Resistències emergents en malalties infeccioses : HIV

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1 Resistències emergents en malalties infeccioses : HIV Bacelona, 15 de Gener del 201 José Luis Blanco Hospital Clinic. Barcelona

2 Agenda Conceptos generales de resistencia Situación de las resistencias primarias Indicaciones de un test de resistencias Paciente sin tratamiento previo Paciente en fracaso

3 Resistance: General concept Overall of mechanism that a microorganism can develop to evade the action of the drug. Changes in targets not compromising target function but impeding drug linking

4 Key of Adaptation Genetic Evolution Mutation rate (1 mutation/genome/cycle) Recombination (9 events/cycle) HIGH VARIABILITY Generation rate (~ virus/day) Hypermutagenesis (APOBEC3G)

5 Factores relacionados con el virus RESISTENCIAS Naturales Transmitidas Factores relacionados con el huesped y el tratamiento. Problemas de adherencia Farmacocinética/fármacodinámica Falta de potencia Otros??? RESISENCIAS PRIMARIAS Replicación Viral Persistente (en presencia del fármaco) RESISTENCIAS SEUNDARIAS Desarrollo de Resistencias Farmacológicas Fracaso Terapéutico

6

7 Métodos Fenotípicos. VIRCO PATIENT PLASMA (³ 200 µl) extraction RT PCR total RNA cdna PR/RT GENES D viral genotypes Deletion of protease (PR)- reverse transcriptase (RT) gene Viral PR/RT gene isolation Gene transfer/ electroporation HIV genome of lab. virus HIV genome minus PR/RT gene linearized genome CD4+ T- cells (MT4) Intracellular, homologous recombination ANTIVIROGRAM Susceptibility Assay Virus titration Infectious HIV D viral genotypes

8 Métodos Genotípicos. Secuenciación plasma Aislamiento ac.nucleicos RNA RT-PCR cdna TAATTAGCATCCTGA AAATTTCACGGACAA TGCTAAAACTATAATA GTACAGCTGAAGGA GGCTGTAGAAATTAA TTGTACAAGACCCAA CAACAATACAAGAAA AAGTATACACCTAGG ACCAGGGAGATCATT TTATGCAACAGGAGA CATAATAGGGGATATA AGACAAGCACATTGT AACATCAGTAGAGCA ACATGGAAAAACACT CTAGAACAGATAGTT AAAAAATTGAAAGAT CAATTTAAGAATAAA ACAATAGTCTTTAAC AATCCTCAGGAGGG GACCTAGAA Amplicones de DNA secuenciados STOP STOP STOP STOP electroforesis

9 Nomenclatura de las Mutaciones Codon #184 AAT - CTG. AAC - AUG aa 1 aa 2 aa 183 aa 184 Si suponemos que la base A muta a G: AAT- CTG. AAC - GUA aa 1 aa 2 aa 183 aa 184 Nomenclatura Mutación: M184V AUG = Metionina (M) GUA = Valina (V) Code A C D E F G H I K L Code M N P Q R S T V W Y Amino acids alanine cysteine aspartate glutamate phenyalanine glycine histidine isoleucine lysine leucine Amino acids methionine asparagine proline glutamine arginine serine threonine valine trytophan tyrosine

10 Nº Identificación Muestra: 4002 Fecha: 1/11/2000 CV: 8000 cp/ml Hospital: HCP Médico Solicitante: Dr Blanco Sistema de Genotipado: PE Biosystems Cepa de Referencia: pnl-4 Fecha del Informe: 12/11/00 Mutaciones para los Inhibidores Nucleósidos de la Retrotranscriptasa: M184V R211K Zidovudina No evidencia de Resistencia Didanosina Resistencia parcial Zalcitabina RESULTADOS NO Resistencia SUPERIORES parcial A METODOS Lamivudina GENOTIPICOS Resistencia Estavudina Abacavir Adefovir No evidencia de Resistencia Resistencia parcial No evidencia de Resistencia Mutaciones para los Inhibidores No Nucleósidos de la Retrotranscriptasa: K103N Nevirapina Delavirdina Efavirenz FENOTIPO frente a GENOTIPO CARO (más de 1000 $) COMPLEJO (tiempo de elaboración 2-4 semanas) POCOS LABORATORIOS (Virco, Virologic, VIRalliance) IMPORTANTE EN FARMACOS NUEVOS AYUDA EN SECUENCIAS COMPLEJAS Resistencia Resistencia Resistencia

