Genómica. Daniel Sánchez. Instituto de Investig. Biotecnológicas. Univ. de Gral. San Martín. Objetivos

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1 Genómica Daniel Sánchez Instituto de Investig. Biotecnológicas Univ. de Gral. San Martín Objetivos Determinar la secuencia completa del genoma millones de pares de bases Determinar el nro. y localización de los genes Genoma humano: ó genes? Determinar la función de las proteínas predicción de proteínas nuevas

2 Importancia del estudio de genomas Diagnósticos más rápidos y precisos posibilitarán un tratamiento más precoz para determinadas enfermedades. La caracterización de genomas de microorganismos patogénicos han posibilitado avances importantes en las áreas de diagnóstico, desarrollo de vacunas y tratamiento de enfermedades. Etc. Etc, Etc. Etc, Etc. Etc, Etc. Etc, Etc. Etc, Etc. Etc, Etc. Etc, Etc. Etc, Medios Secuenciación automática geles bases por dia/equipo capilares más de bases por dia/equipo completamente automatizados Automatización Robots Estrategias de secuenciación Whole Genome Shotgun Sequencing Nuevos programas Alta capacidad de procesamiento de datos. Mapear y secuenciar

3 Estrategias para la Secuenciación de Genomas Bacterias (genomas pequeños) Eucariotas WGS Ordenado

4 Whole Genome Shotgun Sequencing Genoma 1.Fragmentar al azar 2.Preparar bibliotecas 3. Secuenciar extremos de clones 4. Ensamblar Secuenciación de genomas Fase 0: Diseño de estrategia clon a clon / shot gun elección de vector biblioteca de insertos grandes y/o pequeños Fase 1: Secuenciación construcción de biblioteca preparación de templado secuenciación Fase 2: Ensamblado/ Cierre ensamblado de contigs cierre de gaps (estrategias) Fase 3: Anotación del genoma Identificación de ORFs vías metabólicas

5 Secuenciación genómica

6 Estrategias para la Secuenciación de Genomas Bacterias (genomas pequeños) Eucariotas WGS Ordenado

7 Estrategias de secuenciación paper 306

8 Flow cytometry Permite el aislamiento de cromosomas islados y la construccion de bibliotecas especificas de cromosoma. Aislamiento y fraccionamiento de ADN de Alto PM

9 Migracion de fragmentos de DNA PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis)

10 Secuenciación genómica BAC = Bacterial Artificial Chromosome

11 Armado de Contigs

12 Random clone fingerprinting Ventajas: 1) no direccional y no dependiente de la localización 2) Puede hacerse a nivel de todo el genoma 3) Existe un gran número de métodos. Repetitive DNA Fingerprinting Inter-ALU PCR Restriction site mapping > STS mapping >

13 Restriction sitebased fingerprinting STS (Sequence Tagged Site)

14 STS mapping Screening: Screening of libraries by PCR 1. Hibridization 2. PCR

15 Secuenciación genómica

16 Secuenciación genómica Secuenciación genómica Shotgun GATTACGCCAAGCTATTT AGGTGACACTATAGAATA CTCAAGCTATGCATCCAA CGCGTTGGGAGCTCTCCC ATATGGTCGACCTGCAGG CGGCYGCGAATTCACTAG TGATTGGCCACGCGTCGA CTAGTACGGGGGGGGGGG GGCGGGATCTTTCCAGAG CCTGTGGGAAGTACTGTT CTGATGCGATGATTTGCA TCATCACGAACCCGGTGA ACAGCACGGTGCCGATAG CGGCGGAGATACTGAGAA GAG 150,000 bases 1,500 bases

17 Secuenciación genómica BAC BAC gaps

18 Fluorescence in situ hybridization techniques (FISH) Mapeo y ordenado de clones. Resolucion: 1) cromosomas en metafase: varias Mb., 2) en prometafase 1-2 Mb. Usos: pintado de cromosomas, cariotipo molecular

19 Mapeo de alta resolución 1) FISH en cromatina, fibras de DNA. Cromosomas naturalmente extendidos (en interfase) resolucion: kb O artificialmente extendidos kb 2) Con enzimas de restricción. Interphase FISH

20 Extended chromatin fiber FISH

21 Secuenciación genómica Anotación del genoma. Qué significa anotar un genoma? o Identificar o predecir genes y sus funciones o Identificar o predecir regiones regulatorias Cómo se hace? o Incorporando información sobre literatura científica o Buscando genes homólogos en otros organismos y extrapolando sus funciones o Incorporando información sobre la expresión de los genes Anotación automática: Proyecto Ensembl (www.ensembl.org) (European Bioinformatics Institute y el Sanger Center, UK). Identificando genes en clones de DNA Cuales son las principales características que nos permiten distinguir un gen de regiones no codificantes? 2 1. Expresión >>> mrna 2. Conservación de las regiones codificantes y regulatorias Los genes en general contienen ORFs largos

22 Hibridación a RNA Northern blot de diferentes tejidos Problemas? 2 Transcriptos no representados en el Northern blot (causa?) Expresión tejido o estadio específica Baja representación de las regiones transcriptas en el clon (probe). Zoo blot hybridization Secuencias muy conservadas en la evolución

23 CpG island identification Exon trapping

24 cdna selection/capture Identificación de genes mediante el análisis de la secuencia de DNA Secuenciación de DNA rápida- automatizada Homologia de secuencias: BLAST FASTA DNA/Proteína Predicción de genes: NIX >>>>

