cuerpo lúteo, cuya misión principal es la producción de progesterona (esta hormona prepara al útero para la gestación, mantiene la gestación e inhibe los signos de celo y la ovulación). La prostaglandina F2!!) es la hormona que induce la regresión del cuerpo lúteo si no se produce la gestación. IA a celo visto (2-5días) IA a celo visto (2-5d) parto PG 12/14días PG si no ha detectado el celo Tratamientos basados en prostaglandinas Como ya hemos dicho, se puede sin- deberemos tener en cuenta que: -el cuerpo lúteo solo responde a la del ciclo, lo que provocará un celo en los 2-5 días siguientes. -si un animal está en anestro o no ha llegado a la pubertad no responderá!. -no sirve para programar la inseminación artificial. Parto GnRH 7días PG horas GnRH IA entre horas El método tradicional de utilización de las prostaglandinas con el objetivo de sincronización de celos, prevé la utilización de dos dosis de hormona aplicada con un intervalo de 12 a 14 días. Con la primera aplicación 14 días antes del fin del periodo de espera voluntario normalmente el efecto luteolítico se da aproximadamente en el 60% de las vacas y con la segunda aplicación de prostaglandina se induce el estro en la totalidad de los animales. A partir de las 48 horas de la segunda aplicación se comienza a detectar celo y poder inseminar. Una variante del procedimiento descrito anteriormente consiste en inseminar las vacas que entran en celo después de la IA entre 56 horas primera aplicación de prostaglandina y sólo los animales que no se detectaron en celo reciben una segunda dosis de prostaglandina y son inseminados cuando demuestran el celo, que se da la mayoría de las veces entre las 48 y 120 horas. Tratamientos combinados de prostaglandinas con GnRH La hormona liberadora de gonadotropina induce un pico de hormona luteinizante (LH) que causa la ovulación del folículo dominante incluso en presencia de progesterona. El programa Ovsynch consiste en la postparto). Entre 36 y 48 horas después de mina de horas más tarde. La primera folículo dominante en condiciones de ovular, si regresa se producirá una nueva onda de crecimiento folicular dentro de los 2 ó 3 días falta de altas concentraciones de progeste- lúteo, se induce un pico preovulatorio de LH y el folículo ovula en las siguientes horas. Si se detectan vacas en celo en cualquier momento de la sincronización, éstas deberán ser inseminadas y las inyecciones de Otro procedimiento más reciente es el Presynch, que combina las dos dosis de 10 ó 12 días más tarde se comienza con el protocolo Ovsynch. Tratamientos con progestágenos Actualmente en el mercado se encuentran disponibles dos tipos diferentes de dispositivos intravaginales los cuales contienen concentraciones variadas de progesterona, el PRID y el CIDR. Los progestágenos mantienen los niveles de progesterona necesarios para inhibir la ovulación. En lugar de que la vaca muestre celo y ovule cuando el cuerpo lúteo se atresia, el progestágeno administrado provocará un crecimiento continuado del folículo e inhibirá la ovulación. Tras la retirada del dispositivo las concentraciones de progesterona bajarán y el animal ovulará. El protocolo más habitual consiste en colocar el dispositivo y mantenerlo aproximadamente una semana (7-9 días), 24 horas antes de retirarlo se aplica una dosis de! (en razas de carne se aconseja la retirada) y se puede inseminar a las 56 horas de la retirada o bien antes si se detecta celo. Los quistes y folículos persistentes pue- antes de la colocación del dispositivo intravaginal. Posteriormente procederemos de la misma forma. 47

3 Transferencia de embriones in vivo La superovulación y la transferencia de embriones son biotecnologías que alcanzaron su máximo desarrollo a comienzos de En Europa el número total de embriones producidos in vivo transferidos durante el año 2007 ascendió a (S. Merton, AETE, PAU, Francia 2008). Por medio de tratamientos hormonales que estimulan el desarrollo supernumerario de los folículos ováricos, destinados en condiciones naturales a la atresia, se obtiene un número de embriones transferibles que varía actualmente de 3 a 7. Las principales ventajas de esta técnica son: el incremento de la capacidad reproductora, la disminución del intervalo generacional (lo que acelera el progreso genético), el bajo riesgo de transmisión de enfermedades, la posibilidad de reproducción para algunos animales infértiles, constituye un método excelente para transportar genética. Sin embargo también existen inconvenientes, el primero un