Protocolo de utilización para sondas de DNA LIVe. Utilization protocol LIVe DNA probes. Protocolo de utilização Sondas de DNA LIVe

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1 Protocolo de utilización para sondas de DNA LIVe Utilization protocol LIVe DNA probes Protocolo de utilização Sondas de DNA LIVe 1

2 PROTOCOLO DE UTILIZACIÓN DNA específico marcado con fluorocromo Producto: 1. Sonda de DNA específico marcado con fluorocromo. 2. Buffer de Hibridación 3. Reactivos para preparar Solución de Montaje (DAPI + Antifade) Estas sondas están diseñadas para utilizar sobre células en interfase o metafase obtenidas mediante procedimientos citogenéticos estándares, ver: The ACT Cytogenetics Laboratory Manual. 2nd ed. New Cork: Raven Press; Materiales extras requeridos: Solución de Formamida* 2XSSC* Soluciones de etanol 70, 90 y 100% Pepsina* Detergente no-iónico Solución de contracolorante* diluido en antifade* ph-metro o papel para medir ph Cubreobjetos Soluciones de enjuague (1 y 2)* Cemento de contacto removible Tubos 0,2 o 0,5ml Recipientes para enjuagues (Coplin) Aceite de inmersión Cámara húmeda Termómetro *ver protocolos de preparación mas abajo. Equipamientos requeridos: Microscopio de fluorescencia: No siempre un microscopio utilizado en reacciones de inmunohistoquímica u otro tipo de análisis con fluorescencia resulta adecuado. Los requerimientos para observar correctamente una reacción de FISH son los siguientes: o Fuente de Excitación: Se recomienda una lámpara de mercurio de 100 Watt con una vida útil de 200horas. Es necesario que una vez colocada, la lámpara sea alineada correctamente. o Objetivos: Para la ubicación del blanco (interfases o metafases) se recomiendan objetivos de 10, 20 y/o 40X. Para el análisis de la reacción es necesario un objetivo de inmersión especial para fluorescencia con una apertura numérica 0,75. o Filtros de excitación-emisión: Cada fluorocromo observado requerirá de diferentes filtros. Los requerimientos para nuestras sondas se muestran en el cuadro a continuación: Fluorocromo Excitación (nm) Emisión (nm) Verde Rojo DAPI Micropipetas (1-10µl o similar) Microcentrífuga Vórtex Timer Baño de inmersión 2

3 Incubadora 45ºC) Placa termostática o hibridizador Preparación de soluciones extras: 2XSSC: Cloruro de Sodio (NaCl) 300mM Citrato de Sodio (Na 3 C 6 H 5 O 7 ) 30mM Ajustar a ph:7 con Acido clorhídrico (HCl) 1N Hidróxido de Sodio: Hidróxido de sodio 0.1M (concentración final) disuelto en Etanol 70%. Formamida: Mezclar 70% Formamida con 30% 2XSSC. Ajustar a ph:7-8. Esta solución puede ser utilizada durante 1 semana. Guardar a 4ºC en recipiente cerrado Pepsina: Diluir 0,5mg de pepsina en 1ml de Acido clorhídrico (HCl) 0,01N Enjuague 1: En un coplin adecuado para 80ml, agregar 16ml de 2XSSC, 64ml de agua bidestilada y 0,240 ml de detergente no-iónico. Enjuague 2: En un coplin adecuado para 80ml, agregar 80ml de 2XSSC y 0,080ml de detergente no-iónico. 3

