APLICACIONES PRÁCTICAS DE LA PCR TIEMPO REAL ANA COSMEN SANCHEZ R4 ANÁLISIS CLÍNICOS

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1 APLICACIONES PRÁCTICAS DE LA PCR TIEMPO REAL ANA COSMEN SANCHEZ R4 ANÁLISIS CLÍNICOS

2 APLICACIONES PRÁCTICAS DE PCR TR Estudio de mutaciones en la hemocromatosis Factor V Leiden y Mutación del gen de la protrombina Estudio de la mutación C677T del gen MTHFR Genotipaje del gen MTHFR para la mutación C677T en sujetos VHC Estudio de deleciones (CCR5 32)

3 QUÉ ENTENDEMOS POR HEMOCROMATOSIS HEREDITARIA? MUTACIÓN GEN INCREMENTO EN ABSORCIÓN FE DAÑO TISULAR POR SOBRECARGA

4 1.HEMOCROMATOSIS Existen dos tipos de causas: Genéticas Adquiridas

5 ENTIDADES CON SOBRECARGA DE HIERRO Hemocromatosis hereditarias Hemocromatosis hereditaria asociada a HFE o tipo I Homocigosis C282Y Heterocigosis compuesta C282Y/H63D Otras mutaciones asociadas al HFE Hemocromatosis juvenil asociada al HJV o tipo 2A Hemocromatosis juvenil asociada al HAMP o tipo 2B Hemocromatosis juvenil asociada al TfR2 o tipo 3 Hemocromatosis asociada a la ferroportina I o tipo 4 Hemocromatosis autosómica dominante Sobrecargas de hierro adquiridas Anemias con sobrecarga de hierro Talasemia mayor,anemia sideroblástica Sobrecarga dietetica de hierro Sobrecarga parenteral de hierro Hepatopatías crónicas Hepatitis C, Hepatopatía alcohólica, Misceláneas Aceruloplasminemia,sobrecarga de hierro neonatal,

6 HEMOCROMATOSIS HEREDITARIAS GEN HFE No se conoce con exactitud el mecanismo del fallo en la regulación de la absorción del hierro Suele manifestarse en la cuarta o quinta década de la vida Se transmite con carácter autosómico recesivo Responde muy bien a las flebotomías Mutación C282Y homocigota (mayor prevalencia) Mutación C282Y/H63D formas más leves

7 CÓMO SE MANIFIESTA?... ASTENIA, DEBILIDAD, PÉRDIDA DE PESO, POLIDIPSIA, DOLOR ABDOMINAL, ARTRALGIAS HEPATOMEGALIA ESPLENOMEGALIA PÉRDIDA DE VELLO CUTÁNEO ATROFIA TESTICULAR HIPERPIGMENTACIÓN CUTÁNEA

8 DIAGNÓSTICO DE HEMOCROMATOSIS TIPO I

9 DIAGNÓSTICO DE HEMOCROMATOSIS TIPO I HEMOCROMATOSIS CLÍNICA MUTACIÓN EN EL 90% CASOS

10 CASO CLÍNICO Amenorrea Alopecia Arritmias Artrosis Perfil férrico Fe: 211µg/dl Ferritina: 609 ng/ml Transferrina: 231 mg/dl Saturación transferrina: 65.2 % Perfil férrico Fe: 243 µg/dl Ferritina: 878 ng/ml Transferrina: 193 mg/dl Saturación transferrina: 90 % Perfil férrico BIOPSIA HEPÁTICA: LESIÓN TISULAR Fe: 152 µg/dl Ferritina: 231 ng/ml Ferritina: 1105 ng/ml Transferrina: 162 mg/dl Saturación transferrina: 73.8 %

