8. PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD PARA Mycobacterium tuberculosis. Estudios científicos han determinado que al menos el 1 % de los bacilos tuberculosos

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1 8. PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD PARA Mycobacterium tuberculosis. Estudios científicos han determinado que al menos el 1 % de los bacilos tuberculosos de un paciente determinado son resistentes in Vitro a una droga determinada. Por lo tanto, la mayoría de los métodos para pruebas de susceptibilidad deben ser capaces de determinar la proporción de bacilos susceptibles y resistentes a una droga determinada METODO DE DETERMINACIÓN DE SUSCEPTIBILIDAD PROPORCIONAL (Medio de cultivo sólido). Cuando se utilizan métodos de dilución en agar, el inoculo debe ser ajustado de tal forma que la cantidad de mutantes espontáneos no conduzca erróneamente al laboratorista a interpretar que el cultivo es resistente. Por la misma razón, debe haber una cantidad suficiente de colonias en la placa como para determinar la incidencia de resistencia a la droga en el rango del 1 %. Esto se logra en forma óptima cuando hay 100 a 300 UFC (Unidades formadoras de colonias) en cada cuadrante de una placa de Petri de cuatro cuadrantes. Para determinar la incidencia de resistencia, generalmente es necesario inocular dos juegos de placas para la determinación de susceptibilidad, usando para el segundo juego una dilución 1:100 del inóculo utilizado para el primer juego. Este procedimiento se conoce como método de determinación de susceptibilidad proporcional. Q.B.P. Eliel Mendoza Wong 167

2 Para realizar la prueba de susceptibilidad proporcional, se deben utilizar placas de petri divididas en cuatro cuadrantes. A estas placas, se colocan cinco mililitros de medio sólido (preferentemente agar Middlebrook) en cada cuadrante, el primero sin agentes antimicrobianos para que sirva como control de desarrollo, y los otros tres con diversas concentraciones de la droga que se va a probar. Aunque antiguamente las drogas se incorporaban a medios sólidos sobre la base de huevo, en la actualidad la mayoría de los laboratorios prefiere utilizar medios basados en agar Middlebrook 7H10 o 7H11. En un medio con huevo (como el Lowenstein Jensen) puede haber pérdida de susceptibilidad adicional porque algunos agentes antituberculosos se unen a la albúmina y a otras proteínas reduciendo su efectividad. Las drogas que se van a probar se agregan después de enfriar el agar a 45 C, lo que reduce la disminución de actividad del antituberculoso que puede ocurrir durante la solidificación. Las colonias aisladas provenientes del cultivo primario, se suspenden en una solución fisiológica hasta ajustar al estándar número 1 de MacFarland (aproximadamente 1mg/mL de peso en seco de M. tuberculosis). Después de preparar el inóculo se pueden realizar diluciones de esta suspensión 1:100 y hacer varias pruebas en diferentes placas, o bien desarrollar un control de calidad adecuado. Los resultados se observan aproximadamente a 30 días después de su incubación. Q.B.P. Eliel Mendoza Wong 168

3 Fig Prueba de sensibilidad en placa Middlebrook 7H DESVENTAJAS DEL USO DE MEDIOS SÓLIDOS PARA LAS PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD l. La actividad de ciertas drogas antituberculosas está comprometida debido a la unión al agar o a los componentes proteicos del medio (el medio Middlebrook evita este fenómeno). 2. Los resultados finales cuando se utilizan medios sólidos requieren tiempos de incubación prolongados (30 días), lo que puede disminuir la potencia de ciertos antimicrobianos. 3. Si se suma el tiempo que tarda en aislar a M. tuberculosis en un cultivo primario y el tiempo que tarda en demostrarse la prueba de susceptibilidad, en total se tienen 60 días aproximadamente de incubación y de espera de resultados. 4. Por razones desconocidas, algunas especies de Mycobacterium pierden su potencia cuando se prueban en agar, al contrario de lo que ocurre cuando desarrollan en medios líquidos. Q.B.P. Eliel Mendoza Wong 169

