Héctor Rocha L. Principios de Medicina Molecular

Transcripción

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3 GENES 1 1) HERRAMIENTAS DE LA BIOLOGÍA CELULAR 800 a) EMPLEO DE ALGUNAS ENZIMAS 802 b) AMPLIFICACIÓN POR CLONACIÓN 803 c) BIBLIOTECAS DE GENES 806 d) ANÁLISIS DE LOS PRODUCTOS CLONADOS 806 e) AMPLIFICACIÓN POR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) 808 f) SECUENCIACIÓN DEL DNA 813 2) MARCADORES MOLECULARES QUE NO SON GENES 814 a) RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) o Polimorfismo en el Largo del Fragmento de Restricción 815 b) VNTR (Variable Number Tandem Repeats) o Reticiones en Tandem (una tras otra) de Número Variable 816 c) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) o DNA Polimórfico Amplificado al Azar 818 d) AFLP ( Amplified Fragment Length Polymorphism ) Polimorfismo en el Largo del Fragmento Amplificado 818 e) STS (Sequence Tagged Site) o Sitio Marcado por la Secuencia 819 f) EST por Expresed Sequence Tag o Expresión de la secuencia marcadora 819 g) MARCADORES MICROSATÉLITES

4 GENES 2 3) APLICACIONES EN LA MEDICINA MOLECULAR 823 a) MUTACIONES 825 b) CARIOTIPO 828 c) EL PROYECTO GENOMA HUMANO 829 d) MAPEO DE LOS GENES 829 e) MAPEO LIGADO A MARCADORES 830 f) EMPLEO DE RFLP POR RESTRICTION FRAGMENT POLYMORPHISM O POLIMORFISMO EN EL LARGO DE LOS FRAGMENTOS 831 g) MAPEO DE UN GEN 833 h) EMPLEO DE VNTRS POR VARIABLE NUMBER TANDEM REPEATS O REPETICIONES EN TANDEM DE NUMERO VARIABLE 834 i) MAPAS FISICOS O MAPAS DE ADN 837 j) MAPA CITOGENETICO 837 k) LA HIBRIDACIÓN IN SITU 838 l) FISH POR FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION 839 m) MAPEO TOP-DOWN 840 n) MAPEO BOTTOM-UP 841 4) GLOSARIO

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6 1) HERRAMIENTAS DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR La Medicina Molecular se caracteriza por estudiar las enfermedades y su curación a nivel molecular. Para ello emplea las herramientas de la Biología Molecular y la Bioquímica aplicadas tanto en el estudio de las Proteínas como de los Ácidos Nucleicos. Entre estas herramientas podemos empezar por aquellas enzimas denominadas Endonucleasas de Restricción. Estas enzimas son originalmente empleadas por las bacterias para defenderse de las infecciones causadas por Fagos, es decir las bacterias restringen a los Fagos. Eco R1 5 G A A T T C 3 3 C T T A A G 5 Hae III 5 G G C C 3 3 C C G G 5 Hind III 5 A A G C T T 3 3 T T C G A A 5 Bam H1 5 G G A T C C 3 3 C C T A G G 5 : Sitios de corte Fig Secuencias de corte reconocidas por distintas Endonucleasas de Restricción. Así, cuando aparecen secuencias de DNA que el fago ha introducido en la bacteria, se produce el corte de estas mientras que las secuencias similares, propias de la bacteria se metilan para no ser reconocidas por la misma enzima. A su vez los sitios de corte, se caracterizan por estar flanqueados por secuencias cortas de simetría bicatenaria. Una vez ocurrido el corte, ambos extremos pueden formar lados asimétricos o cohesivos. Sin embargo, otras enzimas de restricción cortan en el mismo sector en ambas hebras quedando ambos lados romos. 800