11 CASO CLÍNICO MUTACIÓN C282Y:HOMOZIGOTO

12 CASO CLÍNICO MUTACIÓN H63D: NO SE DETECTÓ

13 APLICACIONES PRÁCTICAS DE PCR TR Estudio de mutaciones en la hemocromatosis Factor V Leiden y Mutación del gen de la protrombina Estudio de la mutación C677T del gen MTHFR Genotipaje del gen MTHFR para la mutación C677T en sujetos VHC Estudio de deleciones (CCR5 32)

14 2. FACTOR V LEIDEN Y PROTROMBINA VIA INTRINSECA VIA EXTRÍNSECA FACTOR X FACTOR Xa Va PROTEINA C PROTEINA S PROTROMBINA TROMBINA ANTITROMBINA III FIBRINÓGENO FIBRINA

15 FACTOR V LEIDEN Anormalidad genética causante de trombofilia más frecuente Se presenta en el 20% de los pacientes con trombosis El 80 % de individuos afectos de resistencia a la Proteina C activada son portadores de esta mutación Aumento riesgo trombótico en heterocigotos: 3 a 8 veces Aumento riesgo trombótico en homocigotos: más de 80 veces

16 MUTACIÓN N G20210A DEL GEN PROTROMBINA La presencia de esta mutación se relaciona con un aumento de la concentración plasmática de protrombina Constituye la 2ª causa genética de riesgo trombótico más frecuente Se presenta en el 6 % de los pacientes con trombosis El aumento del riesgo trombótico va a ser de 2 a 5 veces

17 INDICACIONES DEL ESTUDIO DE HIPERCOAGULABILIDAD Historia familiar de tromboembolismo venoso Trombosis idiopática recurrente Trombosis de aparición en sujetos jóvenes Asociación de trombosis arteriales y venosas Asociación de trombosis y pérdidas fetales Aparición de trombosis tras anticoncepción oral Trombosis en lugares inusuales

18 CASO CLÍNICO M.C: Mujer de 23 años que es remitida por su MAP por tratamiento con anovulatorios. A.F: Madre con TEP a los años. Se le realiza un estudio completo

19 CASO CLÍNICO Actividad Antitrombina III: 95.8% (80-120) Actividad Proteina C: 81.3% (80-120) Actividad Proteina S:64% (60-120) Estudio de mutaciones Vitamina B12: 503 pg/ml ( ) Acido fólico: 7.1 ng/ml (2.8-20) Homocisteína: 6.7 mcmol/l (4-11.2) C677T Factor V Leiden Protrombina

20 CASO CLÍNICO MUTACION FACTOR V LEIDEN Y PROTROMBINA: HETEROCIGOTO

21 CASO CLÍNICO MUTACIÓN C677T: HOMOCIGOTO

22 APLICACIONES PRÁCTICAS DE PCR RT Estudio de mutaciones en la hemocromatosis Factor V Leiden y Mutación del gen de la protrombina Estudio de la mutación C677T del gen MTHFR Genotipaje del gen MTHFR para la mutación C677T en sujetos VHC Estudio de deleciones (CCR5 32)

23 3.GEN MTHFR DIETA PROTEINAS ENDÓGENAS TETRAHIDROFOLATO METIONINA 5,10 Metilenotetrahidrofolatoreductasa 5METILTETRAHIDROFOLATO HOMOCISTEÍNA

24 3.GEN MTHFR Mutación Reducción actividad enzimática Hiperhomocisteinemia

25 3.GEN MTHFR Se han descrito más de 50 mutaciones en el gen MTHFR Al menos 10 provocan cambios en su actividad metabólica Existen 2 mutaciones que tienen una elevada presencia en la población C677T A1298C

26 3.GEN MTHFR CUÁNDO SE ESTUDIA LA MUTACIÓN N C677 T? FENOMENOS TROMBÓTICOS ESTUDIO DE LA MUTACIÓN

27 APLICACIONES PRÁCTICAS DE PCR RT Estudio de mutaciones en la hemocromatosis Factor V Leiden y Mutación del gen de la protrombina Estudio de la mutación C677T del gen MTHFR Genotipaje del gen MTHFR para la mutación C677T en sujetos VHC Estudio de deleciones (CCR5 32)