4 8.2. PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD PARA MICOBACTERIAS DE CRECIMIENTO RÁPIDO " ETEST" (Medio sólido). Para las pruebas de susceptibilidad de las especies de crecimiento rápido es común utilizar el Etest (AB Biodisk North America Inc, Piscataway, NI ). Fig Etest El Etest es una tira impregnada en antibiótico, en la cual el antibiótico de prueba se difunde y produce un gradiente de concentración desde la punta hacia el fondo de la tira, a lo largo de la tirilla se alcanzan 15 diluciones al doble. El antibiótico que difunde produce un gradiente en el agar, y la inhibición del crecimiento es medida a tráves de CIM (concentración inhibitoria mínima), que se puede interpretar leyendo el menisco de inhibición de desarrollo con una escala impresa en la tira. Fig Los ETEST miden concentraciones mínimas inhibitorias (CIM). Este método según sus fabricantes ha demostrado una buena concordancia con los métodos de referencia en equipos automatizados. Q.B.P. Eliel Mendoza Wong 170

5 VENTAJAS Es rápido, fácil de interpretar y puede probarse cualquier antimicrobiano ya que el Etest es utilizado en bacterias pertenecientes a otras familias. Son las pruebas de susceptibilidad más utilizadas para las micobacterias de crecimiento rápido DESVENTAJAS Estas tiras desafortunadamente no son de buena utilidad para realizar pruebas de susceptibilidad en M. tuberculosis, ya que esta tarda semanas en crecer y el efecto del antituberculoso se pierde al estar expuesto semanas en la incubadora 8.3. DETERMINACIÓN DE LA SUSCEPTIBILIDAD MICOBACTERIANA UTILIZANDO EL EQUIPO BACTEC 460 " SISTEMA RADIOMÉTRICO" (Medio de cultivo líquido). Debido a la reciente aparición de cepas de M. tuberculosis resistentes a múltiples drogas, las pruebas de susceptibilidades rápidas y precisas se han transformado en una necesidad. Q.B.P. Eliel Mendoza Wong 171

6 La mayoría de los laboratorios muy especializados, utilizan pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en medios líquidos mediante el sistema radiométrico BACTEC (véase el capítulo de diagnóstico en está misma página). La base de esta prueba en medio líquido es la detección radiométrica de C14, liberado del medio líquido 7H12 (botella BACTEC 12A) que contiene ácido palmítico, por parte del metabolismo bacteriano. Fig BACTEC AFB (Sistema radiométrico). Las pruebas de susceptibilidad a partir de medios líquidos son más recomendables que las elaboradas de medios sólidos PROCEDIMIENTO. 1. Se tiene la detección confirmatoria de M. tuberculosis en una botella de BACTEC 12A, la cual haya alcanzado un índice de crecimiento de 100 y se haya comprobado la presciencia de bacilos ácido alcohol resistentes. 2. Si el desarrollo es inhibido después de 3 a 5 días de incubación, el aislamiento corresponde a M. tuberculosis o M. bovis; la falta de inhibición de crecimiento que el microorganismo es una micobacteria MOTT (micobacteria diferente a M. tuberculosis), en cuyo caso el BACTEC no puede realizar prueba de susceptibilidad. Q.B.P. Eliel Mendoza Wong 172

7 3. Cuando el índice de crecimiento (IC) llega a 500, la concentración es más que suficiente para realizar pruebas de susceptibilidad. Se inocula 1 ml del cultivo en un frasco ampolla que contenga medio BACTEC 12A más p nitroacetil amino hidroxipropiofenona (NAP). Se siembra también 1 ml del cultivo positivo en un segundo frasco ampolla de medio 12A como control de calidad. 4. Cada antituberculoso esta integrado por el fabricante en una botella BACTEC 12A (antituberculoso por botella), los antibióticos que son capaces de probarse en el BACTEC son: a. Isoniazida. b. Estreptomicina. c. Rifampicina. d. Etambutol. 5. Sembrar 0,1 ml del cultivo positivo en cada uno de los frascos ampolla provistos por el fabricante (frascos ampolla específicos para: Isoniazida, Estreptomicina, Rifampicina y Etambutol). 6. En forma simultanea, se siembra otro frasco ampolla de medio BACTEC 12A sin fármacos con 0,1 ml de una dilución 1:100 del cultivo positivo utilizado para sembrar los frascos ampolla con fármacos. Este cultivo debe ser equivalente al 1% del desarrollo en el método proporcional para la prueba de sensibilidad a fármacos (para evitar falsos positivos de resistencia por mutaciones espontáneas). Q.B.P. Eliel Mendoza Wong 173

