2. Materiales y Métodos

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1 Aplicación de técnicas microscópicas y moleculares para el análisis de las comunidades microbianas de un digestor anaerobio industrial como herramientas para su gestión Humbert Salvadó 1, Francesc Prenafeta 2, Carme Arnabat 1, Belen Fernández 2, Miriam Guivernau 2, Oriol Canals 1 1) Laboratorio de Protozoologia, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona. Av. Diagonal 645, Barcelona. e mail: 2) GIRO Centro Tecnológico IRTA. Rambla de Pompeu Fabra 1, Mollet del Vallès (Barcelona) 1. Introducción La digestión anaerobia puede ser aplicada como un proceso de estabilización de los lodos primarios y secundarios que se producen en una depuradora convencional de fangos activados. Los fangos activados están constituidos por una gran variedad de microorganismos, fundamentalmente una elevada diversidad de bacterias, y en un segundo orden de importancia protistas y metazoos (Curds 1992). Mediante la digestión anaerobia, los microorganismos citados y la materia orgánica contenida en la mezcla de lodos son transformados principalmente en metano y dióxido de carbono. En este proceso intervienen diferentes grupos de microorganismos que actúan de forma sintrófica: eubacterias hidrolíticas, acidogénicas y acetogénicas, así como arqueobacterias metanogénicas. Existe mucha información sobre la estructura de la comunidad biológica en digestores anaerobios a escala piloto. Gracias a la generalización de las técnicas de biología molecular, se han ensayado varias técnicas cualitativas, como DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) o FISH (Fluorescence In Situ Hybridization), y cuantitativas, como qpcr (Real Time Quantitative Polymerase Chain Reaction), para el estudio de la dinámica de las poblaciones microbianas en relación a los diversos parámetros de operación y control (eficiencia de tratamiento, producción de biogás, etc.) empleados para describir el comportamiento a nivel macroscópico de los biorreactores. Consecuentemente, la caracterización microbiológica está cambiando la visión paradigmática del biorreactor como una caja negra y permite establecer un diagnóstico preciso de los procesos implicados a escala microbiana (Palatsi et al. 2010). Sin embargo, se ha encontrado muy poca información sobre composición de las comunidades microbianas en digestores anaerobios a escala real, sometidos a fluctuaciones derivadas de cambios de la carga orgánica o de la composición del agua residual o del fango excedente, como por ejemplo la existencia de distintas concentraciones de metales tóxicos. Entre estos cambios, también se pueden incluir los efectos de fenómenos climáticos como las lluvias torrenciales que se presentan estacionalmente en la Comunidad de Murcia. El uso de la microscopia tradicional nos aporta información tanto cualitativa como cuantitativa de una importante diversidad de componentes del fango activo que en el digestor están en

2 proceso de degradación. Entre los más estudiados se incluyen las bacterias filamentosas, por su implicación en las causas del foaming, y los protozoos, por su extendida utilización como bioindicadores. La comparación de la estructura del fango activo en pleno rendimiento y el estado del fango en el digestor puede proveer nuevas herramientas para relacionar los tiempos de retención hidráulicos, concentración de la biomasa u obtención de parámetros cinéticos de desarrollo o destrucción de las bacterias filamentosas. El análisis microscópico se ha utilizado poco como herramienta de gestión del proceso de digestión. La aplicación de nuevas técnicas microscópicas semicuantitativas, como el Live/Dead nos permite observar la abundancia de células viables y células muertas, pero mediante la cual no es posible la identificación de los microorganismos a nivel de especie, ni su discriminación en categorías taxonómicas superiores (p.e. eubacterias versus arqueobacterias). Para una caracterización más detallada de las poblaciones microbianas se pueden utilizar técnicas de FISH, aunque es precisa la realización de estudios previos de la microbiota para la obtención de sondas específicas. Esta dificultad puede ser superada con la aplicación de la DGGE, técnica que permite obtener una visión bastante precisa de las especies predominantes, así como su posterior identificación mediante la secuenciación del ADN. El objetivo del estudio es la caracterización de la estructura y dinámica de las comunidades de microorganismos que habitan los fangos de un digestor anaerobio real, mediante la adopción de una estrategia mixta que integra técnicas de microscopía y de biología molecular. En este trabajo se presentan los resultados preliminares sobre la caracterización cuantitativa de los microorganismos mediante la observación microscópica comparativa de las bacterias filamentosas, protozoos y micrometazoos, así como mediante la aplicación de la qpcr para la determinación del ratio entre arqueobacterias metanogénicas y las eubacterias totales. En base a los resultados microbiológicos, se han buscado correlaciones con los parámetros de operación de la planta, que puedan facilitar la comprensión del comportamiento del proceso. 