ESTUDIO 9. La leche materna es lo mejor para el bebé.

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1 ANÁLISIS DEL DESARROLLO DE LA FLORA INTESTINAL EN INFANTES ALIMENTADOS POR SENO MATERNO Y POR FÓRMULA UTILIZANDO MÉTODOS DE DETECCION E IDENTIFICACIÓN MOLECULAR Harmsen, Hermie J. M.; Wildeboer-Veloo, Alida C. M.; Raangs, Gerwin C.; Wagendorp, Arjen A.*; Klijn, Nicolette*; Bindels, Jacques G.**; Welling, Gjalt W Departamento de Microbiología Médica, Universidad de Groningen, Groningen; *NIZO Netherlands Institute for Dairy Research, Ede; e **Investigaciones Numico B. V., Wageningen, Holanda RESUMEN Contexto: Una diferencia entre los recién nacidos alimentados por seno materno y aquellos alimentados por fórmula es el desarrollo de la flora intestinal, considerada muy importante para la protección contra microorganismos dañinos y maduración del sistema inmune intestinal. En este estudio, novedosos métodos de identificación molecular fueron utilizados para identificar los datos obtenidos de los métodos tradicionales de cultivo y para validar la técnica independiente de cultivo de hibridización fluorescente in situ (FISH por sus siglas en Inglés). Métodos: Se obtuvieron muestras de heces durante los primeros 20 días de vida de uno de seis niños alimentados por seno materno y seis niños alimentados por fórmula. La composición microbiana de las muestras fue analizada mediante cultivos en medios específicos y por la prueba de FISH, utilizando sondas específicas de 16S rrna de oligonucleótidos. Las colonias que crecen en el medio fueron identificadas por un análisis aleatorio de DNA amplificado polimórfico y por amplificación de reacción en cadena de la polimerasa y análisis subsecuente del gen 16S rrna Resultados: La identificación molecular de las colonias mostró que los medios selectivos son insuficientemente selectivos y no adecuados para análisis cuantitativos. Información cualitativa de los resultados de los cultivos combinada con los datos obtenidos de la técnica FISH, reveló una colonización inicial en todos los infantes de una flora compleja (parecida a la del adulto). Tras esta colonización inicial, una selección de cepas bacterianas comenzó en todos los infantes, en la cual las cepas de Bifidobacterium juegan un rol importante. En todos los infantes alimentados por seno materno, las bifidobacterias se volvieron dominantes, mientras que en la mayoría de los infantes alimentados por fórmula se encontraron cantidades similares de Bacteroides y bifidobacterias (~40%). Los componentes menores de las muestras fecales de los infantes alimentados por seno materno fueron primordialmente lactobacilos y estreptococos; las muestras de los niños alimentados por fórmula con frecuencia contenían estafilococos, Escherichia coli, y Clostridia. Conclusiones: Este estudio confirma las diferencias en el desarrollo de la flora intestinal entre los niños alimentados por seno materno, y los niños alimentados por fórmula. Los resultados obtenidos de la técnica de FISH fueron consistentes. Aunque el repertorio de sondas para este estudio aún no estaba completo, la técnica de FISH probablemente se convierta en el método de referencia para futuros estudios diseñados a desarrollar una flora intestinal similar a la de los niños alimentados por seno materno en niños alimentados por fórmula. Palabras Clave: Lactancia materna, Desarrollo de la flora fecal, Hibridización por Fluorescencia in situ, Alimentación por Fórmula, Nutrición Infantil, Flora Intestinal, Medios Selectivos de Cultivo, 16S rrna. Una de las mayores diferencias entre los niños alimentados por seno materno y los niños alimentados por fórmula es el desarrollo de la flora intestinal (1-11). La colonización inicial del intestino aséptico del recién nacido bajo condiciones normales sucede durante el parto cuando entra en contacto con la flora de la vagina de la madre y la flora normal de los padres. Esto lleva a una inoculación con una flora diversa de bifidobacterias, enterobacterias, Bacteroides, Clostridia, y cocos Gram-positivos (1,12). Después de esta primera inoculación, la flora cambia rápidamente, presumiblemente bajo la influencia de la dieta. En los infantes alimentados por seno materno, dentro de unas cuantas semanas se establece una flora dominada por bifidobacterias, posiblemente ESTUDIO 9 La leche materna es lo mejor para el bebé.