4 Precauciones y advertencias (Leer atentamente): Reactivo analítico. Para uso en investigación solamente. Este producto NO está probado para uso diagnóstico o terapéutico. Las reacciones así como la interpretación de las mismas deben ser realizadas por personal idóneo debidamente entrenado. Todas las muestras biológicas deberían ser tratadas como posibles transmisores de agentes infecciosos. Se debe evitar la exposición de la muestra a ácidos o bases en alta concentración así como también al calor extremo. Estos factores dañan el DNA y pueden causar el fallo de la reacción de FISH. Una vez extraída la alícuota a utilizar, la sonda debe ser guardada nuevamente a -20ºC. La falla u omisión de cualquiera de los pasos del protocolo detallado más abajo puede generar resultados erróneos o inaceptables. Las soluciones de enjuague pos-hibridación (ver protocolo) deben ser renovadas periódicamente debido a que son propensas de contaminación. El buffer de hibridación contiene formamida, un teratógeno, por lo que debe evitarse el contacto con la piel y las mucosas. Se recomienda el uso de guantes y chaqueta de trabajo durante todo el proceso. Es necesario controlar siempre la temperatura de las soluciones que se utilizan calientes. Todos los materiales peligrosos deben ser descartados de acuerdo a las normativas de su institución. 4

5 Protocolo de utilización Consideraciones previas: Durante el desarrollo de este protocolo NO ES NECESARIO trabajar en condiciones de semi-obscuridad. Las sondas LIVe están desarrolladas para no perder su fluorescencia durante periodos medios de exposición a luz artificial. Si bien es altamente recomendado mantenerlas a -20ºC, las sondas LIVe no pierden su actividad después de 24hs a temperatura ambiente. El buffer de hibridación provisto permite obtener resultados con 30 minutos de hibridación. Tiempos de Hibridación mayores a 30 minutos no afecta la calidad de la reacción. Se recomienda utilizar 45ºC para hibridaciones de 30 minutos hasta aproximadamente 8 horas. Si la hibridación será revelada al día siguiente la temperatura debe ser de 37ºC Extendido celular Es muy importante que durante la realización del extendido celular NO se utilice calor extremo (flameado, secado a la llama, etc.) Pre-tratamiento En general las sondas LIVe funcionan bien sin ningún tipo de pre-tratamiento, sin embargo, en ocasiones la presencia de restos celulares sobre el extendido o bien la hibridación de muestras como mucosa yugal, amniocitos, etc., requiere realizar una limpieza del extendido afín de exponer mejor el DNA. Sobre la región a hibridar agregar una gota de Pepsina 0,5mg/ml (diluída en HCl 0,01N). Agregar un cubreobjetos. Incubar en cámara húmeda a 37ºC (los tiempos varían con la severidad del tratamiento, siendo el mínimo 5 minutos). Descartar el cubreobjetos y enjuagar el extendido bajo agua corriente. Deshidratar en etanol en series: 70, 90 y 100% 1 minuto en cada uno. Dejar secar totalmente. 5

6 Reacción de Hibridación in situ Fluorescente Protocolo 1: Desnaturalización con Formamida Preparación de la sonda: Descongelar la sonda, homogeneizar en Vórtex Centrifugar brevemente Atemperar el buffer de hibridación En un tubo de PCR agregar: 7µl de Buffer de hibridación De utilizarse sólo 1 1µl de sonda 1 sonda, no es 1ul de sonda 2 necesario agregar agua. Homogeneizar en Vórtex Centrifugar brevemente Desnaturalización: En el reverso del portaobjetos marcar la región a hibridar (los 8 o 9µl preparados hibridan una región aproximada de 22x22mm). Colocar el portaobjetos en una solución de formamida 70% (en 2XSSC) a 70-75ºC durante 1-5 minutos (según la vejez del extendido). Utilizando pinzas extraer el portaobjetos e inmediatamente colocarlo en etanol 70% agitando afín de eliminar la formamida. Deshidratar en etanol 70, 90 y 100% 2 minutos en cada uno. Dejar secar totalmente. Desnaturalizar la solución de sonda a 70ºC durante 5 minutos. Esto puede hacerse en un equipo con temperatura controlada o bien en baño María. Colocar la solución de sonda en un recipiente con hielo unos segundos. Centrifugar brevemente para colectar la fracción evaporada. Sobre la región a hibridar agregar la sonda previamente desnaturalizada. Colocar un cubreobjetos de tamaño adecuado. Sellar los bordes con cemento de contacto removible o colocar una lámina de Parafilm que supere el tamaño del cubreobjetos. Hibridación: El buffer de hibridación LIVe, permite obtener resultados para cualquier tipo de sonda con apenas 30 minutos de hibridación. Colocar el portaobjetos en cámara húmeda. Incubar durante un mínimo de 30 minutos a 45ºC o toda la noche a 37ºC. 6