2. Materiales y Métodos Se estableció un período de muestreo de ocho meses para considerar diferentes condiciones de carga y meteorológicas que puedan afectar al proceso. Se han recogido un total de 12 muestras de febrero a septiembre de Cada toma consta de una muestra procedente de la salida del digestor y, a partir de abril, se añade una muestra de fango activo (etapa B). Posteriormente, una alícuota homogénea de cada muestra se conservó a 20ºC para extraer el ADN a partir de técnicas de bead beating y determinar los grupos de procariotas mediante técnicas moleculares. Mediante microscopia óptica se han efectuado recuentos de protozoos ciliados, protozoos flagelados y ameboideos, metazoos y microorganismos filamentosos, huevos, quistes y estructuras claramente inidentificables. La estructura del flóculo y la identificación de los principales microorganismos filamentosos se realiza siguiendo Jenkins et al. (2004) y Eikelboom (2000). El recuento de microorganismos filamentosos se realizó mediante la técnica de Salvadó (1990). Para la determinación de protozoos se sigue Lee et al. (2000) y específicamente para los ciliados a Foissner et al. (1991, 1992, 1994 y 1995). La determinación de metazoos se suele realizar a nivel de filo, aunque por su diversidad el filo de los rotíferos tiene un mayor interés y

3 se puede identificar siguiendo Koste (1978). Se han realizado tinciones específicas para determinar los distintos taxones: Gram, Neisser, PHB y detección de oxidación de sulfuros. Estas técnicas son útiles en el fango activo sin embargo los resultados en el digestor no fueron siempre satisfactorios. A partir del muestreo del 24/marzo/11, se utilizó la técnica de Life&Dead Baclight Bacterial Viability Kit (Invitrogen) para observar la viabilidad celular del fango activo y el digestor. Para el estudio de la dinámica del digestor se analizaron mediante cuantificación por qpcr los grandes grupos de procariotas: eubacterias y arqueas. Se determinó mediante PCR cuantitativa el análisis del ratio entre arqueas metanogénicas y eubacterias totales en base al número de copias génicas del gen codificante para la subunidad α de la enzima metil coenzima M reductasa (mcra) y el del fragmento ribosomal 16S rrna, respectivamente. La metil coenzima M reductasa (MCR) es el enzima terminal que da lugar al paso final de la metanogénesis, que se emplea como marcador molecular por ser específico en las arqueas metanogénicas. Para la cuantificación del dominio Eubacteria se han empleado primers universales específicos para dicho dominio que amplifican la región v3 v5 de la región hipervariable del gen 16S rrna. El análisis se realizó a partir de 3 extractos de ADN independientes en una serie temporal de muestras de biomasa tomadas del biodigestor, representativas de las diferentes fases de operación caracterizadas en el apartado anterior. 3. Descripción de la EDAR El estudio se realizó en la EDAR de Alcantarilla, en la Comunidad de Murcia. La EDAR de Alcantarilla consta de un sistema secundario de doble etapa (A y B). El sistema A de alta carga y sin tratamiento primario es seguido de la etapa B. La etapa B consiste en un sistema avanzado de fangos activos con eliminación de nitrógeno compuesto por un tanque anóxico de desnitrificación previo al reactor aerobio. Los fangos biológicos de la etapa B junto con los fangos procedentes de la etapa A son la fuente de alimentación del digestor anaerobio de alta carga, digestor que consta de un único tanque con bombeo interno. Los datos de proceso de la EDAR Alcantarilla fueron facilitados por la empresa explotadora ACCIONA AGUA. Se analizaron los datos de concentraciones de DQO, DBO, SST, SSV, ph, N total, fosfatos y fósforo total a lo largo de la línea de agua, así como los parámetros de operación del proceso. De la línea de fangos se analizaron los caudales, el ph, la temperatura y las concentraciones de SST, SSV, ST y SV en las corrientes de entrada y salida del digestor anaerobio, así como la concentración de la alcalinidad total y de ácidos grasos volátiles en el digestor y el biogás producido (caudal y composición). En general, el proceso de depuración biológica por fangos activos del agua residual ha presentado buenos rendimientos. Durante todo el período estudiado la eliminación de la DBO5 ha sido de alrededor del 99%, así como la eliminación de la DQO ha sido del 95%. Por otra parte, la eliminación de nutrientes ha sido elevada en el caso del nitrógeno, con un rendimiento global del 87%, y moderada en el caso del fósforo con un rendimiento del 53% (Tabla 1).