2 causadas por agentes selectivos (factores bifidobacterianos) que están presentes en la leche humana (11). Solamente tras el destete la flora se vuelve más diversa y comienza a parecerse a la de los adultos (1). En contraste, los niños alimentados por fórmula desarrollan una flora más diversa, consistente, adicionalmente de las bifidobacterias, también de Bacteroides, enterobacteria, enterococos, y clostridia (1,7,12). Adicionalmente a la obvia influencia de la dieta temprana, otros factores pueden también influir el desarrollo de la flora, tales como la vía de parto y la higiene (2,4,13). Varios investigadores han especulado que la diferencia en la flora intestinal entre los niños alimentados por seno materno y por fórmula contribuyen a los beneficios funcionales que presenta el seno materno en comparación con la fórmula, que son, protección contra las infecciones gastrointestinales (14) y la inducción a la tolerancia oral de los alergenos dietéticos (15). Por lo tanto es obvio que uno de los objetivos para el mejoramiento de las fórmulas actuales para infantes sea lograr una flora intestinal con alimentación por fórmula que sea idéntica a la de infantes alimentados por seno materno. La dificultad de evaluar adecuadamente la flora intestinal de las muestras de heces es una de las mayores desventajas en los estudios de los efectos de la dieta temprana en el desarrollo de la flora intestinal. La mayoría de las enumeraciones de los diferentes grupos de bacterias en estos estudios se logra mediante cultivos en medios específicos. Sin embargo, esta claro que las técnicas de cultivo están entorpecidas porque ciertas especies de bacterias no pueden ser cultivadas (16) y porque la mayoría de los medios utilizados para la cuantificación de los grupos no son específicos (17). Métodos alternativos para una identificación y detección confiable de los microorganismos están basados en la detección del 16S rrna o su gen codificador (18). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y amplificación del gen 16S rrna directamente de las colonias encontradas en las placas de agar, seguidas por un análisis de secuencia, hace posible identificar estas colonias sin mayores pasos de cultivo (19). Más aún, sondas específicas basadas en los oligonucleótidos del 16S rrna han sido desarrolladas para detectar diferentes grupos de bacterias directamente en muestras fecales por medio de la hibridización in situ por inmunofluorescencia (FISH por sus siglas en Ingles), sin mayor requerimiento de cultivos (20-22). En este estudio nosotros investigamos el desarrollo de la flora fecal en seis infantes alimentados por seno materno, y seis infantes alimentados por fórmula durante los primeros 20 días de vida, utilizando estas técnicas moleculares. Aunque nuestros resultados confirman las conclusiones mas importantes de estudios previos en los cuales se utilizaron técnicas convencionales de placa, los nuevos métodos de identificación y detección moleculares proveen datos mas exactos y adicionales a la diversidad, dinámica y sucesión de las cepas bacterianas tras la colonización inicial del intestino del neonato. MATERIALES Y METODOS Grupo de Estudio y Recolección de Muestras Las madres fueron alcanzadas para participar en este estudio por U-Gene (Utrecht, Holanda). Aquellas que deseaban amamantar a sus hijos durante los primeros 20 días de vida, eran elegibles para el grupo de seno materno, y las madres que tenían la intención de alimentar a sus hijos por fórmula apenas hayan nacido, eran elegibles para el grupo de alimentación por fórmula. Para