7 Protocolo 2: Desnaturalización con Hidróxido de Sodio (NaOH) Desnaturalización con Hidróxido de Sodio Este protocolo preserva de manera óptima la morfología cromosómica, permite realizar la reacción de FISH el mismo día de la preparación del extendido y brinda resultados de excelente calidad. Además, según la calidad de la suspensión celular es posible observar un patrón de bandas similar al bandeo G. Debido a la acción del NaOH en ocasiones puede generarse autofluorescencia en los núcleos y/o cromosomas tratados. Debido a esto se recomienda envejecer levemente (37-45ºC 2 horas) el extendido en estos casos. Extendido celular Es muy importante que durante la realización del extendido celular NO se utilice calor extremo (flameado, secado a la llama, etc.) Preparación de la sonda: Descongelar la sonda, homogeneizar en Vórtex Centrifugar brevemente Atemperar el buffer de hibridación En un tubo de PCR agregar: 7µl de Buffer de hibridación 1µl de sonda 1 1ul de sonda 2 Homogeneizar en Vórtex De utilizarse sólo 1 sonda, no es necesario agregar agua. Centrifugar brevemente Desnaturalización: En el reverso del portaobjetos marcar la región a hibridar (los 8 o 9µl preparados hibridan una región aproximada de 22x22mm). Colocar el portaobjetos en una solución de Hidróxido de Sodio (NaOH) 0.1M (en Etanol 70%) a temperatura ambiente durante 6 minutos. Utilizando pinzas extraer el portaobjetos e inmediatamente colocarlo en etanol 70% agitando afín de detener la acción del NaOH. Deshidratar en etanol 70, 90 y 100% 2 minutos en cada uno. Dejar secar totalmente. Desnaturalizar la solución de sonda a 70ºC durante 5 minutos. Esto puede hacerse en un equipo con temperatura controlada o bien en baño María. Colocar la solución de sonda en un recipiente con hielo unos segundos. Centrifugar brevemente para colectar la fracción evaporada. Sobre la región a hibridar agregar la sonda previamente desnaturalizada. Colocar un cubreobjetos de tamaño adecuado. Sellar los bordes con cemento de contacto removible. Nota: Una vez terminado el proceso anterior, es aconsejable colocar el portaobjetos sobre una superficie caliente a 71ºC durante 4 minutos. Por lo general con este paso extra se obtienen mejores resultados, aunque puede disminuir levemente la calidad de la morfología cromosómica. Hibridación: El buffer de hibridación LIVe, permite obtener resultados para cualquier tipo de sonda con apenas 30 minutos de hibridación. Colocar el portaobjetos en cámara húmeda. Incubar durante un mínimo de 30 minutos a 45ºC o toda la noche a 37ºC. 7

8 Protocolo 3: Desnaturalización conjunta (Co-desnaturalización) Con este protocolo se ha logrado homogeneizar el tiempo y la temperatura de desnaturalización conjunta (co-desnaturalización), de forma que se utilizan los mismos parámetros para extendidos frescos o mantenidos a -20ºC. Preparación de la sonda: Descongelar la sonda, homogeneizar en Vórtex Centrifugar brevemente Atemperar el buffer de hibridación En un tubo de PCR agregar: De utilizarse sólo 1 7µl de Buffer de hibridación sonda, no es 1µl de sonda 1 necesario agregar 1ul de sonda 2 agua. Homogeneizar en Vórtex Centrifugar brevemente Co-desnaturalización: Sobre el reverso del portaobjetos marcar la región a hibridar (los 8 o 9µl preparados hibridan una región aproximada de 22x22mm). Agregar la solución de sonda sobre la región marcada Colocar un cubreobjetos de tamaño adecuado Sellar los bordes del cubreobjetos con cemento de contacto removible Colocar el portaobjetos así montado sobre una superficie caliente (hibridizador, plancha termostática, etc.). En ocasiones es conveniente colocar una gota de agua sobre la placa calefactora y luego colocar sobre ésta el portaobjetos montado, de esta forma se logra una película de agua entre el portaobjetos y la superficie caliente optimizando la transferencia de temperatura. o Un tratamiento de 15 minutos a 71ºC ha funcionado de forma óptima e independientemente de la vejez del extendido (goteados en el día, envejecidos en estufa, guardados a -20ºC, etc.). Hibridación: El buffer de hibridación LIVe, permite obtener resultados para cualquier tipo de sonda con apenas 30 minutos de hibridación. Colocar el portaobjetos en cámara húmeda. Incubar durante un mínimo de 30 minutos a 45ºC o toda la noche a 37ºC. 8