4 Tabla 1. Entrada, rendimiento del reactor biológico etapa B y rendimiento global de la planta. Entrada Rendimiento reactor biológico Rendimiento global planta promedio (mg/l) std promedio (%) std promedio (%) std SST 103,6 27,9 94,5 2,6 98,0 1,2 DBO5 525,2 191,3 99,0 0,6 99,3 0,4 DQO 703,4 139,4 93,4 3,0 95,7 1,4 Nitrógeno Total 67,9 15,2 86,6 4,1 87,8 3,7 Fósforo Total 9,2 2,1 48,3 27,2 53,2 25,1 Para facilitar la evaluación de la operación del digestor en relación a los análisis microbiológicos, el período de muestreo (de febrero a septiembre de 2011) ha sido dividido en 3 intervalos: período 1 (P1) entre febrero y mayo; período 2 (P2) entre mayo y junio; período 3 (P3) entre junio y septiembre. Durante este tiempo, el caudal de fango a digestión ha oscilado entre 72 y 349 m 3 /d, siendo el caudal medio 200, 133 y 176 m 3 /d en los períodos P1, P2 y P3, respectivamente (Tabla 2). El tiempo de residencia hidráulico (TRH) del digestor fue 20, 30 y 24 días para cada período, con un valor medio entre febrero y septiembre fue 24 días. Junto con la variación del caudal de fangos, también se registró una variación en la concentración de materia orgánica de dicha corriente, lo que en conjunto hizo que la velocidad de carga orgánica (VCO) del digestor fuese 1,05 0,75 1,08 kgsv/m 3 d en los períodos P1, P2 y P3, respectivamente (Tabla 2). En la Figura 1 se muestra el seguimiento del TRH, de la VCO y del caudal de biogás producido entre febrero septiembre de Además del caudal de biogás (cuyo contenido en metano era 66% v/v), se han calculado los parámetros de control: degradación de materia orgánica y productividades específicas de gas. En la Tabla 3 se recogen estos parámetros: cabe destacar que tanto el rendimiento como la degradación en el digestor aumenta en el P2 en comparación con el P1, tras la disminución de la VCO y el aumento del TRH. Por otro lado, también se realizó el seguimiento en planta de la alcalinidad y del ratio de alcalinidades (RA). Dado que la alcalinidad intermedia y el RA (Tabla 3) indican que no hubo acumulación de compuestos intermedios (ácidos grasos volátiles) en ninguno de los períodos, el aumento del rendimiento podría relacionarse con el aumento de los microorganismos metanogénicos. Tabla 2. Parámetros de operación días m 3 /d d g/kg kgsv/m 3 d períodos intervalo Q fango TRH SV VCO P ±61 20±4 17±1,16 1,05±0,29 P ±41 30±7 19±3,21 0,75±0,23 P ±55 24±5 21±2,32 1,08±0,38 Tabla 3. Parámetros de control m 3 /d m 3 /m 3 d m 3 /m 3 d m 3 CH 4 /kgsv m 3 CH 4 /t %SV in mgcaco 3 /L g/g períodos Q biogás Pv biogás Pv CH4 Pm CH4 degradación Alc int RA P ,40 0,24 0,32 4,46 34% 58 0,06 P ,43 0,29 0,38 9,38 42% 54 0,05 P ,36 0,23 0,24 5,11 42% 49 0,05

5 3,0 2,5 VCOin vco teor Qbg P1 P2 P VCO (kgsv/m3d) 2,0 1,5 1, Qbiogas (m3/d) 0, , días 0 TRH prqin_qef TRH teórico muestras 60 P1 P2 P3 TRH (d) días Figura 1. Seguimiento de los parámetros de operación: promedios semanales de la velocidad de carga orgánica (VCO; kgsv/m 3 d), el caudal de biogás (Qbg; m 3 /d) y el tiempo de residencia hidráulico (TRH; días). 