7 Las Endonucleasas de Restricción son más de 400 y reconocen y cortan cerca de 100 sitios diferentes. Algunos de estos sitios, se encuentran frecuentemente o cada unos cuantos cientos de pares de bases, mientras que otros se hallan esporádicamente, cada pb Vector cortado por Hind III Fragmento cortado por Hind III DNA del Vector Unión entre DNA del vector y fragmento Empleando la enzima Ligasa Molécula de DNA Recombinante Recombinante introducido a la bacteria DNA Recombinante Cromosoma Bacteriano Fig Concepto de DNA recombinante destinado a ser amplificado por clonación. 801

8 En promedio las enzimas de restricción cortan en sitios reconocidos que tienen 4, 6 y 8 pares de bases (fig. 1 16), produciendo segmentos sucesivos de 256, 4000 y bases de largo en el genoma humano. Las endonucleasas de restricción hicieron posible la tecnología del DNA recombinante (fig. 2 16), ya que con estas enzimas se pueden cortar segmentos de DNA que tengan distintos orígenes y posteriormente juntarlos y proceder a ligarlos, empleando una enzima denominada Ligasa, que produce la unión 3, 5 Fosfato o en otras palabras, forma el Fosfodiester. Posteriormente, bajo las condiciones adecuadas (alta concentración de CaCl 2, etc) las moléculas de DNA recombinante pueden entrar a las bacterias y replicarse, autónomamente o bien pueden integrarse al cromosoma celular. Volver al inicio a) EMPLEO DE ALGUNAS ENZIMAS Algunas enzimas de E.Coli se emplean para el manejo de los fragmentos de DNA con que se trabaja en la Medicina-Molecular. Así tenemos que el DNA puede ser sometido a varios tratamientos, se puede marcar con grupos Fosfatos como P 32 (así se lo ubica en una radioautografía), se puede amplificar con los cebadores adecuados (para aumentar Tabla 1-16 Enzima Actividad Uso Transcriptasa Inversa DNA polimerasa RNA dependiente de origen viral Se emplea para convertir RNAm en su copia complementaria de DNAc DNA Ligasa Une covalentemente la unión Fosfodiester 5 Fosfato al grupo 3 Hidroxilo Fosfatasa Alcalina Elimina fosfatos del extremo 5 del DNA Polinucleótido kinasa Introduce el γ Fosfato de ATP en el extremo 5 del DNA Tac (Thermophylus DNA polimerasa termoestable Acuaticus) DNA que resiste los cambios de polimerasa temperatura para abrir (desaparear ambas hebras) y cerrar (aparear hebras complementarias) el DNA Endonucleasas de Restricción Reconocen sitios de simetría bicatenaria de 4, 6 y 8 pbs cortan dejando lados cohesivos y romos continuo Se emplea en los procedimientos donde se requiere DNA recombinante Se emplea para reemplazar el fosfato 5 por otro radiactivo Técnica PCR (Polymerase Chain Reaction) Amplifica ambas hebras de un segmento de DNA, a partir de unos cebadores sintéticos (de secuencia conocida) que se aparean con su parte complementaria. Al repetir el proceso en ciclos de frío (apareamiento) y calor (desapareamiento) de las hebras DNA recombinante, mapeo, etc. 802