9 Reacción de Hibridación in situ Fluorescente Revelado (Mismo procedimiento para protocolos 1, 2 y 3) Pasos previos Por lo menos 30 minutos antes, calentar la solución de enjuague 1 a 71ºC (+/-1ºC) corroborando con un termómetro calibrado la temperatura dentro del recipiente. Atemperar la solución de enjuague 2 a temperatura ambiente. Atemperar el contracolorante a utilizar a temperatura ambiente. Enjuague del exceso de sonda Extraer el portaobjetos de la cámara húmeda. Quitar cuidadosamente el cemento de contacto o la lámina de Parafilm. Sumergir el portaobjetos en una solución de 2XSSC a temperatura ambiente hasta que el cubreobjetos se desprenda (2 a 5 minutos). Sumergir el portaobjetos en el enjuague 1 durante 2 minutos exactamente. Sumergir el portaobjetos en el enjuague 2 un mínimo de 1 minuto. Drenar levemente el exceso de líquido. Colocar sobre la región hibridada una gota (aprox. 20µl) de contracolorante (conteniendo la solución de Antifade). Agregar un cubreobjetos de tamaño mayor a la región hibridada. Drenar el exceso de contracolorante presionando suave y uniformemente con papel absorbente. Eliminar posibles burbujas de aire presionando suavemente con la punta de un tip. La reacción está lista para ser analizada. 9

10 Protocolo de utilización (Protocolo 1) Extendido celular Hecho en el momento (envejecido 2 horas a 37ºC) Preparación sonda Sonda + Buffer de Hibridación Desnaturalización Formamida 70% Deshidratación en etanol Desnaturalización 70ºC o más, 5 minutos Hibridación 45ºC (30 minutos aprox. 8 horas) 37ºC (Toda la noche) Enjuague Montado DAPI + Antifade OBSERVACIÓN 10

11 Protocolo de utilización (Protocolo 2) Extendido celular Hecho en el momento (envejecido 2 horas a 37ºC) Preparación sonda Sonda + Buffer de Hibridación Desnaturalización Hidróxido de Sodio 0.1M 6minutos Tº amb. Deshidratación en etanol Desnaturalización 70ºC o más, 5 minutos Opcional 71ºC, 4 minutos Hibridación 45ºC (30 minutos aprox. 8 horas) 37ºC (Toda la noche) Enjuague Montado DAPI + Antifade OBSERVACIÓN 11

12 Protocolo de utilización (Protocolo 3) Extendido celular Hecho en el momento o Conservado -20ºC Preparación sonda Sonda + Buffer de Hibridación Co-desnaturalización 71ºC 15 minutos Hibridación 45ºC (30 minutos aprox. 8 horas) 37ºC (Toda la noche) Enjuague Montado DAPI + Antifade OBSERVACIÓN 12