rendimiento menor al esperado. El número de embriones transferibles obtenido en cada lavado es bajo, estabilizado en torno a 4,8. Además, existen hembras que no responden a los tratamientos para inducir una ovulación múltiple, es necesario respetar periodos de descanso entre dos recogidas consecutivas y es indispensable que las donantes estén en perfectas condiciones ginecológicas. El criterio más importante en la transferencia de embriones es la selección de la hembra donante, para ello tendremos en cuenta varios factores entre ellos el índice genético (lo que transmite a su descendencia), el historial en producción y conformación de sus progenitores, su producción, su conformación (que ha de ser excelente) y, por supuesto, un buen historial reproductivo. El momento óptimo para empezar el tratamiento es entre los días 90 y 120 tras el parto; antes los resultados no son buenos y después alargaríamos el intervalo entre partos. Tras un celo natural o inducido, se inicia el tratamiento entre los días 8 y 12 (generalmente el 11) del ciclo estral, para evitar la presencia de un folículo dominante que eclipse el desarrollo de nuevos folículos. Debemos confirmar la presencia de un cuerpo lúteo activo. El tratamiento de superovulación consiste en administrar FSH durante varios días (4 ó 5) a dosis decrecientes, para inducir una!, el día 3 (1 ó 2 dosis), para provocar el celo a los dos días, e inseminar (día 6). Es conveniente efectuar 3 I.A separadas 12 horas entre si y aplicar más semen del habitual. Se puede I.A para facilitar una ovulación sincronizada. Otra alternativa es utilizar un dispositivo intravaginal de progesterona que deberá ser retirado al 4º día de tratamiento. La recogida de los embriones se efectúa entre el 6º y el 8º día después de la I.A. Antes puede haber embriones en el oviducto que no serían recuperados y después los embriones rompen la zona pelúcida y empieza la implantación en el útero. La técnica usada de forma habitual son varios lavados uterinos con un medio especial. El líquido recogido es filtrado para identificar y clasificar los embriones que posteriormente se transfieren en fresco, se conservan refrigerados (entre 0-4º C durante 24h) o se congelan. Los porcentajes de gestación con embriones congelados son menores, por lo que se recomienda congelar sólo embriones de alta calidad y con el grado de desarrollo adecuado para asegurar la gestación (blastocisto). Cuando utilizamos embriones congelados, es necesario tener en cuenta el crioprotector utilizado (deshidratan el embrión parcial y progresivamente, evitando la formación de cristales en el citoplasma y las fuertes concentraciones salinas) para decidir como descongelarlo. Si el crioprotector es glicerol, el embrión se descongela en 4 pasos que duran unos 20 minutos, con concentraciones decrecientes de glicerol y crecientes de sacarosa. Si se utilizó etilenglicol simplemente descongelamos la pajuela al baño maría. X Normalmente como receptoras se utilizan novillas, éstas pueden sincronizarse! antes de retirar el dispositivo intravaginal o con! en dos dosis separadas entre si 14 días. La última dosis debe darse 12 horas antes que a la vaca donante. Se seleccionan aquellas receptoras con el mejor cuerpo lúteo, lo que asegurará elevados niveles de progesterona. El embrión se deposita en el cuerno uterino ipsilateral al cuerpo lúteo activo. 20 La media obtenida por tratamiento es la siguiente: embriones recuperados embriones transferibles 4-5 gestaciones. 48 Embriones transferidos a nivel mundial entre los años Se considera que el 25% de las colectas no produce ningún embrión viable y que el

4 Biotecnologías reproductivas: sincronización de celos y transferencia de embriones 30% de las donantes producen el 70% de los embriones viables. La tasa de fertilidad es de un 65% para la transferencia en fresco y de un 50-60% para embriones congelados. Transferencia de embriones in vitro Este procedimiento se basa en la utilización de ovocitos inmaduros, recogidos directamente del ovario con independencia de la edad y de la situación fisiológica de la hembra. Esta técnica ofrece la posibilidad de convertir a la hembra en productora de gametos, equiparándola a los machos productores de semen para la inseminación artificial, lo que supondría numerosas ventajas en los programas de selección. Sin embargo, existen varias diferencias fisiológicas entre los machos y las hembras, que dificultan la consecución de este objetivo: la población de ovocitos presente en el ovario es limitada