9 su número de copias), transcribir desde RNA a DNA (se emplea una Transcriptasa Inversa de un retrovirus) o se puede cortar en lugares específicos (con Endonucleasas de Restricción). Algunas de estas enzimas se observan en la Tabla b) AMPLIFICACION POR CLONACION Volver al inicio Uno de los vectores (fig. 3 16), que se emplea para introducir DNA exógeno o foráneo a la bacteria es el Plásmido, mientras que el DNA foráneo puede ser DNAc (Ver Glosario al final), obtenido de un RNAm (por Transcriptasa Inversa) o DNA genómico (fragmentos de DNA al azar de un organismo). Es posible aquí sintetizar una segunda hebra al DNAc con una DNA pol I y luego se pueden insertar ambas hebras en un Plásmido o un vector Lambda, para ser posteriormente amplificado por clonación. La clonación se lleva a cabo en vectores contenidos en levaduras, bacterias y partículas virales. El empleo de uno u otro dependerá del tamaño del fragmento a clonar. El Plásmido (fig. 3 16), es normalmente conocido por ser un DNA doble hebra circular extracromosómico y autoreplicante de la bacteria, es distinto al genoma normal y no es esencial para la sobrevivencia de la célula. Son conocidos por conferir ventajas selectivas a la bacteria (resistencia a antibióticos). Ori C Vector pbr322 Resistencia a la Ampicilina PLASMIDO Resistencia a la Tetrac iclina Fig Características del vector pbr322 Los Plásmidos pueden ser transferidos de célula en célula y algunos de ellos se pueden integrar al genoma de la bacteria. Una célula huésped puede tener muchas copias de un plásmido. En la actualidad existe una serie de plásmidos artificialmente construidos, que cuentan con sitios específicos para cargar DNA foráneo y se pueden seleccionar al entregar a la bacteria resistencia a algún antibiótico. Esto permite separar aquellas bacterias que han adquirido el Plásmido de las otras que no. Algunos de estos plásmidos, pueden también ser replicados en levaduras. Otros Plásmidos constituyen lanzaderas que son capaces de replicar tanto en E. Coli como en levaduras y son conocidos por las siglas YIP o Yeast Integrating Plasmid, YRP por Yeast Replicating Plasmid, YEP por Yeast Expression Plasmid y aún por el nombre 803

10 de YCP por Yeast Centromer Plasmid. El uso de cualquiera de ellos depende del tamaño del segmento de DNA que se quiera amplificar. Mediante los plásmidos se puede crear una biblioteca genómica o colección no ordenada de clonos formada por fragmentos superpuestos de DNA amplificado, perteneciente a un organismo cualquiera. La relación de unos con otros de los fragmentos se puede establecer posteriormente por mapeo físico, hasta poner orden en la biblioteca, es decir tener una colección de fragmentos amplificados, pero contiguos. Esto significa que donde termina la secuencia de uno empieza la del otro. Esta colección debe corresponder en total, a un sector específico de un gen. Los clonos individuales (fragmentos amplificados) se colocan en placas de microtitulación en dos dimensiones con múltiples pocillos en el plano, donde la ubicación de cada uno es conocida por el número de la fila y columna, fig Otro vector a emplear, puede ser una partícula viral o un bacteriófago como el fago Lambda que contiene 40kb de DNA doble hebra (fig. 4 16). A este se puede integrar DNA humano de un tamaño que bordea las 15 a 25kb. Esto se logra por acción de la misma endonucleasa de restricción y posterior unión mediante la enzima Ligasa. Posteriormente al infectar una bacteria y entrar en la etapa lítica se generan nuevas copias del fago que se amplificará junto con el DNA humano, produciendo tantas copias como partículas virales existan. Otro bacteriófago, es el conocido como P1, que puede acomodar más DNA que el Lambda y constituye el tipo P1- PAC por P1- Plasmid Artificial Chromosome o cromosoma artificial de plásmido. Forma lineal Bacteriópfasgo Lambda Cos: Lados Cohesivos Cos: Lados Cohesivos. La hebra es complementaria al otro extremo RS: Lísis del huesped OP: Sints. DNA Secuencia de cabeza y cola Región b2. Genes No esencial Rec. para Implica sobreviven dos en cia recombi nación Secuencia de cabeza y cola Forma circular del Bacteriófago Lambda Genes de Regulación RS OP Lados Cohesivos RS OP Genes de Regulación son genes que inician y terminan el proceso Fig Caracteríosticas del fago Lambda. Región b2 no esencial para la sobrevivencia Genes Rec. Implicados en Recombinación 804