13 Specific DNA fluorescently tagged Product: 1. DNA probe fluorescently labeled. 2. Hybridization Buffer 3. Reagents to prepare Mounting Solution (DAPI + antifade) These probes are designed to be utilized on interphase or metaphase cells obtained through standard citogenetic procedures, see: The ACT Cytogenetics Laboratory Manual. 2nd ed. New Cork: Raven Press; Materials required but not provided Ultrapure Formamide solution* 2XSSC* Ethanol solutions 70, 90 y 100% Pepsin* Non-ionic detergent Counterstain solution* diluted in antifade* ph-meter or ph indicator papers Coverslips Wash solutions (1 y 2)* Rubber cement 0,2 or 0,5ml PCR tubes Coplin jars Moist chamber Calibrated thermometer *see prepatation instructions below. Equipment Required: Fluorescence microscope: Not always a microscope used in immunohistochemistry reactions or other fluorescent analysis is appropriate. The requirements to properly observe FISH reactions are as follows o Excitation Source: a 100 Watts mercury lamp with a lifespan of 200 hours is recommended. It is necessary that once positioned, the lamp is correctly aligned. o Objectives: To target location (interphases or metaphases) objectives of 10, 20 and / or 40X are recommended. The reaction analysis requires a special fluorescence immersion objective with a numerical aperture 0.75 o Excitation-emission filters: Each fluorochrome require different filters. The requirements for our probes are listed in the table below: Fluorochrome Excitation(nm) Emission (nm) Green Red DAPI

14 Microcentrifuge Microliter pipettor for 1 to 10 μl volumes Vórtex Timer Water bath Incubator Reagent preparation: 2XSSC: Sodium chloride (NaCl) 300mM Sodium citrate dihydrate (Na 3 C 6 H 5 O 7 ) 30mM Adjust ph to 7.0 with drops of Hydrochloric acid (HCl) 1N Denaturation Solution: Ultrapure Formamide 70% 2XSSC 30% Adjust ph:7-8. Store at 4 C. Discard after 7 days. Pepsin solution: Dilute 0,5mg of pepsin in 1ml Hydrochloric acid (HCl) 0,01N. Wash solution 1: In a coplin suitable for 80ml, add 16ml of 2XSSC, 64ml distilled water and ml of non-ionic detergent. Wash solution 2: In a coplin suitable for 80ml, add 80ml of 2XSSC and 0.80 ml of nonionic detergent. 14

15 Cautions and warnings (Read carefully): Analytical reagent. For research use only. This product is NOT tested for diagnostic or therapeutic use. The reactions and the interpretation of them must be performed by qualified personnel properly trained. All biological samples should be treated as potential carriers of infectious agents. Avoid exposure of sample to acid or alkali in high concentration as well as extreme heat. These factors can damage DNA and cause failure of the FISH reaction. The failure or omission of any step of the protocol detailed below can lead to erroneous or unacceptable results. The hybridization buffer containing formamide, a teratogen and therefore should avoid contact with skin and mucous membranes. It is recommended the use of gloves and jacket work throughout the process. All hazardous materials should be discarded according to rules of your institution. 15

16 Utilization Protocol Preliminary considerations: During the aplication of this protocol It is no nesessary to work in reduced-light conditions. LIVE probes were developed to not lose their fluorescence during short periods (hours) of exposure to artificial light. While it is highly recommended to keep at -20 ºC, the probes Live does not lose its activity after 48hrs at room temperature. The Hybridization Buffer provided leads to results in 30 minutes of hybridization. A hybridization time over 30 minutes does not affect the quality of the reaction. It is recommended to use 45 C for 30 minutes to about 8 hours hybridizations. If the reaction will be revealed next day the temperature should be 37ºC Cellular Smear For the cellular smear it is very important not to use extreme heat(flame, flame-drying, etc.). Pre-treatment In general Live probes works well without any pre-treatment, however the presence of cellular debris or hybridization on certain samples as buccal mucosa, amniocytes, etc. require to clean the target DNA to improve the hybridization. Over the smear sample apply a drop of Pepsin solution. Add a coverslip. Incubate in moist chamber at 37 C (times vary with the severity of the treatment, with a minimum 5 minutes). Discard the coverslip and rinse briefly under running water. Dehydrate in ethanol series: 70, 90 and 100% 1 minute each. Allow to dry completely 16