prevenir posibles variaciones en la flora intestinal del grupo alimentado por fórmula, causado por diferencias relacionadas con éstas, se incluyeron solamente a los infantes cuyas madres hubiesen decidido utilizar una fórmula infantil común a todas. El estudio incluyó a 12 niños: 6 alimentados por seno materno, y 6 alimentados por fórmula. Los niños fueron mayormente nacidos en domicilio o en clínica, lo que significa que estuvieron en el hospital durante 1 a 2 días. Se les pidió a las madres recoger material fecal el día 3 o 4, día 4 o 5, día 5 o 6, día 6 o 7, día 8 o 9, día 12 o 13, y día 20 o 21 después del nacimiento. Estas muestras fueron recolectadas y reducidas en 20 ml de 0.5% HCLcisteína (ph 7.0). Las muestras fueron almacenadas a 4º C y transportadas a NIZO Investigaciones Lácteas. Las muestras fueron procesadas dentro de 24 horas después de su recolección. Cultivo en Medios Selectivos El peso de las muestras fecales añadidas a 20 ml de HCL-cisteína fueron determinados y se realizaron series de diluciones de las muestras, bajo condiciones anaeróbicas utilizando un gabinete anaeróbico (Coy, Productos para Laboratorio, Ann Arbor, MI, U.S.A.). Las muestras fueron analizadas utilizando los medios selectivos descritos en la Tabla 1. Todas las placas fueron incubadas durante 5 días a 37º C bajo condiciones anaeróbicas, después

3 de las cuales se realizaba el conteo de las colonias. Las colonias encontradas en los diferentes medios selectivos fueron identificadas utilizando identificación por Amplificación Polimórfica de DNA (RAPD por sus siglas en Inglés) y análisis de secuencia de 16S rrna (19). Esta identificación basada en biología molecular fue escogida en vez de la caracterización bioquímica por dos razones: Primero, la identificación de la bacteria basada en características bioquímicas ha demostrado no ser completamente confiable (23); segundo, la caracterización bioquímica de más de microorganismos aislados es demasiado laboriosa para ser realizada Identificación de las Colonias De la totalidad de las muestras, 20 a 30 colonias eran elegidas aleatoriamente de todas las placas elegibles (tres a cinco aislados por placa) y analizadas por identificación RAPD. De esta manera todos los aislados eran clasificados en grupos con patrones RAPD similares. Los patrones RAPD eran generados utilizando el siguiente primer: 5`- GTCGTTATGCGGTA-3`. Los patrones RAPD fueron comparados por cada infante utilizando el Phoretix versión 3.0 (Nonlinian Dynamics, Newcastle-upon- Tyne, Reino Unido). Los aislados con los mismos patrones RAPD fueron agrupados, y uno o dos representantes de cada uno de esos grupos eran identificados por análisis de secuencia de 16S rrna. Esta identificación de las especies era lograda por amplificación y secuenciación de la primera parte del 16S rrna (19). Las secuencias eran comparadas con aquellas presentes en la base de datos del Proyecto de Base de Datos Ribosomal (RDP por sus siglas en Ingles) (24). La mayoría de los grupos RAPD fueron identificados, con más de un 99% de identidad con secuencias de especies presentes en la base de datos RDP. Algunos de ellos mostraron menos identidad (entre 95% y 99%) con secuencias conocidas. En esos casos, solo el nombre de gen de los parientes más cercanos era utilizado, seguido del sufijo sp. Análisis por Hibridización Fluorescente In Situ (FISH) Las muestras fecales de seis infantes alimentados por seno materno y seis infantes alimentados por fórmula fueron fijadas utilizando una muestra de 0.5 ml de buffer de HCL cisteína y 4.5 ml 4% de para