11 Un vector aún, de mayor capacidad que los anteriores se denomina Cósmido, y se encuentra construido artificialmente de forma quimérica o mixta con genes del plásmido, para resistencia a antibióticos y otros del Fago Lambda como transportador. Contiene el gen cos (Cohesivo) del fago, cuya actividad promueve el empaquetamiento del DNA foráneo en la partícula viral para posteriormente infectar una bacteria tipo E. Coli, lo que permite la replicación del DNA foráneo con fragmentos de 30 Kb a 45 Kb de largo. Continuando con la descripción de los vectores, tenemos a los YAC, por Yeast Artificial Chromosome (fig. 5 16) o cromosoma artificial de levadura. Contiene todos los elementos que un DNA necesita para funcionar como cromosoma en el organismo huésped y se puede cargar con uno de los mayores fragmentos de 400 Kb a 500 Kb. Se encuentra construido con un fragmento telomérico, que entrega los extremos necesarios para la replicación, más fragmentos centroméricos y las secuencias correspondientes, que indican y promueven el sitio de origen de la replicación que es necesario en la levadura (YCP + Telómeros). También contienen genes que se emplean en la selección de las levaduras que sí han tomado el vector. A fin de propagar estos vectores en E. Coli antes de cargarlos con DNA, se les ha incorporado un sitio denominado Ori C o de inicio u origen de la replicación bacteriana y un gen que les entrega resistencia a la Ampicilina. Este último se emplea para seleccionar las bacterias que han tomado el YAC. SECUENCIA DE REPLICACION AUTÓNOMA Sitio Ori de plasmido y gen Amp CENTROMERO Eco R1 Marcador de Selección Telomerasa Telomerasa Bam H1 Fig Características del YAC. Bam H1 En general una vez que se tiene el DNA humano integrado, mediante el empleo de las Endonucleasas de Restricción y Ligasas en un vector, se procede a amplificarlo mediante la Clonación, proceso por el cual se producen múltiples copias exactas de un solo gen u otro segmento del DNA para así obtener suficiente material de estudio. El resultado de esta amplificación en distintos segmentos de DNA genera una biblioteca de clonos o colección de clonos hechos de una serie de fragmentos de DNA que se superponen representando el genoma entero del organismo. 805

12 Otro tipo de clonación ocurre cuando se divide una célula haciendo múltiples copias de sí misma y este es el caso de la conocida oveja Dolly. En este caso se recurrió a la clonación produciendo animales genéticamente idénticos a la oveja donadora de los núcleos de células mamarias, los que fueron posteriormente implantados en oocitos fecundados. Volver al inicio c) BIBLIOTECAS DE GENES. El objetivo de la clonación, fuera de amplificar copias del DNA sirve para aislar genes, expresar genes y generar clonos que se emplean como sondas para el análisis genómico. Por lo tanto, para reponer los clonos se debe echar mano a la biblioteca. Durante el procedimiento de aislar genes se debe seleccionar un clono de los muchos presentes en una biblioteca, empleando para ello una sonda formada por un polinucleótido de DNA o bien un anticuerpo. Una vez que se ha aislado un gen se debe estudiar su expresión mediante un vector de expresión, que consiste en la acción de un promotor específico para este gen y sus condiciones de cultivo en alguna célula huésped. Cuando se emplean clonos como sondas para el análisis genómico es posible determinar el número de copias de un gen en el genoma, sus relaciones taxonómicas y la construcción de mapas por ligación de caracteres. Biblioteca Genómica: Se produce cuando todo el DNA genómico se digiere y los fragmentos sé clonan dentro de un vector apropiado. De esta manera es posible disponer de muestras de todo el genoma del organismo representando a las secuencias que codifican y no codifican. En el caso de que se busque un gen se empleará un vector de inserción que permite amplificar un gran segmento (YAC). En otro caso cuando se necesita una fuente de sondas para mapeo por ligación se necesitaran inserciones menores en vectores (plásmidos). Idealmente una biblioteca de este tipo debe disponer de muchas copias de cada gen. Biblioteca DNAc: Esta biblioteca se genera a partir de RNAm y Transcriptasa Inversa, de tal manera que solo se representarán los genes que solo se expresan y no aquellos que permanecen silenciosos o aquellos segmentos que separan los genes y constituyen la mayor cantidad de DNA. Por lo tanto el número de genes de que se disponga dependerá del tejido que se esté considerando y el estado de desarrollo en que este se encuentre. Volver al inicio d) ANÁLISIS DE LOS PRODUCTOS CLONADOS. Un gen puede ser identificado mediante el empleo del DNAc (DNA complementario, sin intrones) obtenido desde su propio RNAm. De esta forma se pueden identificar los segmentos de DNA que portan sus características e incluso a cual de todos los cromosomas corresponde. Con este fin se emplea la técnica denominada Southern 806