4. Resultados microbiológicos En conjunto, los resultados de la microbiota presentan una dinámica poco variable (Tabla 4): se presentan los resultados obtenidos respecto a grupos de protozoos, metazoos, bacterias filamentosas y viabilidad celular. Se constata una concentración de estructuras como los tubos cribosos o polen de pino, que se acumulan con el tiempo, en el digestor pues en el fango activo se detectan en menor abundancia o no se detectan al estar por debajo del límite de detección. Es de interés constatar que se llegan a identificar grupos de protozoos y metazoos procedentes del fango activo en estado de latencia o cadáveres: distintos grupos de rotíferos, ciliados peritricos (quistes o pedúnculos) y tecas de tecamebas de los géneros Euglypha, Arcella, Pyxidicula o Centropyxis. El conjunto de protozoos y metazoos identificados indican que el fango origen tenía un buen rendimiento y buena nitrificación. Esta apreciación se confirmó mediante la observación microscópica de los fangos activos a partir del 7/abril y con la obtención de los análisis fisicoquímicos. Los fangos activos presentaron una elevada diversidad de grupos de microfauna, entre los que destacan las tecamebas Euglypha y Centropyxis, y los ciliados Trochilia minuta y Epistylis plicatilis, indicadores de muy buenos rendimientos de eliminación de DBO y de eliminación de nitrógeno. La acumulación de estructuras, quistes y tecas en el digestor es el resultado de la concentración del fango. Al comparar las muestras tomadas en el digestor, teniendo en cuenta la edad del fango en el digestor durante el período de estudio, que fué mayor a 15 dias, con las del fango activo del muestreo anterior, se obtuvo una correlación de la abundancia de tecas de la tecameba Arcella con un resultado estadísticamente significativo y muy elevado de r= (R2=0.9243). Se obtiene que las tecamebas se concentraron 8 10 veces más en el digestor que en el fango activo. Estos resultados dan una idea de la permanencia de estas tecas en el sistema, a la vez que aportan información sobre su baja biodegradabilidad.

6 Tabla 4. Microorganismos filamentosos, microfauna restos y hallados en los fangos activos y en el digestor. Los hallados en el digestor se consideran restos, cadáveres (*) o algunos quistes de los cuales sólo un porcentaje bajo fueron viables. En el digestor sólo los flagelados diplomonadinos se hallaron vivos en un recuento. AERÓBICO DIGESTOR promedio std promedio std MICROOR. FILAMENTOSOS, m/ml Microor. Filamentosos Totales, m/ml , ,6 Microthrix parvicella , ,3 Nocardioformes ( ACNO) 4 11,0 0 0,0 Nostocoida limicola 3 2, ,7 Tipo ,2 3 9,9 Espirilos, en ind/ml ,0 0 0,0 Espiroquetas, en m/ml 15 37,8 0 0,0 PROTOZOOS FLAGELADOS, ind./ml Bodónidos ,5 0 0,0 Otros flagelados ,7 0 0,0 Peranema ,2 0 0,0 Entosiphon ,7 0 0,0 Petalomonas 4 13,3 0 0,0 Diplomonadinos (trepomonas) 0 0, ,8 PROTOZOOS RIZÓPODOS, ind./ml Gimnamebas< 20 μm ,6 289* 989,0 Gimnamebas entre 20 y 50 μm ,8 13* 46,2 Gimnamebas > 50 μm ,1 0 0,0 Tecamebas , * 24899,1 Euglypha 12 22,4 72* 108,4 Arcella ,0 2022* 1419,6 Centropyxis 62 75,8 57* 87,4 Pyxidicula , * 24062,3 PROTOZOOS CILIADOS, ind./ml Amphileptus sp 9 17,6 0 0,0 Acineria uncinata 40 72,1 0 0,0 Aspidisca cicada ,1 0 0,0 Acineta tuberosa 57 51,3 2 5,8 Calyptotrica lanuginosa 16 34,3 0 0,0 Chaetospira muelleri ,6 242* 228,7 Chilodonella uncinata ,1 0 0,0 Coleps hirtus ,0 0 0,0 Discophrya elongata 2 6,7 0 0,0 Gastronauta membranaceus ,7 0 0,0 Epistylis chrysemydis (balatonica) ,0 3 11,5 Epistylis plicatilis ,7 0 0,0 Holophrya discolor 39 58,5 0 0,0 Litonotus lamella 13 28,3 0 0,0 Metacystis sp. 7 20,0 3 11,5 Plagiocampa rouxi ,5 0 0,0 Pseudochilodonopsis fluviatilis ,8 0 0,0 Pseudovorticella 4 13,3 0 0,0 Tokophrya quadripartita 8 15,3 0 0,0 Tokophrya sp 16 27,9 0 0,0 Trochilia minuta 50 86,3 0 0,0 Uronema nigricans 4 8,8 0 0,0 Vorticella aquadulcis ,6 0 0,0 Vorticella sp ,1 0 0,0 CILIADOS TOTALES ,6 277* 280,5 DIVERSITDAD CILIADOS, bits/ind 2,28 0,54 0 0,00 METAZOOS, ind./ml Rotíferos , ,7 Lecanidae ,3 105* 133,0 Philodinidae ,5 23* 39,8 Huevos rotíferos , ,4 Nematodos 9 17,6 12* 24,8 Gastrotricos ,5 0 0,0 Otras estructuras Polen de pino 7 10, ,0 Restos vegetales (Tubos cribosos) 20 24, ,8 Otros quistes 18 53, ,6