y no se renueva, sino que disminuye progre- feridos , lo que representa el 14,2% del total de los embriones transferidos. Tal y como ocurre con la transferencia de embriones in vivo, esta técnica ha permitido demostrar sus numerosas aplicaciones, entre las que podemos destacar: los programas de producción de embriones a partir de hembras de elevado valor genético, ya que podemos obtener ovocitos en novillas de más de seis meses de edad y en vacas durante el primer trimestre de gestación y a partir de las 2-3 semanas del posparto. Esta técnica no interfiere con los ciclos productivos o reproductivos de la hembra donante y, además, evita la necesidad de utilizar gonadotropinas. bajo coste, lo que facilita la transferencia de embriones de razas cárnicas en vacas de aptitud láctea no destinadas a la recría o utilizarlos para tratar la infertilidad derivada funcionales del tracto genital. mientos de selección, mediante la aplicación de técnicas de diagnóstico preimplantacional para identificar variantes alélicas de algunos genes de interés productivo. sexado. Sin embargo, esta técnica es todavía poco eficiente, lo que dificulta su aplicación a gran escala. Los principales inconvenientes son: 1. Sólo un limitado porcentaje de ovocitos son capaces de transformarse en embriones transferibles, entre el 30 y el 40%. 2. Los embriones producidos in vitro son de menor calidad que los obtenidos in vivo. Lo que ocasiona bajos porcentajes de gestación (30 a 40%), y una escasa resistencia a la criopreservación. PAÍS EMBRIONES RECOLECTADOS Y TRANSFERIBLES EN LOS AÑOS 1991 Y 2004 EN 8 PAÍSES DE LA U.E. (AETE, ) Recolectados Embriones Transferibles (!) Por cada vaca Por cada vaca Alemania ,1 11,5 5,4 6,6 Bélgica ,2 6,9 4,9 4,5 España ,0 10,6 2,9 5,0 Francia ,0 9,7 4,5 5,6 Holanda ,8 Irlanda ,5 8,4 4,8 5,3 Italia ,9 13,9 5,8 6,8 República Checa ,5 10,3 4,1 5,4 Total/promedio ,0 8,9 4,7 5,6 Calidad (%) 57,5% 62,9% EUROPEAN EMBRYO TRANSFER ASSOCIATION. sivamente con la edad como consecuencia de la atresia, los ovocitos no son liberados al exterior, siendo preciso extraerlos del oviducto o de la corteza ovárica y, por otra parte, la población de ovocitos es muy heterogénea en cuanto a su calidad y grado de madurez. Por ejemplo, según datos publicados por la IETS (INTERNATIONAL EMBRYO TRANSFER SOCIETY durante el año 2003 se obtuvieron embriones bovinos a nivel mundial mediante fecundación in vitro, de los que fueron trans- de problemas de ovulación, fecundación o mortalidad embrionaria precoz. hembras de elevada calidad genética que deban ser sacrificadas por padecer enfermedades, infertilidad, por su avanzada edad o durante los programas de erradicación de enfermedades infecciosas. males con determinadas formas de infertilidad: machos con oligospermias severas, hembras con alteraciones estructurales o 3. Existe un incremento de la mortalidad embrionaria (10-12%), de los abortos, y de los problemas gestacionales como el hidroalantoides y el alargamiento de la gestación. 4. Está relacionado con el nacimiento de terneros muy voluminosos (lo que ocasiona un aumento del porcentaje de distocias), con anomalías estructurales y funcionales, conocido con el nombre de síndrome de exceso de volumen fetal, que disminuyen el vigor de los animales en el momento de su nacimiento y provocan una mayor mortalidad perinatal. 49

5 TABLA 20: Actividad de transferencia de embriones en 2007 PAIS: ESPAÑA A.E.T.E 2008 Datos recogidos por: Dr. Julio de la Fuente Número total de trabajos de transferencia de embriones aprobados en el pais. Número de equipos de suministro de datos. PRODUCCIÓN DE EMBRIONES Donaciones hechas Embriones recolectados Embriones trasnferidos Nb de óvulos donantes (OPU) Nb de OPU sesiones Nb de embriones transferidos Nb de embriones transferidos (embriones muertos) Total embriones A 467 B / A= 9.6 B 4484 C / A= 4.3 C 2014 C / B= 45.0 % 3 16 D 7 E F 7 = (D+E) Número total de embriones transferidos G 2021 = (C+F) TRANSFERENCIA DE EMBRIONES Fresco H 456 Congelado I % Congelados Fresco J 6 Congelado K % Congelados Total de embriones transferidos L 1900 H + I + J + K Número de embriones congelados guardados M 1814 % de embriones in vitro transferidos N 0.4 % (J + K) / L= % de embriones congelados transferidos O 75.7% (I + K) / L= Número de becerros nacidos por transferencia de embriones (2007) Número de becerros nacidos de embriones superovulados 690 Número de becerros nacidos de embriones in vitro. 2 Total 692 Fuente: 24th Annual Metting A.E.T.E. - PAU, Francia