13 Blotting y Northern Blotting. La primera de ellas consiste en separar los fragmentos de distinto tamaño producto de una digestión con Endonucleasas de Restricción en un gel de Agarosa (fig. 6 16). Luego se trata el gel con NaOH para denaturar el DNA (separar ambas hebras), se neutraliza este y el DNA es transferido a un filtro de nitrocelulosa o a un papel filtro de nylon, mediante difusión capilar o bajo corriente eléctrica (fig. 7 16). Posteriormente, se fija el DNA al papel filtro por tratamiento con UV o baking. El mismo papel filtro se pone luego en contacto con la sonda radioactiva o fluorescente que al reconocer su secuencia complementaria hibridiza, identificando a la hebra que después de una radioautografía (si la sonda es marcada radiactivamente), mostrará las bandas correspondientes a los segmentos del gen o exones que se encuentran presentes. En el caso del Northern blotting, se separa RNA por electroforésis (fig. 6 16), el que luego es transferido al papel filtro de nitrocelulosa, para ponerlo en contacto con una sonda DNAc y proceder a visualizarlo como se describió anteriormente. Existe otro desarrollo aún, de este mismo tipo y que se denomina Western blot, en el cual se separan ahora, proteínas por electroforésis con una mezcla: detergente (Sodio Dodecil Sulfato: SDS) en un polímero de separación (Acrilamida) denominada SDS- Poliacrilamida. Las proteínas separadas por peso molecular se transfieren electroforéticamente a papeles filtros de nitrocelulosa. Luego, se detectan mediante una reacción con anticuerpos marcados con Yodo 131 o con Fluoresceína. Gel Suministro de energía a los electrodos Hendiduras donde se pone la muestra Buffer Fig Serparación de ácidos nucleicos mediante electroforésis Buffer Capas de adsorbentes de toallas de papel Gel de Agarosa Hoja de Nitrocelulosa Hoja adsorbente Fig Técnica de traspaso o Southern Blotting. Los ácidos nucleicos son arrastrados por las toallas absorbentes. Volver al inicio 807

14 e) AMPLIFICACIÓN POR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA O PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION). El análisis de los genes responsables de una enfermedad puede ser llevado a cabo en muestras extremadamente pequeñas como son los fibroblastos fetales extraídos del líquido amniótico. De esta manera se pesquisan posibles enfermedades genéticas antes del nacimiento, así mismo se puede detectar la identidad del DNA perteneciente a cualquier tejido, pelos, piel, sangre, semen dejado en la escena de algún crimen. Esta técnica es capaz de amplificar secuencias específicas de DNA, circunscrito a tan solo un determinado sector millones de veces, no se requiere de todo el genoma intacto. Incluso modificaciones a la misma técnica permiten detectar mutaciones puntuales de una sola base y niveles de expresión de los genes en muestras muy pequeñas de tejidos CEBADOR UN SOLO CICLO DE REPLICACIÓ CEBADOR DNA Pol + dnct + Mg HEBRA NUEVA HEBRA NUEVA Fig Amplificación por medio de cebadores La técnica presenta un solo inconveniente comparada con la amplificación por clonación, que siempre es necesaria en los trabajos preliminares y consiste en la síntesis in vitro de un segmento de oligonucleótidos complementario al segmento de DNA a amplificar. Este segmento constituye el cebador o extremo 3 para la enzima DNA Polimerasa, que genera las hebras complementarias (fig. 8 16). De esta manera subiendo la temperatura la doble hebra se desune, separándose. A continuación al bajar la temperatura, esta vez se aparea con los cebadores o primers, dejando estos el extremo 3 para que la DNA pol de Thermophylus Aquaticus (resistente a los cambios cíclicos de temperatura), empiece la replicación del segmento a amplificar. Posteriormente se repite el ciclo produciéndose nuevas copias cada vez que los cebadores se unen a sus respectivas secuencias complementarias. En 5 ciclos el segmento original de DNA se puede amplificar 2, 4, 16, 256, veces. 808