25 Gene finding software: NIX (nucleotide identification)

26 Beneficios adicionales de los proyectos genoma Indirectos: Identificación de miles de marcadores polimórficos Microsatélites SNP Single Nucleotide Polymorphisms Repeticiones de TG Microsatélites 9 TGTGTGTGTGTGTGTGTG ACACACACACACACACAC 6 TGTGTGTGTGTG ACACACACACAC

27 Beneficios adicionales de los proyectos genoma Indirectos: Identificación de miles de marcadores polimórficos Microsatélites SNP Single Nucleotide Polymorphisms cambio en una solo base son los más abundantes 1 cada 1000 pares de bases Marcadores convencionales vs SNPs Marcadores convencionales ~ 30 genes SNPs ~ 3 genes

28 Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) La secuencia de nuestro genoma es 99.9% idéntico al de cualquier otro ser humano. La diferencia del 0.1% (3 millones de bases) está representada por:... AAACGTCTA AAAC-TCTA... Inserciones / deleciones... AAACGTCTA AAAGCTCTA... Inversiones... AAACGTCTA AAACATCTA... Polimorfismos de una base Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) Cómo se detectan? Por comparación de ADN genómico proveniente de distintos individuos (proyecto genoma) O a partir de secuencias depositadas en los bancos de datos (GenBank) Utilizando software especializado: PolyBayes o Polyphred

29 Secuencia de una región del genoma de diferentes individuos Individuos con distintas versiones de una base determinada Población normal Distinto % de ambos alelos Single Nucleotide Polymorphisms Población con una determinada enfermedad Una incidencia mayor de lo esperado en el grupo enfermo sugiere que ese SNP esta asociado a la enfermedad Algunos Beneficios de los Proyectos Genoma Identificación de genes relacionados con enfermedades genéticas: Mayor rapidez Enfermedades multigénicas (SNPs) Diabetes Esquizofrenia Identificación y/o localización de genes de interés agronómico o veterinario. Desarrollo de vacunas >>

30 Los datos de la secuencia del genoma de una bacteria pueden acelerar el desarrollo de una vacuna Fraser et al. (Nature 406: , 2000) Proyectos relacionados Genómica Transcriptoma Splicing alternativo >> diversidad Proteoma Metaboloma Interactoma Genómica funcional

31 Mapping ESTs (Expressed Sequence Tags) EST: es una secuencia corta que representa a un mrna particular Genoma humano: Secuencias codificantes representan una pequeña porción del genoma Mapas físicos de ESTs Identificación de genes Gene discovery Secuenciación de ESTs mrna agttcaggactattacag

32 Proyectos relacionados Genómica Transcriptoma Proteoma Metaboloma Interactoma Genómica funcional

33 Proyectos relacionados Genómica Transcriptoma Proteoma Metaboloma Interactoma Genómica funcional

34 Proyectos relacionados Genómica Transcriptoma Proteoma Metaboloma Interactoma Genómica funcional Microarrays Farmacogenómica Microarrays Bacteria Fragmentos de ADN clonados en plásmidos Extracción de ADN Cada gen es amplificado por PCR en placas de 96 pocillos Oligonucleótidos Un robot transfiere nanogotas desde las placas a un portaobjeto

35 Comparando la expresión de genes Bacterias crecidas en cultivo ARNm aislados y marcados de color rojo Bacterias colectadas del sitio de infección Hibridación con mezcla de ARNm marcados RNA se une a sus respectivos genes Rojo: gene expresado solo en cultivo Verde: gen expresado solo durante la infección ARNm aislados y marcados de color verde Naranja: gene expresado en cultivo e infección Farmacogenómica Uso de estrategias derivadas de la genómica para descubrir nuevos blancos terapéuticos Identificar los genes que determinan la eficacia y toxicidad de medicamentos específicos

36 Farmacogenómica (II) Medicina personalizada Determinar el perfil genético de cada individuo en cuanto a la sensibilidad a una determinada droga Genes polimórficos involucrados en: metabolismo transporte blanco específicos receptores enzimas etc.

37 Bases de datos útiles Aspergillus Bee Cat Chicken Cow Dictyostelium Dog Frog Fruit fly Human Malaria parasite Microbial Genomes Mosquito Mouse Nematode Pig Plant Genomes Central Rat Retroviruses Sea urchin Sheep Zebrafish (continuación)

38 (Continuación) /cow/ Welcome to the Bos taurus Genome Resources page. This homepage provides information on bovine and bovine-related resources from NCBI and the research community. IIB-UNSAM Lab. Genómica y Bioinformática Dr. Daniel Sanchez Dr. Fernán Agüero Lic. Ramiro Verdún Lic. Nelson DiPaolo Diego Rey Serantes Fernanda Peri Rodrigo Pavón Ex: Dr. Ramiro Verdún Dr. Nelson DiPaolo En colaboración con: Dr. Alberto C. Frasch Dr. Javier Di Noia Lic. Vanina Campo Dr. Rodolfo Ugalde Lic. Diego Comerci Dr. Rick Tarleton University of Georgia, USA Dra. Siv Andersson Uppsala University, Sweden Dr. Emilio García Lawrence Livermore National Laboratory, USA Dr. Marcelo Tolmasky California State University, USA

39 IIB-UNSAM Lab. Genómica y Bioinformática Instituto de Investigaciones Biotecnológicas Laboratorio de Genómica y Bioinformática Muchas gracias!! Mi e.mail: dsanchez at iib.unsam.edu.ar

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