7 Dentro del digestor, los protozoos o metazoos hallados aparecían inactivos, en forma de quiste o huevo, sin poder determinar su viabilidad. El análisis de live/dead indica que algunos quistes y huevos podrían ser viables, aunque este dato sólo puede ser verificado mediante cultivos. Los primeros resultados de cultivos muestran la viabilidad de algunos gastrotricos y algunos ciliados. Tan solo en el muestreo del 18/marzo (primera mitad del P1), se hallaron distintos grupos de protozoos del grupo de los flagelados diplomonadinos vivos y activos con movimiento en muy baja concentración, pertenecientes por lo menos a 2 especies distintas afines al género Trepomonas. Este grupo de flagelados mayoritariamente son anaeróbicos, y por consiguiente podrían formar parte del proceso de la digestión anaerobia. Las bacterias filamentosas en el digestor, y en todas la muestras hasta abril (primera mitad del P1), parecen indicar que la bacteria predominante se trata de Microthrix parvicella, bacteria normalmente Neisser positiva. En segundo lugar, se observaron grupos de Nostocoida, claramente Neisser positivo. Gracias a las muestras de fangos activos se ha confirmado la presencia y dominancia de Microthrix, así como la presencia de Nostocoida. De todos modos, Nostocoida aparece en una proporción mucho menor en el fango activo que en el digestor, de modo que este grupo parece resistir mejor en el digestor que Microthrix (inicio del P2), ya que éste aparece en el digestor muy troceado y prácticamente inviable. A partir de mayo, Microthrix va desapareciendo en el tanque aeróbico y es sucedido por el tipo 0041, aunque no se observan niveles de abundancia elevados. Respecto a los procariotas, se determinó la abundancia de células viables mediante live/dead (Figura 2), que aparecen troceadas o en largas cadenas, es decir, son inviables y por lo tanto, se encuentran en proceso de digestión. Las bacterias filamentosas sobreviven un cierto tiempo en el digestor y a medida que van muriendo las células, el filamento se va acortando. En la Figura 3 se observa una gran variación del contenido de bacterias filamentosas del digestor precedido por una reducción previa en el fango activo, aproximadamente con un importante desfase. En cuanto a la abundancia de bacterias filamentosas, se compararon las muestras del digestor con las muestras anteriores del fango activo entre mayo y julio (período P2). A partir de estos datos se realizó un análisis simple de regresión lineal con un resultado estadísticamente significativo y también muy elevado de r=0.973 (R 2 =0.945). La concentración de bacterias filamentosas fue 6 7 veces mayor en el digestor que en el fango activo, lo que supone, comparado con las tecamebas Arcella, una menor concentración durante el paso del fango al digestor. Por lo tanto, el contenido en filamentosas procede del tratamiento aeróbico y durante la digestión se van troceando paulatinamente. Si se toma como referencia la Arcella, se puede decir que permanecen en el sistema el 70% de los organismos filamentosos, filamentos que sí pueden contribuir al origen de espumas. También es importante señalar que el TRH medio no es suficiente para la degradación de las paredes celulares de dichas bacterias filamentosas. En relación con la viabilidad celular, se constata que hay una gran variación de viabilidad en procariotas, normalmente en agregados celulares, en las muestras analizadas: desde el 95% de células viables (período P2 7/abril) al 20% (período P3 21/septiembre). El cálculo de las bacterias viables se realizó a partir del porcentaje de viabilidad aplicado a los sólidos volátiles del digestor: Bacterias viables = [(viabilidad celular; %)/100) (SSV; digestor kg/m 3 )]