15 El producto amplificado se puede analizar mediante electroforésis en Agarosa, seguido de tinción con Bromuro de Etidio, que se intercala entre las bases del DNA y lo hace visible a la luz UV. Por otro lado, también se puede marcar el producto con nucleótidos radioactivos en la posición γ P 32, de esta manera el P 32 se incorpora en los productos y estos pueden ser visualizados por radioautografía después de separarse por electroforésis en Agarosa.. Variaciones de esta técnica se logran aplicándola al producto de la enzima Transcriptasa Inversa o RT-PCR, es decir a partir del RNA total producido por una célula del tejido, la enzima Transcriptasa inversa produce DNAc, el cual es un segmento continuo de solo exones. Posteriormente al agregarse los cebadores adecuados que aparean con los extremos del DNAc, es posible amplificarlo. De esta manera se puede distinguir el producto de tan solo un gen entre cientos de ellos que se encuentran expresados en un cierto tejido, en otras palabras se dice que se abre una ventana. GEN β-globina NORMAL GEN β-globina MUTADO CCTGAGGAG CCTGTGGAG GGACTCCTC GGACACCTC Amplificación por medio de cebadores CCTGAGGAG CCTGTGGAG GGACTCCTC Material amplificado, muchas copias a electroforésis GGACACCTC MIGRACION NORMAL GEN β-globina Una sola hebra MIGRACIÓN ANORMAL GEN β-globina Una sola hebra Fig Comparación entre gen normal y mutado por PCR- SSCP. La migración anormal de una sola hebra se debe a la mutación Otra variación de estas técnicas, donde se puede aplicar PCR, es posible cuando se reconocen mutaciones puntuales en genes ya descritos o caracterizados. Esta técnica se denomina PCR-SSCP por PCR - Single Strand Conformation Polymorphism o Reacción en cadena de la Polimerasa con Polimorfismo en la Conformación de una Sola Hebra (Fig. 9 16), y consiste en explotar el cambio conformacional que se produce en una sola hebra entre el segmento del DNA que posee un gen mutado comparado al segmento normal sin mutación. Para ello se amplifica una secuencia de 809

16 100 a 200 pb de un gen mutado y uno normal, empleando los cebadores que circunscriben el sector de la mutación. Posteriormente sobre el producto amplificado, se lleva a cabo la separación de ambas hebras y la electroforésis en Poliacrilamida (medio poroso de mayor resolución que la Agarosa), se discrimina aquí la forma de las GEN β -GLOBINA NORMAL GEN β -GLOBINA MUTADO Apareo correcto CCTGAGGAG T A GGACTCCTC CCTGAGGAG GGACTCCTC Oligonucleó tidos Ligasa termoestable Oligonucleótidos Ligados U nión 5, 3 CCTGT GGAG T Apareo incorrecto A GGACA CCTC CCTGT GGAG Oligonucleó - tidos No ligados GGACA CCTC N O R M AL AN EM IA F ALC IFO R M E Nuevos Oligonucleótidos No Ligados Oligonucleótidos Ligados Fig Reacción en cadena de la Ligasa. hebras observándose una diferencia en la migración de ambas, la normal y la que posee la mutación. Otra técnica más empleada para detectar mutaciones puntuales en genes ya conocidos y secuenciados en pacientes con alto riesgo de poseer un alelo mutante, se denomina Ligase Chain Reaction (LCR) por Reacción en Cadena de la Ligasa (Fig ). Consiste en emplear una Ligasa termoestable que une dos Oligonucleótidos adyacentes siempre que estos hibridicen totalmente con la hebra complementaria. Si la hebra complementaria es la original o wild type, la hibridación es de 100% y ambos oligonuclótidos son ligados por la enzima, es decir se produce la unión 3 OH con el 5 Fosfato formando el Fosfodiester. Ahora, en el gen mutante si ambos oligonucleótidos aparean con el resto de su longitud, pero no en el extremo 3 de cada Oligonucleótido donde se encuentra precisamente la mutación puntual, ya que las bases normales del oligonucleótido no corresponden a las complementarias en el DNA de cada hebra mutada. Se produce aquí una joroba que impide a la Ligasa unir los extremos de los oligonucleótidos adyacentes. Por lo tanto, solo los correctos correspondientes al wild type serán amplificados y no los que no se unieron. De esta manera examinando el número de copias de ambos genes original y mutante se conoce si el paciente lleva la enfermedad 810