formaldehído en salino con buffer de fosfato (PBS por sus siglas en Inglés). Estas muestras fueron almacenadas a -80º C. Antes de su análisis, las muestras fueron transferidas y concentradas en 1200 µ 50% etanol en PBS. Dependiendo de la cantidad de células en la muestra, parte del caldo de etanol/pbs (generalmente 20 µl) eran hibridizados con sondas de oligonucleótidos fluorescentes, específicas para cada grupo, apuntadas directamente al 16S rrna o teñidas con 4`,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI por sus siglas en Ingles) para un conteo total de células, como se había descrito antes (21). Las sondas utilizadas en este estudio están descritas en la Tabla 2. Para las hibridizaciones con la sonda Lab158, las muestras fueron previamente tratadas con lizosima y lipasa para permeabilizar la pared celular Gram Positiva, como se había descrito en otro artículo (22). Subsecuentemente las muestras eran lavadas y filtradas en un filtro con poros de 0.22-µm de diámetro, montado en Vectashield (Laboratorios Vector, Burlingame, CA, U.S.A.) en slides para microscopios, y enumerados utilizando microscopía epifluorescente. Diez a veinticinco con un total de aproximadamente 300 células positivas eran contadas por cada muestra. RESULTADOS Cultivos en Medios Selectivos La población bacteriana de las muestras fecales recogidas fue enumerada en nueve medios selectivos diferentes. Generalmente el número registrado de los conteos totales enumerados en el medio de cultivo de agar sangre Colombia, se incremento durante los primeros días después del nacimiento de 9.5 a 10.1 y luego a 10.4 y a 11.3 después de 2 semanas. En todos los medios específicos, conteos elevados fueron alcanzados después de 8 a 9 días. La Tabla 1 muestra el número de UFC de las muestras de los niños alimentados por seno materno 4 cultivados en los diferentes medios selectivos. Estos datos muestran una tendencia que fue representativa para los conteos de las floras de las placas de los otros infantes. Para analizar la biodiversidad de la fracción cultivable, 20 a 30 colonias que representaban a la flora dominante fueron elegidas aleatoriamente de los diferentes medios selectivos y fueron analizados por huellas digitales mediante RAPD- PCR. Esto demostró que la flora principal de niños alimentados por seno materno o por fórmula. ESTUDIO 9

4 consistía de 10 a 20 diferentes grupos RAPD. El análisis subsiguiente de la secuencia de 16S rrna de los grupos representativos de RAPD resultó en la identificación de las especies. La Tabla 3 muestra que los medios utilizados fueron selectivos; sin embargo, especies no deseadas también crecieron en los diferentes medios. Más aún, especies tales como Bifidobacterium spp, que fueron dominantes en las muestras, crecieron en la mayoría de los medios selectivos. Las especies aisladas de la microflora fecal de los 12 niños están enlistadas en la Tabla 4. Esta tabla muestra que la Bifidobacteria y la Escherichia coli pertenecen a la flora dominante aislada de las muestras de cualquiera de los 2 grupos de infantes. También se pudieron aislar enterococos, estafilococos, Bacteroides, y Veillonella en ambos grupos. De los niños alimentados por seno materno se aislaron más bacterias ácido lácticas, mientras que de los niños alimentados por fórmula se aislaron más clostridias y Bacteroides. Análisis por Fluorescencia por Hibridización In Situ (FISH) De cada infante, seis o siete muestras fecales fueron analizadas mediante FISH, con tres excepciones: las muestras del segundo y del último niño alimentado por seno materno, y del