8 Estoss resultados están relacionados conn la actividad del digestor, ya quee se obtienee una relación positiva entre la cantidad de bacterias viables y la producción de biogás promedio de los 10 últimos días (Figura 4) ). Esta relación se puedee considerar muy elevada, pues la técnica empleada de live/ /dead es semicuantitativa. Figura 2. Epifluorescencia en los flóculos y bacterias filamentosas detectadas mediante live/dead: (izquierda) Fango activo; (derecha) Digestor r (04/05/2011). Notación: en e verde vivoss y naranja muertos Microorganismos filamentosos Organismos filamentosos m/ml Digestor, m/ml Arerobico m/ml Días Figura 3. Comparación de la dinámica de los microorganismos filamentosos durante los muestreos conjuntos. 12,0 Bacterias viables en kg ssv/ m 3 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 y = 0,0069x 2,0119 R 2 = 0,,6527 0, Biogas m 3 /dia Figura 4. Relación viabilidadd celular y producción promedio de biogás

9 En la Tabla 5 se presentan los resultados de PCR cuantitativa correspondientes al análisis del ratio entre arqueas metanogénicas y eubacterias totales. Si se comparan los resultados de los análisis microbiológicos (Tabla 5) en relación con los parámetros de operación y control de la planta, se observa que durante el período P1, en el que se mantuvo un TRH de 20 días, se observa que el ratio arqueas/eubacterias oscila entre 2,1 5,5% aunque con una tendencia a la baja al final del período (Figura 5). Este descenso se puede relacionar con el descenso del TRH y el aumento de la VCO al final del P1. Por otro lado, el incremento del ratio arqueas/eubacterias durante el P2 indicaría que las condiciones de operación en esta fase han sido, en general, más favorables para que se produzca este enriquecimiento: el aumento del TRH hasta 30 días favorece la reproducción de las poblaciones metanogénicas, y por tanto, aumenta el ratio arqueas/eubacterias. Por otro lado, es importante recalcar que el aumento relativo de la abundancia de arqueas metanogénicos observado en el P2 coincide con una mayor rendimiento en la producción de metano (Figura 5). Las últimas muestras se corresponden con el período P3, pero fueron tomadas tras una bajada abrupta de la VCO. Esta anomalía produce una caída del ratio arqueas/eubacterias, coincidiendo con una punta muy elevada en el tiempo de retención hidráulico durante el período P3. Tabla 5. Relación entre el número de copias génicas del gen mcra (arqueas metanogénicos) y el gen 16S rrna (eubacterias) en diferentes muestras de biomasa del digestor. Fecha Reactor anaerobio Períodos Ratio mcra/16s rrna (%) 24/02/2011 M896 Período P1 (6 95d) 4,60% 17/03/2011 M897 5,36% 07/04/2011 M903 2,50% 03/05/2011 M1118 2,12% 16/05/2011 M1241 4,49% 25/05/2011 M1243 Período P2 (95 156d) 1,56% 08/06/2011 M1119 3,34% 22/06/2011 M1263 4,32% 12/07/2011 M ,43% 08/09/2011 M1261 Período P3 ( d) 6,30% 22/09/2011 M1265 7,66%