28 4.Genotipaje del gen MTHFR para la mutación C677T en sujetos VHC. Relación con evolución a fibrosis. VHC afecta >100mill. de población n mundial Causa más m s frecuente de tx.hepático tico Tras infección, n, el 50% desarrollan inf.crónica nica 20% complicaciones graves: - fibrosis - CIRROSIS ( elevada morbi-mortalidad) mortalidad)

29 4.Genotipaje del gen MTHFR para la mutación C677T en sujetos VHC. Relación con evolución a fibrosis. HIPERHOMOCISTEINEMIA ESTEATOSIS EN HEPATITIS C FIBROSIS

30 4.Genotipaje del gen MTHFR para la mutación C677T en sujetos VHC. Relación con evolución a fibrosis. QUÉ ENTENDEMOS POR ESTEATOSIS? Se define como el acúmulo de grasa en el hígado Se detecta en un 30-70% de biopsias de hígado con VHC FIBROSIS

31 4.Genotipaje del gen MTHFR para la mutación C677T en sujetos VHC. Relación con evolución a fibrosis. Factores inductores de esteatosis: a).dependientes del virus -proteínas: NS5A y core -genotipo 3: efecto esteatógeno b).dependientes del huésped -IMC -resistencia a insulina -hipertrigliceridemia -hiperhomocisteinemia

32 4.Genotipaje del gen MTHFR para la mutación C677T en sujetos VHC. Relación con evolución a fibrosis.

33 APLICACIONES PRÁCTICAS DE PCR RT Estudio de mutaciones en la hemocromatosis Factor V Leiden y Mutación del gen de la protrombina Estudio de la mutación C677T del gen MTHFR Genotipaje del gen MTHFR para la mutación C677T en sujetos VHC Estudio de deleciones (CCR5 32)

34 4.Genotipaje del gen MTHFR para la mutación C677T en sujetos VHC. Relación con evolución a fibrosis. Objetivos Estudiar la asociación n entre el mutación n del gen MTHFR e infección n crónica VHC. Evaluar si la mutación n MTHFR C677T es un factor de riesgo de progresión n a fibrosis en pacientes VHC.

35 4.Genotipaje del gen MTHFR para la mutación C677T en sujetos VHC. Relación con evolución a fibrosis. Material y métodos Genotipado MTHFR 41 controles 35 pacientes VHC EXTRACCIÓN DNA PCR TIEMPO REAL

36 4.Genotipaje del gen MTHFR para la mutación C677T en sujetos VHC. Relación con evolución a fibrosis. Material y métodos INDICE EVOLUCIÓN A FIBROSIS: INDICE METAVIR / AÑOS DE EVOLUCIÓN VHC 23 pacientes

37 4.Genotipaje del gen MTHFR para la mutación C677T en sujetos VHC. Relación con evolución a fibrosis. Resultados PREVALENCIA HETEROCIGOTOS CONTROLES 53.7% PACIENTES VHC 40% HOMOCIGOTOS 9.7% 22.9% TODOS LOS SUJETOS VHC SIN MUTACIÓN TENÍAN UN IEF<0.1, MIENTRAS Q EN EL 33% D HETEROCIGOTOS Y 40% D HOMOCIGOTOS FUE SUPERIOR

38 4.Genotipaje del gen MTHFR para la mutación C677T en sujetos VHC. Relación con evolución a fibrosis. GENOTIPOS MUTACIÓN C677T MEDIAS DE IEF DESVIACIÓN TÍPICA N SIN MUTACIÓN HETEROCIGOTOS HOMOCIGOTOS

39 4.Genotipaje del gen MTHFR para la mutación C677T en sujetos VHC. Relación con evolución a fibrosis. Conclusiones Mutación n C677T en estado homocigoto entre los VHC estudiados puede ser o ir asociado a algún n factor de riesgo para la persistencia del virus. El índice de evolución n a fibrosis se relaciona con la mutación n y muestra tendencia lineal con la frecuencia alélica lica de la mutación.