17 Fluorescent in situ Hybridization reaction Protocol 1: Denaturation using Formamide Probe preparation: Thaw the probe tube, mix on Vortex Centrifuge briefly Thaw the hybridization buffer In a PCR tube add: 7μl of hybridization buffer 1μl of probe Mix in vortex Centrifuge briefly Denaturation: NOTE: At least 30 minutes before denaturing, heat the denaturation solution to desired temperature. With a calibrated thermometer corroborate the temperature inside the coplin. On the back of the slide highlight the region to hybridize (the 8μl prepared cover approximately a region of 22x22mm). Immerse the slide in the denaturation solution at C for 1-5 minutes (depending on the age of the smear) Using tweezers remove the slide and immediately immerse in 70% ethanol agitating for a few seconds to eliminate remaining formamide. Dehydrate in ethanol 70, 90 and 100% 2 minutes each. Allow to dry completely. Denature the probe solution at a minimum temperature of 70ºC 5 minutes. This can be done in a temperature-controlled device or simply leaving the tube in boiling water in a polystyrene support. Place the probe solution on ice a few seconds. Centrifuge briefly to collect the evaporated fraction. Add the probe solution on the region to hybridize Place a coverslip of appropriate size. Seal the edges with removable contact cement or place a sheet of Parafilm that exceeds the size of the coverslip. Hybridization: LIVe hybridization buffer gives excellent results with any probe in just 30 minutes of incubation at 45ºC Place the mounted slide in moist chamber at 45ºC. Incubate for at least 30 minutes at 45ºC or overnight at 37ºC. 17

18 Protocol 2: Denaturation with Sodium Hydroxide (NaOH) This protocol optimally preserves chromosome morphology, allows FISH reaction the same day of the cellular smear preparation and provides high quality results. Furthermore, according to the quality of the cell suspension is possible to observe a banding pattern similar to G banding. NaOH can sometimes generate autofluorescence on nuclei and / or chromosomes. In these cases it is recommended to slightly age the smears at 37-45ºC 2 hours. Probe preparation: Thaw the probe tube, mix on Vortex Centrifuge briefly Thaw the hybridization buffer In a PCR tube add: 7μl of hybridization buffer 1μl of probe Mix in vortex Centrifuge briefly Denaturation: On the back of the slide highlight the region to hybridize (the 8μl prepared cover approximately a region of 22x22mm). Immerse the slide in a solution of NaOH 0.1M in Ethanol 70% at room temperature for 6 minutes. Using tweezers remove the slide and immediately immerse in 70% ethanol agitating for a few seconds to eliminate remaining NaOH. Dehydrate in ethanol 70, 90 and 100% 2 minutes each. Allow to dry completely. Denature the probe solution at a minimum temperature of 70ºC 5 minutes. This can be done in a temperature-controlled device or simply leaving the tube in boiling water in a polystyrene support. Place the probe solution on ice a few seconds. Centrifuge briefly to collect the evaporated fraction. Add the probe solution on the region to hybridize Place a coverslip of appropriate size. Seal the edges with removable contact cement or place a sheet of Parafilm that exceeds the size of the coverslip. Note: Once the above process, a good alternative is to place the slide on a hot surface at 71 C for 4 minutes. Usually this extra step gives better results, although it may slightly decrease the quality of chromosome morphology Hybridization: LIVe hybridization buffer gives excellent results with any probe in just 30 minutes of incubation at 45ºC Place the mounted slide in moist chamber at 45ºC. Incubate for at least 30 minutes at 45ºC or overnight at 37ºC. 18

19 Protocol 3: Co-denaturation This protocol has been designed to unify co-denaturation time and temperature. Here, these parameters are the same for cell smears prepared on the day or kept at -20 C. Probe preparation: Thaw the probe tube, mix on Vortex Centrifuge briefly Thaw the hybridization buffer In a PCR tube add: 7μl of hybridization buffer 1μl of probe Mix in vortex Centrifuge briefly Co-Denaturation: On the back of the slide highlight the region to hybridize (the 8μl prepared cover approximately a region of 22x22mm). Add the probe solution on the region to hybridize Place a coverslip of appropriate size. Seal the edges with removable contact cement or place a sheet of Parafilm that exceeds the size of the coverslip. Place the mounted slide on a hot surface (hybridizer, thermostatic plate, etc.). Sometimes it is advisable to place a drop of water on the hot plate to optimize the temperature transfer. o A treatment of 15 minutes at 71 C has functioned optimally and independently of the age of the smears. Hybridization: LIVe hybridization buffer gives excellent results with any probe in just 30 minutes of incubation at 45ºC Place the mounted slide in moist chamber at 45ºC. Incubate for at least 30 minutes at 45ºC or overnight at 37ºC. 19