17 La Transgénesis (fig ), es una técnica que consiste en introducir genes foráneos para su estudio en la línea germinal de algunos animales. Una de las primeras experiencias se llevó a cabo al introducir en ratones el gen de la hormona del crecimiento, obteniéndose individuos con doble tamaño que el normal. Enzima de restricción que corta parcialmente Fragmentos superpuestos DNA vector cortada con la misma enzima de restricción Unuión de los fragmentos usando la enzima Ligasa Fig Transgénesis. Para ello se emplean vectores preparados con genes que codifican factores de transcripción, que promuevan la expresión del gen necesario y se inyectan en el núcleo de huevos fertilizados. 811

18 datp datp datp datp dgtp dgtp dgtp dgtp dctp dctp dctp dctp dttp dttp dttp dttp ddatp ddgtp ddttp ddctp Posillos donde se separan los fragm entos replicados con las mezclas de Nucleótidos que se observan más arriba Fig Separación por electroforésis de la hebra replicada en presencia de los 4 dntps más un ddntp Los huevos a su vez, se trasplantan al útero de las hembras receptoras para el desarrollo de las crías transgénicas. El DNA de las crías se emplea luego para detectar la presencia del gen activo. Si el transgene posee herencia Mendeliana significa que se transfiere en la línea germinal. Esta técnica se emplea en plantas y animales de campo para introducir resistencia a enfermedades e infecciones, así como también para producir hormonas y proteínas humanas presentes en la leche animal. Un desarrollo de esta última técnica es la Terapia Génica practicada en humanos, sin embargo, existen barreras éticas que impiden su aplicación hasta ahora. En el futuro se pretende reemplazar de esta manera genes enfermos por los correctos. Si se introducen los genes en células somáticas y no en la línea germinal se impedirá el traspaso del gen hacia los descendientes. Se ha practicado esta técnica en la médula de los huesos, fibroblastos y hepatocitos. Los vectores que se emplean en estos casos son derivados de retrovirus, que cuentan solo con las regiones promotoras transcripcionales, como LTRs (Long Terminal Repeats) para manejar la expresión del gen de interés. Se ha logrado éxito solo en células en cultivo y aún no se ha pasado totalmente a la etapa en humanos. Volver al inicio 812

19 f) SECUENCIACIÓN DEL DNA Para establecer que dos clonos específicos son adyacentes en el genoma se deben construir bibliotecas de clonos con fragmentos que se superpongan parcialmente. Estas bibliotecas de clonos se ordenan dividiendo los incertos en pequeños fragmentos y determinando que clonos tienen secuencias comunes. Uno de los métodos tradicionales que aún perdura es el de Sanger y consiste en el empleo de un dideoxinucleótido trifosfato (ddntp) durante la replicación del DNA mediante la DNA pol I. Este nucleótido carece del grupo 3 -OH por lo que la enzima se detiene después que lo adiciona por su lado 5 al extremo 3 del Deoxiribonucleótido anterior y no puede continuar replicando en base a la hebra molde (figs. 12 y 13 16). De esta manera si se agrega un ddgtp junto a un dgtp se producirá una competencia entre ellos por ocupar un lugar en la hebra naciente. Cuando la hebra madre tiene SECUENCIA DE 3 TCGATCGATCGATCGATCGA 5 LA HEBRA MADRE: SECUENCIA DE LA HEBRA HIJA: 5 AGCTAGCTAGCTAGCTAGCT3 FRAGMENTOS EN CADA POSILLO ddatp ddgtp ddctp ddttp dda AddG AGddC AGCddT AGCTddA AGCTAddG AGCTAGddC AGCTAGCddT AGCTAGCTddA AGCTAGCTAddG AGCTAGCAGddC AGCTAGCTAGCddT AGCTAGCTAGCTddA Fig Secuencia de los fragmentos que se encuentran en cada pocillo del gel Citosina en su secuencia, la hebra hija adicionará dgtp y una fracción adicionará ddgtp para detenerse produciendo una población de fragmentos que se detienen o siguen cada vez que en la hebra madre aparece una Citosina. Por lo tanto si contamos con cuatro mezclas de los cuatro dntps, más cada uno de ellos con ddntp distinto, tendremos una población de hebras hijas o hebras nacientes que se detendrán cada vez que aparezca la base complementaria a la que tienen como ddntp. Por lo tanto se dispondrá de una población de fragmentos de distintos tamaños que se pueden separar por electroforésis ocupando cuatro pocillos, cada uno correspondiente al nucleótido que se encuentra como ddntp. 813