8 7. Incubar los frascos ampolla y leer diariamente hasta que el índice de desarrollo en el frasco ampolla alcance 30. En ese momento, se registra el índice de crecimiento diario de los frascos ampolla que contienen fármacos LECTURA Si existe ausencia de IC (Índice de crecimiento) en el medio líquido que contiene fármacos, la micobacteria se considera sensible. Si el aumento del índice de desarrollo en el medio que contiene fármacos es mayor que el cambio de índice de desarrollo del control (30 IC o más), la micobacteria se considera resistente VENTAJAS. Las pruebas de susceptibilidad radiométricas para M. tuberculosis, son altamente confiables para cuatro de las drogas de primera línea: Isoniazida, estreptomicina, etambutol y rifampicina. Las lecturas pueden hacerse dentro de los 4 a 5 días (tiempo rápido de lectura en comparación de las 3 a 7 semanas necesarias en la técnica de susceptibilidad proporcional). Q.B.P. Eliel Mendoza Wong 174

9 DESVENTAJAS. No existen botellas BACTEC para pruebas de susceptibilidad para otros antituberculosos que no sean los ya antes mencionados DETERMINACIÓN DE LA SUSCEPTIBILIDAD UTILIZANDO TUBOS MGIT (sistema automatizado MGIT 960, Medio de cultivo líquido). Como se ha revisado en la sección: "diagnostico" en esta página Web, los tubos MGIT son medios líquidos para el aislamiento y crecimiento de micobacterias, el cual puede leerse manualmente o con ayuda de un sistema automatizado. El sistema MGIT, además de ser un sistema de identificación, esta diseñado para realizar pruebas de susceptibilidad, al igual que el sistema BACTEC, son manejados 5 antituberculosos a probar (4 por cada tubo), estos son: Estreptomicina, Isoniazida, Rifampicina y Etambutol PROCEDIMIENTO. 1. Después de detectar la positividad inicial (Tubo MGIT Positivo). Los tubos Positivos (alrededor de 3 o mas días), se subcultivan en un tubo MGIT nuevo y se mezcla el tubo en un vortex durante 10 segundos. Q.B.P. Eliel Mendoza Wong 175

10 2. Pipetear 1.0 ml de la suspensión de tubo MGIT en 4.0 ml de solución salina estéril.(posteriormente se utiliza esta dilución para inocular los tubos que contienen las drogas). 3. Etiquetar 4 tubos MGIT para cada tipo de antituberculoso y uno como Control de Crecimiento 4. Añadir 0.5 ml de OADC a cada tubo 5. Añadir 0.5 ml de suspensión del aislamiento a cada tubo. 6. Añadir asépticamente 0.1 ml de cada uno de los 4 antituberculoso a los 4 tubos MGIT etiquetados. * NOTA. Al tubo de Control de Crecimiento no añadir ningún antibiótico. 7. Añadir 0.5 ml de la suspensión 1:5 de la cepa aislada, a cada uno de los 5 tubos MGIT. 8. Cerrar los tubos firmemente y mezclar bien, limpiar los tubos y tapas con un desinfectante efectivo para micobacterias e Incubar a 37ºC. Q.B.P. Eliel Mendoza Wong 176

11 9. Para llevar un control estricto sobre la microbiota bacteriana contaminante; se siembra por estría 0.1 ml de la suspensión de la cepa aislada en Agar Soya Tripticaseína con Sangre de Carnero al 5% e incubar a 35 37ºC. * Si las placas de agar sangre no muestran crecimiento después de 48 horas se continua con la lectura de los tubos MGIT. * Si las placas muestran crecimiento bacteriano, se descartan los tubos MGIT y se repite la prueba empleando un cultivo puro. 10. Retirar los tubos MGIT de la incubadora al tercer día después de la inoculación. Leer los tubos diariamente después del tercer día hasta que los resultados puedan ser interpretados. 11. Con una lámpara de luz UV, compare la fluorescencia del tubo de Control de Crecimiento y los tubos de Control Positivo y Negativo. 12. Si el tubo de Control de Crecimiento se asemeja más al tubo de Control Positivo que al tubo de Control Negativo, entonces el crecimiento es positivo. Q.B.P. Eliel Mendoza Wong 177

12 LECTURA 13. Cuando el tubo MGIT es positivo, los tubos que contienen los antituberculosos deben leerse ese día y dos días más. RESISTENTE: Si el tubo con el antituberculoso es positivo y crece el MISMO DIA, 1 o 2 días después que el tubo de control de crecimiento SUSCEPTIBLE: Si el tubo con el antituberculoso es negativo y si crece 2 días después del tubo control. Fig Susceptibilidad antituberculosa efectuada en tubos MGIT. Si la micobacteria crece en el medio líquido, esta es resistente, si no crece, la micobacteria es sensible al antituberculoso. Q.B.P. Eliel Mendoza Wong 178