20 Washing: Note: At least 30 minutes before washing, heat the wash solution 1 to 71 C (+/-1ºC). With a calibrated thermometer corroborate the temperature inside the coplin. Thaw wash solution 2 to room temperature. Remove the slide from moist chamber. Carefully remove the rubber cement or Parafilm sheet. Immerse the slide in a 2XSSC solution at room temperature until the coverslip falls off. Immerse the slide in the wash solution 1 for exactly 2 minutes. Immerse the slide in the wash solution 2 for at least 1 minute. Take off the slide and drain excess liquid slightly. Place on a drop of mounting solution on the hybridized region. Place a coverslip of appropriate size Drain excess mounting solution by pressing gently and evenly with paper towels. Remove any air bubbles by pressing gently with a tip. The reaction is ready for analysis 20

21 Protocol for use (Protocol #1) Cellular smear Probe preparation DNA Probe + Hybridization buffer Denaturation Formamide 70% Dehydration in ethanol Denaturation 70ºC or more, 5 minutes Hybridization 45ºC (30 minutes to about 8 hours) 37ºC (Overnight) Washes Mounting DAPI + Antifade Analysis 21

22 Protocol for use (Protocol #2) Cellular smear Made the same day (aged 2 hours at 37ºC) Probe preparation DNA Probe + Hybridization buffer Denaturation Sodium Hydroxide 0.1M 6minutes Room Tº. Dehydration in ethanol Denaturation 70ºC or more, 5 minutes Alternative 71ºC, 4 minutes Hybridization 45ºC (30 minutes to about 8 hours) 37ºC (Overnight) Washes Mounting DAPI + Antifade Analysis 22

23 Protocol for use (Protocol #3) Cellular Smear Made the same day or Kept at -20ºC Probe preparation DNA Probe + Hibridization buffer Co-denaturation 71ºC 15 minutes Hybridization 45ºC (30 minutes to about 8 hours) 37ºC (Overnight) Washes Mounting DAPI + Antifade Analysis 23

24 DNA especifico com marca fluorescente Produto: 1. DNA marcado com identificação fluorescente. Sonda 2. Buffer(tampão) Hibridizador 3. Reagentes para Preparação de solução de montagem(dapi + antifade) Estas sondas estão desenhadas para serem utilizadas nas células interfásicas ou metafísicas, obtidas através de procedimentos padrões citogenéticos, veja:o Manual ACT Cytogenetics Laboratory. 2nd ed. New Cork: Raven Press; Materiais necessários que não estão incluídos Solução ultra pura de Formamida 2XSSC* Etanol em solução 70, % Pepsina* Detergente não iônico ph-medidor ou papel para medir ph Coverslip/lamínula Soluções de lavado (1 y 2)* Adesivo de contato Tubos PCR 0,2 ou 0,5ml Frascos coplin Câmera úmida Termômetro calibrado * Ver abaixo as instruções de preparação. Equipamento necessário: Microscópio fluorescente: nem sempre o microscópio usado nas reações imunoistoquímica ou em outras analises fluorescentes são apropriado. Os requisitos para observar corretamente as reações FISH são os seguintes: Fonte de excitação: Recomenda-se uma lâmpara de 1oo watts de mercúrio com uma vida útil de 200hs. É necessário que uma vez posicionada, a lâmpada esteja corretamente alinhada. Objetivos: para localizar o alvo (interfases ou metafases) são recomendadas objetivas de 10, 20 e/ou 40x. A análise da reação requer de uma objetiva fluorescente de imersão com uma abertura numérica 0.75 Filtros de emissão-excitação: Cada flourocromo requer um filtro diferente. Os requisitos para nossas sondas estão na tabela abaixo: 24