20 5 Marcador que flanquea el gen GEN SECUENCIADO Marcador que flanquea el gen 3 CEBADOR 5 3 CEBADOR CEBADOR CEBADOR CEBADOR Fig Técnica de Chromosome Walking Otra técnica empleada para llenar huecos durante la secuenciación es la denominada Chromosome walking (fig ) o caminar sobre el cromosoma. Mediante esta, sé hibridiza un cebador de secuencia conocida a un clono al azar de una biblioteca genética y se sintetiza la hebra complementaria, posteriormente esta se aísla y su secuencia terminal 3, se emplea como cebador para continuar replicando la hebra complementaria o continuar caminando sobre el cromosoma. Sin embargo, debido a que los cebadores deben ser sintetizados químicamente el gran número de cebadores que se necesita para avanzar presenta una desventaja. Volver al inicio. 2) MARCADORES MOLECULARES QUE NO SON GENES. Se encuentran constituidos por distintas secuencias que no son parte de los genes y entre ellas tenemos: a) sitios específicos de corte para las enzimas de restricción. b) secuencias repetidas en tandem de 8 a 16 pares de bases c) secuencias repetidas en tandem de 4 a 6 pares de bases 814

21 Todas estas secuencias se heredan según la genética Mendeliana, así tenemos que mientras más relacionadas se encuentren dos personas, compartirán un número mayor de fragmentos de igual tamaño como producto de las enzimas de restricción. Esta técnica es la más antigua y se llama RFLP por Restriction Fragment Length Polymorphism o Polimorfismo en el Largo del Fragmento de Restricción. a) RFLP ( RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM) O POLIMORFISMO DEL FRAGMENTO DE RESTRICCIÓN Esta técnica se basa en los polimorfismos que existen en la secuencia de los cromosomas, es decir, el mismo cromosoma en dos personas distintas, presenta una variación cada 200 a 500 pb en la secuencia. Esta variación crea o hace desaparecer un sitio de restricción y se alterará con ello el tamaño de los fragmentos. No requiere de secuenciación, pero sí de una biblioteca creada a partir de fragmentos de DNA clonados en un vector. Luego se emplea una sonda basada en DNA genómico o DNAc. Se debe emplear una separación electroforética en geles de Agarosa. El DNA del organismo que interesa se digiere con endonucleasa de restricción y luego es sondeado con una biblioteca de DNA clonado. Los apareamientos de la sonda con el DNA se observan por radioautografía o fluorescencia. Se puede detectar siempre el mismo sitio y sirve para mapeos. Los polimorfismos se detectan como diferencias en pesos moleculares manifestado por la migración en el gel de Agarosa de los fragmentos del DNA del huésped. SITIOS DE CORTE POR LA ENZIMA DE RESTRICCIÓN ALELO A ALELO B ALELO A ALELO B * * * SONDA MARCADA Fig Los fragmentos producidos por los sitios de corte por la enzima de restricción se visualizan mediante un Southern Blot con su respectiva sonda. Volver al inicio 815