primer niño alimentado por fórmula. Algunas de las muestras de estos infantes no contenían la suficiente biomasa para ser medidas con precisión. La Figura 1 muestra el desarrollo de la flora en los niños alimentados por seno materno medido por FISH, utilizando los oligonucleótidos específicos. Los números relativos de grupos bacterianos encontrados en las muestras son correlativos con el número total de células contadas después de aplicar la tinción con DAPI. Se detectó una flora diversa en las muestras fecales obtenidas durante los primeros días. Las cantidades promedio de bifidobacterias se encontraban por debajo del 40%. Los conteos de Bacteroides variaban de 0% a 80% y las cantidades de E. coli iban de 0% a 30%. Después de este inicio, todas las floras bacterianas fueron dominadas por las bifidobacterias, que representaban el 60% a 91% de la flora entre los días 12 y 20. La flora del primer infante estaba dominada por bifidobacterias desde el primer día en adelante. La primera muestra del infante número 2 está perdida, y la muestra del día 5 muestra una flora aparentemente ya dominada por bifidobacterias. Este infante tuvo un pico de estreptococos del 16% el día 7 seguido de un incremento de E. coli con un máximo de 32% el día 12. El infante número 4 tuvo un incremento de los Bacteroides hasta un 11% que comenzó aproximadamente el día 12, lo cual coincide con un pequeño pico de estreptococos (9%) y una disminución en la población de bifidobacterias. La Figura 2 muestra el desarrollo de la flora de los infantes alimentados por fórmula. En estos infantes se vio una flora inicial similar a la de los infantes alimentados por seno materno. En estos casos, sin embargo, las bifidobacterias no se volvieron tan dominantes en los siguientes días, como se vio en los niños alimentados por seno materno. Sus valores relativos variaron de 28% a 75%, con un promedio de aproximadamente 50%. Una flora excepcional se estableció en el último infante alimentado por fórmula en quien los números relativos de bifidobacterias disminuyeron por debajo de las cantidades detectables de 0.01% de la flora. En la mayoría de las muestras fecales de los infantes alimentados por fórmula las poblaciones de Bacteroides disminuyeron después de sus altos valores iniciales y luego se incrementaron nuevamente hacia el día 20, variando en ese momento entre 35% a 61%. Solamente el tercer infante alimentado por fórmula el numero de Bacteroides disminuyo a 1%, lo cual coincide con un incremento en la cantidad de E. coli hasta 24%. En el resto de las floras de los infantes alimentados por fórmula, las cantidades relativas de E. coli disminuyeron lentamente de aproximadamente 40% en la primera muestra a 5% en la última. En las muestras fecales de ambos grupos las cantidades relativas de estreptococos y lactococos variaron de 0% a 7.5%, con un pico de 16% en el segundo infante alimentado por seno materno, como ya se mencionó. El grupo de Clostridia -al que pertenecen Clostridium histolyticum/c. lituseburense, incluyendo C. perfringens y C. difficile, fue medido con las sondas His150/Lit135. Células de estos grupos fueron detectadas en algunas de las muestras, pero las cantidades no superaban el 1%, excepto en la muestra del día 12 del segundo niño alimentado por seno materno en el cual se realizó una medición del 2,2%. Esto coincidió con el pico de E. coli ese mismo día. Los Lactobacilos y enterococos eran detectados usualmente en las muestras de los primeros días variando de 0% a 4.6%. Después de este inicio, los números relativos no excedieron el 0.7%.