11 Agenda Conceptos generales de resistencia Situación de las resistencias primarias Indicaciones de un test de resistencias Paciente sin tratamiento previo Paciente tras un primer fracaso Paciente de rescate avanzado

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15 Agenda Conceptos generales de resistencia Técnicas de detección de resistencia Indicaciones de un test de resistencias Paciente naive Paciente en fracaso

16 Indicaciones del test de resistencias IAS-USA [1] DHHS [2] European [3] Primary/acute Recommend Recommend Recommend Postexposure prophylaxis Chronic, Rx naive Recommend Recommend* Recommend Strongly consider* Failure Recommend Recommend Recommend Pregnancy Recommend Recommend Recommend Pediatric Recommend Recommend Recommend *If prevalence of drug resistance in untreated patients 5% (European: 10%); should be considered if the prevalence is unknown or if exposure to someone receiving antiretroviral drugs is likely. Resistance testing should also be considered if the HIV VL suppression achieved with a new antiretroviral regimen is not optimal. 1. Hammer SM, et al. JAMA. 2006;296: DHHS guidelines, May Available at: 3. Vandamme AM, et al. Antivir Ther. 2004;9:

17 Paciente sin tratamiento previo PLJ. Varón 35 años. HMX Disgnóstico en 2005 a raíz de analítica por diagnóstico de secundarismo luético Ultima serología 2 años antes negativa Analítica: CV copias/ml; CD4: 650 cel/mm 3 No comorbilidades

18 Resistencias en el pacientes naïve: cuando hacerlas 2002 Nuevo Dx 2005 CD4: Sigue naive 2008 CD4: 340

19 The New York City Department of Health Report of a Super Strain of HIV

20 Rescate tras fracaso: no sólo resistencias ANITI ANNITI IPs AZT ddi ddc d4t FTC 3TC ABC TDF NVP EFV SQV/r LOP/r FosAPV/r ATV/r NFV Mal adherente Fracasos a AZT,d4T,3TC,ddI NEV,IDV/r, 5 logs copies/ml 220 CD4+/mm /- RT: 41L,44D,210W,215Y,118I, 190A, 103R PR: 10V,46I, 63P,7IV,84V,90M

21 Carga viral Cuál es el mejor momento del cambio? Primer tratamiento gundo tratamiento Acúmulo de mutaciones Intermedio Tardío Temprano Tiempo

22 Standard Sanger Sequencing Detects the Most Common Circulating HIV-1 Variants

23 TOOLS TO STUDY MINORITY VARIANTS Concept Standard Cloning Analysis of single CFUs with indiviual clones Allele-specific PCR Differential amplification of mutants vs WT in real-time PCR Parallel Allele- Specific Sequencing (PASS) Single-base allele sequencing of polonies fixed to an acrylamide surface Single Genome sequencing Massive sequencing of single genome molecules Ultra deep sequencing (454 life sciences/roche) Massively parallel microfluidic solidsurface sequencing of single molecules (10 5 reads) Sensitivity > 10% % 0.1% 2% 0.5 1% # mutations Linked mutations Labor Intensity multiple 1 1 per round (up to 22 rounds) Multiple within 300 bp Yes No Yes Yes Yes Cost Best Experience, PPV S, PPV, NPV, Affordable Worst S, NPV Only 1 mutant, Sp, effect of polymorphisms, S, linkage of muts Linkage Linkage, Accuracy, S, NPV, Labor intensity, Rapidity of results Cost, Labor intensity Cost, time and labor consuming Short sequence, background noise, Sp

24 Riesgo de Fracaso virológico en función de la presencia de resistencias primarias en bulk Descamps D. HIV Clin Trial 2009; 10(6):

25 FV???

26 Conclusiones El VIH tiene una capacidad extraordinaria de generar resistencias al TARV La prevalencia de resistencias primaria varia entre países y está estable en España en torno al 10% La determinación de resistencias tras el fracaso virológico es importante a la hora de diseñar el tratamiento de rescate La importancia de la determinación de resistencias en poblaciones minoritarias está aún por definir

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