25 Fluorocromo Excitação(nm) Emissão (nm) Verde VERMELHO DAPI Microcentrifuga Micropipetas para volumes 1 a 10 μl Vórtex Timer/ cronômetro Banho- maria Incubadora Preparação de Reagentes: 2XSSC: Cloreto de sódio(nacl) 300mM Citrato de sódio desidratado(na 3 C 6 H 5 O 7 ) 30mM Ajustar o ph a 7.0 com gotas de ácido clorídrico (HCl)1N Solução de Desnaturação: Formamida Ultrapura 70% 2XSSC 30% Ajustar ph:7-8. Armazenar a 4ºC. descartar depois de 7 dias. Solu ção Pepsina: Solução esto que: 10% [0.1g/ml] Diluir 0,1 g de pepsina em 1 ml de água ultrapura (Note-se a ph deve ser = 2) Após a preparação armazenar a -20 C Solução de trabalho: 0,05% [0.5mg/ml] Pepsina solução stock: 0,4 ml HCl 12N (puro): 0.66ml H2O destilada: 79ml (Observe o ph final deve ser = 2) Após a utilização, armazenar a 4 C durante 30 dias ou 4 utilizações. Solução de lavado 1: Em um coplin( frasco de vidro) adequado para 80ml, adicione 16ml de 2XSSC, 64ml de agua destilada e 0.240ml de detergente não iônico. Solução de lavado 2: Em um coplin(frasco de vidro) adequado para 80ml, adicione 80ml de 2XSSC e 0.80ml de detergente não iônico Precauções e advertências (leia com atenção): 25

26 Reagente analítico. Somente para investigação. Este produto Não está aprovado para diagnóstico ou uso terapêutico As reações e interpretações dos mesmos devem ser realizadas por profissionais qualificados e corretamente treinados. Toda amostra biológica deve ser tratada como possível portadora de agentes infecciosos. Evitar expor as amostras a acido ou alcalis em concentrações elevadas e altas temperaturas. Estes fatores podem danificar o DNA e causar falhas na reação FISH. A falha ou omissão de qualquer passo do protocolo detalhado a continuação pode levar a resultados errôneos ou inaceitáveis. O buffer(tampão)hibridizador contém formamida, um teratogênico e portanto deve-se evitar o contato com a pele ou membranas mucosas. Recomenda-se o uso de avental de trabalho durante o procedimento. Todo material perigoso deve ser jogado fora de acordo com as normas da sua instituição. 26

27 Protocolo de utilização Considerações preliminares: Durante a aplicação deste protocolo não é necessário agir em condições de luz tênue. As sondas LIVE foram desenvolvidas para não perderem sua fluorescência durante curtos períodos (horas) de exposição à luz artificial. Embora seja altamente recomendável mantê-las a -20 ºC, as sondas LIVE não perdem sua ação depois de 48hs a temperatura ambiente. O buffer (tampão) hibridizador mostrará resultados em 30 minutos de hibridização. Uma hibridização maior a 30 minutos não interfere na qualidade da reação. Recomenda-se usar 45ºC para 30 minutos até aproximadamente 8hs de hibridização. Se a reação for mostrada no dia seguinte, a temperatura deverá ser de 37ºC. Esfregaço/smear celular Para o esfregaço celular é muito importante não usar temperaturas extremas Tratamento prévio Em geral as sondas LIVE funcionam bem sem qualquer tratamento prévio, contudo a presença de fragmentos celulares ou hibridização em algumas amostras como mucosa bucal, amniocitos, etc. requerem que se limpe o DNA especifico para melhorar a hibridização. Sobre a amostra do esfregaço aplique uma gota de solução de pepisina. Adicione um Coverslip/lamínula. Incube em uma câmara úmida a 37ºC (o tempo varia com a severidade do tratamento, com 1 minuto como mínimo). Descarte o Coerslip/lamínula e enxague rapidamente embaixo de agua corrente. Desidrate em series de etanol: 70,90 y 100% 1 minuto em cada um. Espere que se seque completamente. 27

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