5 DISCUSIÓN En este estudio, dos nuevos enfoques se utilizaron para evaluar el desarrollo de la microflora intestinal en los infantes recién nacidos. Los cultivos en medios específicos y la identificación molecular de las colonias que desarrollaron demostraron la sucesión de especies y la diversidad de las mismas de la microflora de los dos grupos de recién nacidos. Estos resultados también revelaron que los cultivos pueden resultar en conteos no confiables, porque las placas elegidas por su selectividad en realidad no eran tan selectivas. El análisis FISH con sondas específicas proveyó datos cuantitativos en las cantidades relativas de los diferentes grupos bacterianos. Los resultados de este nuevo método confirmaron la dominancia de las bifidobacterias y la dinámica principalmente de Bacteroides y E. coli. Aunque los conteos de las placas selectivas no fueron útiles para comparar con los datos del método FISH, para la mayoría de las especies encontradas en una muestra en particular por cultivo e identificación por secuencia, los grupos bacterianos correspondientes fueron usualmente encontrados por análisis de FISH de la muestra. La excepción a esto fueron los Bacteroides. Por ejemplo, en el primer infante alimentado por fórmula, los Bacteroides representaban aproximadamente el 50% de la población. Sin embargo nunca se los pudo cultivar en las heces del mismo niño, a pesar del buen transporte y adecuado cultivo anaerobios, ya sea por que los Bacteroides se habían quedado mucho tiempo en el pañal aeróbico, o que esta población no pudo desarrollarse en el medio utilizado. Solo se puede realizar una comparación limitada de la diversidad de las especies cultivadas de las muestras con la de las sondas utilizadas en la prueba de FISH, porque las sondas para algunos grupos todavía no estaban disponibles. Una sonda (Erec482) para el grupo de C. coccoides/eubacterium rectale se ha hecho disponible recientemente (21). Este grupo representa el 29% de la flora fecal adulta y debería ser incorporada en un próximo estudio. De modo interesante, la Tabla 4 muestra que los clostridios pertenecientes a este grupo solo estaban presentes en el grupo de niños alimentados por fórmula. Por lo tanto, se pueden esperar pequeñas cantidades con la sonda Erec482 en niños alimentados por seno materno, mientras que los niños alimentados por fórmula cantidades mayores de hasta 30% podrían estar presentes. Sondas para C. innocuum y otros familiares, Veillonella, Staphylococcus, Propionibacterium y otras sondas están siendo diseñadas y validadas, y todas estas sondas serán incluidas en futuros estudios. Los resultados obtenidos confirman otros estudios en los cuales la colonización del intestino del recién nacido alimentado por seno materno, es comparada con la del recién nacido alimentado por fórmula (1, 3, 5, 7, 10, 11). En todos estos estudios las bifidobacterias se volvieron dominantes (>60%) en una semana después del parto cuando el niño era alimentado por seno materno. Los niños alimentados por fórmula mostraron un desarrollo de una flora má s diversa. Notoriamente, en este estudio, los resultados del análisis de FISH mostraron que los niveles de células de Bacteroides se igualaron con el número de bifidobacterias en los niños alimentados por fórmula, mientras que en los estudios basados en cultivos, anteriormente mencionados, las cantidades de Bacteroides permanecían 100 a 1000 veces menores. Esto indica claramente que existe un problema en cultivar este tipo de bacteria anaeróbica, que puede llevar a errores bastante grandes. En contraste, otros investigadores no describen ninguna diferencia entre ambos regímenes y denotan a los Bacteroides como grupo dominante. Sin embargo en estos casos, las cantidades de bifidobacteria cultivadas son notoriamente bajas, sugiriendo un problema en el cultivo de las bifidobacterias (2, 4, 9). Otros grupos de organismos que son difíciles de cultivar podrían no haber sido considerados. Además de las bifidobacterias y los Bacteroides, en los niños alimentados por seno materno se encuentran mayormente bacterias ácido lácticas, tales como estreptococos y lactobacilos, mientras que los niños alimentados por fórmula poseen una flora con más estafilococos y clostridios. Esto podría ser un efecto del ph, porque estudios previos muestran que las heces de los infantes alimentados por seno materno tienen un ph más bajo que el de los niños alimentado por fórmula (5). La fórmula utilizada en este estudio fue predominantemente suero con un contenido de proteínas más bien bajo (1.4g/100ml) y se considera ser el más cercano a la leche materna actualmente disponible en Holanda. Sin embargo, nuestros resultados indican que la colonización intestinal de los niños alimentados por seno materno, continúa siguiendo un patrón distinto que el de los niños alimentados por fórmula. Ha habido muchos intentos por mejorar las fórmulas infantiles ESTUDIO 9