10 P1 P2 P3 mes muestreos RATIO mcra/16srrna R² = 0, R² = 0, días Figgura 5. Seguim miento de las poblaciones microbianas en relación a la producciónn de metano del digesttor: (superiorr) ratio arquea as metanogénnicos/eubacte erias totales ((inferior) evollución temporal del ratio. 55. Observacciones finale es Podemos concluir que no se detecta laa presencia de protozoos y metazooos activos en el digesstor, con excepción de un muestreo donde se haallaron flagellados en bajaa abundancias. Se están n realizando estudios de e viabilidad de huevos y quistes del d digestor, observándo ose la viabillidad de algu unos. El análisis de los reestos de miccroorganismos procedenntes de los ffangos activo os nos perm mite conoce er la capaciidad de con ncentración del fango en el digesstor y relaciionar éstos con el tiemp po de reten ción celular del digestor. Se observva también que q la abundancia de las bacterias ffilamentosass procedente es del fango a activo está een relación d directa n embargo, se trocea n y se red ducen con las del diggestor, donde se conccentran. Sin sensiblemente. El análisis molecu ular de las p poblaciones microbianass del digestor, y en espeecial el ratio entre arqueeas metagén nicas y eubacterias total es, aportan información valiosa sobbre el rendim miento del d digestor, en especial de la producciión de metaano. Así mismo las técnnicas de live//dead perm miten detectar la bioma asa activa yy relacionarrla con la producción p dde biogás. En la actuaalidad, se están e completando esttos ensayos cuantitativvos conjuntaamente con n una caraccterización cu ualitativa de e la estructurra y biodiverrsidad de las poblacioness de eubacte erias y de arrqueas mediante la técnica del DGG E. Estos resu ultados futurros van a peermitir deterrminar las esspecies de bacterias y arrqueas que sson dominan ntes en cada una de las ffases del pro oceso, lo qu ue va a contribuir notablemente a la interprettación del comportamieento del diggestor. Como o se aprecia, estas meto odologías puueden ser de e gran utilidad a nivel ppráctico como una herraamienta de d diagnóstico complementaario sobre el estado de b biomasa anaeerobia.

11 Agradecimientos El estudio se ha realizado en colaboración con ACCIONA AGUA. Queremos agradecer a la Dra Rosa Araujo y Tarik Abzazou del Departamento de microbiología, Universitat de Barcelona por su contribución en la implantación de la técnica de live/dead. REFERENCES Curds, C. R Protozoa and the water industry. Cambridge University Press. Cambridge 122pp. Foissner W., Berger H., Blatterer H., & Kohmann F. ( ). Taxonomische un ökologische revision der ciliaten des saprobiensysstems. Band I, II, III, IV. Informationsberichte des Bayerischen Landesamtes für Wasserwirtschaft. Munchen, Germany. Eikelboom, D. H Process control of activated sludge plants by microscopìc investigation. IWA publishing 156pp Jenkins, D., Richard, M.G. & Daigger, G.T Manual on the causes and control of activated sludge bulking and foaming and other separation problems. IWA Publishing. 193pp. Koste W. (1978) Rotatoria. DieRädertiere Mitteleuropas. Ein Bsetimmungswerk, begründet von Max Voigt. Überordnung Nonogononta. 2 Vols. Bonrtraeger, Stuttgart. Lee J.J. Leedale G.F. & Bradbury P. Eds An illustrated guide to the protozoa, 2n Ed, Dos volumenes I: 1 689; II: Salvadó H Método rápido para el control del Bulking, técnica simple y rápida de contaje de microorganismos filamentosos. Tecnología del Agua. 67: Palatsi J., Illa J., Prenafeta Boldú F. X., Laureni M., Fernandez B., Angelidaki I., & Flotats X., (2010). Long chain fatty acids inhibition and adaptation process in anaerobic thermophilic digestion: Batch tests, microbial community structure and mathematical modelling. Bioresource Technology 101:

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