40 APLICACIONES PRÁCTICAS DE PCR RT Estudio de mutaciones en la hemocromatosis Factor V Leiden y Mutación del gen de la protrombina Estudio de la mutación C677T del gen MTHFR Genotipaje del gen MTHFR para la mutación C677T en sujetos VHC Estudio de deleciones (CCR5 32)

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42 5. GENOTIPAJE DE LA DELECIÓN CCR5 32 DEL CO-RECEPTOR CCR5 DEL VIH POR PCR QUÉ SON LOS RECEPTORES DE CITOKINAS? Son proteínas de superficie que unen pequeños péptidos y que algunos de ellos tienen un papel relevante en la susceptibilidad o patogénesis de la enfermedad infecciosa VIH 1 Y VIH 2

43 5. GENOTIPAJE DE LA DELECIÓN CCR5 32 DEL CO-RECEPTOR CCR5 DEL VIH POR PCR La deleción de 32pb del gen CCR5 va a dar lugar a una proteína no funcional cuyo resultado va a ser que no se va a expresar en la membrana celular Diversos estudios confirman el papel protector de la deleción en el receptor CCR5 contra el VIH. Homozigotos: Resistencia a la infección Heterozigotos: Retraso en la progresión de la enfermedad

44 5. GENOTIPAJE DE LA DELECIÓN CCR5 32 DEL CO-RECEPTOR CCR5 DEL VIH POR PCR Objetivos Diseñar una técnica de PCR para detectar la deleción 32 del gen CCR5 Relacionar los niveles de expresion de este coreceptor en la superficie de la membrana de linfocitos, con la presencia o no de la deleción

45 5. GENOTIPAJE DE LA DELECIÓN CCR5 32 DEL CO-RECEPTOR CCR5 DEL VIH POR PCR Material y métodos Se obtuvieron linfocitos de 42 sujetos a los que se les realizó:

46 5. GENOTIPAJE DE LA DELECIÓN CCR5 32 DEL CO-RECEPTOR CCR5 DEL VIH POR PCR PRIMERS EXTRACCIÓN DEL DNA Deleción 32pb CCGGTTAATTCCG 5 3 CCGG CCG 3 5 ALELO NORMAL SONDA FAM SONDA VIC

47 5. GENOTIPAJE DE LA DELECIÓN CCR5 32 DEL CO-RECEPTOR CCR5 DEL VIH POR PCR Resultados 42 sujetos analizados 6 heterozigotos 1 homozigoto

48 5. GENOTIPAJE DE LA DELECIÓN CCR5 32 DEL CO-RECEPTOR CCR5 DEL VIH POR PCR

49 5. GENOTIPAJE DE LA DELECIÓN CCR5 32 DEL CO-RECEPTOR CCR5 DEL VIH POR PCR

50 5. GENOTIPAJE DE LA DELECIÓN CCR5 32 DEL CO-RECEPTOR CCR5 DEL VIH POR PCR

51 5. GENOTIPAJE DE LA DELECIÓN CCR5 32 DEL CO-RECEPTOR CCR5 DEL VIH POR PCR Resultados No existió marcaje de superficie del antigeno CCR5 en los linfocitos del sujeto homocigoto En los heterocigotos los porcentajes de células con marcaje para CCR5 fueron aproximadamente la mitad que sin la deleción

52 Conclusiones El genotipaje del gen CCR5 para la deleción CCR5 32 por PCR Tiempo Real es un análisis rápido y correlaciona con los porcentajes de las células que expresan la proteína en la membrana celular Se considera una valiosa herramienta para optimizar un posible tratamiento con Ac anti-ccr5 en pacientes infectados por VIH