6 para inducir una colonización más similar a la de los niños alimentados por seno materno (1-11,29). Estos intentos incluyen la búsqueda de la tasa óptima de pretinas/caseína (5,8) y la adición de lactoferrina (10) o nucleótidos (29) Sin embargo, hasta ahora, no existe una fórmula que induzca una colonización parecida a la del seno materno. Nuestros resultados podrían estimular nuevas ideas en el desarrollo de las fórmulas lácteas, tales como la adición de bacterias productoras de ácido. Los primeros intentos, tales como la adición de Bifidobacterium LW420 (30) y Lactobacillus rhamnosus GG (31) a fórmulas infantiles son muy prometedores. La indicación de que el último organismo es capaz de promover mecanismos de barrera en pacientes con dermatitis atópica provee una relación entre la flora intestinal y la modulación del sistema inmune de la mucosa. Con los métodos novedosos de identificación y detección molecular, será posible investigar la colonización de especies no maternales, que se ha sugerido tengan algún rol en el posterior desarrollo de la atopía (15,32). En conclusión, las técnicas moleculares basadas en el 16S rrna utilizadas en este estudio proveen datos cuantitativos más exactos en cuanto al desarrollo de la flora intestinal en los recién nacidos que las técnicas de cultivo convencionales, aunque los resultados de ambas técnicas muestran la misma tendencia. Estos métodos moleculares novedosos están muy bien adecuados para probar el efecto de fórmulas mejoradas para niños, y para analizar los resultados de los efectos deseados e indeseados de los moduladores de la flora mediante antibióticos, prebióticos y probióticos REFERENCIAS 1. Stark PL, Lee A. The microbial ecology of the large bowel of breast-fed and fórmula fed infants during the first year of life. J Med Microbiol 1982; 15: Simhon A, Douglas JR, Drasar BS, Soothill JF. Effect of feeding on infants' faecal flora. Arch Dis Child 1982; 57: Yoshioka H, Iseki K-I, Fujita K. Development and differences of intestinal flora in the neonatal period in breast-fed and bottle-fed infants. Pediatrics 1983; 72: Lundequist B, Nord CE, Winberg J. The composition of the faecal microflora in breast-fed and bottlefed infants from birth to eight weeks. Acta Paediatr Scand 1985; 74: Kleesen B, Bunke H, Tovar K, Noack J, Sawatzki G. Influence of two infant fórmulas and human milk on the development of the faecal flora of newborn infants. Acta Paediatr 1995; 84: Mevissen-Verhage EAE, Marcelis JH, Harmsen-van Amerongen WCM, De Vos NW, Berkel J, Verhoef J. Effect of iron on neonatal gut flora during the first week of life. Eur J Clin Microbiol 1985; 4: Balmer SE, Wharton BA. Diet and faecal flora in the newborn: Breast milk and infant fórmula. Arch Dis Child 1989; 64: Balmer SE, Scott PH, Wharton BA. Diet and faecal flora in the newborn: Casein and whey proteins. Arch Dis Child 1989; 64: Hall MA, Cole CB, Smith SL, Fuller R, Rolles CJ. Factors influencing the presence of faecal lactobacilli in infancy. Arch Dis Child 1990; 65: Roberts AK, Chierici R, Sawatzki G, Vigi V. Supplementation of an adapted fórmula with bovine lactoferrin. Acta Paediatr 1992; 81: Hudault S. Microbial colonization of the intestine of the newborn. In: Bindels JG, Goedhart AC, Visser HKA Eds. Recent developments in infant nutrition. Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 1996; Sakata H, Yoshioka H, Fujita K. Development of the intestinal flora in very low birth weight infants compared to normal full-term newborns. Eur J Pediatr 1985; 144: Grönlund MM, Lethonen OP, Eerola E, Kero P. Fecal microflora in healthy infants born by different methods of delivery: Permanent changes in intestinal flora after cesarean delivery. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1999; 28: Koletzko B, Agget PJ, Bindels JG, et al. Growth, development and differentiation: A functional food science approach. Br J Nutr 1998; 80:S5-S45.

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