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1 GENÓMICA La genómica es el campo de la genética que intenta comprender el contenido, la organización, la función y la evolución de la información genética contenidos en el genoma completo. Su principal objetivo de estudio es la caracterización molecular de los genomas completos. La genómica integra las disciplinas tradicionales: citología, genética mendeliana, cuantitativa, molecular, de poblaciones y nuevas disciplinas como la bioinformática. Para identificar y cartografiar de manera sistemática todos los genes del genoma de un organismo se procedió a: Identificar mutaciones espontáneas o generar colecciones de mutantes usando agentes químicos o físicos. Generar mapas genéticos mediante análisis de ligamiento utilizando las cepas mutantes. 1 2 Figura 1. Organismos modelo utilizados 5 para identificar mutaciones y generar mapas genéticos: 1. Maíz, 2. Drosophila, 3 3. E. coli, 4. Ratón y 5. Levadura. 4 Durante la década de 1980 los genetistas comenzaron a utilizar la tecnología del ADN recombinante como una segunda aproximación al análisis genético, cartografiando secuencias de ADN clonadas en cromosomas específicos. La mayor parte de estas secuencias no eran genes, sino marcadores como polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), polimorfismo de un único nucleótido (SNP) y otros. Una vez asignados a un cromosoma, estos marcadores se utilizaban en 1

2 árboles genealógicos para establecer un ligamiento entre los marcadores y enfermedades genéticas. Este método denominado clonación posicional se utilizó para cartografiar, aislar, clonar y secuenciar los genes de distintas enfermedades. A mediados de 1980 ya se habían asignado más de genes y marcadores a cromosomas humanos. Actualmente se han secuenciado centenares de genomas de procariotas y eucariotas, y hay más de mil proyectos en ejecución. La Genómica incluye diversos campos Genómica Estructural Genómica Funcional Genómica Comparativa La Genómica Estructural incluye la construcción de los datos de la secuencia del genoma, el descubrimiento de los genes y su localización y la construcción de mapas genéticos. La Genómica Funcional estudia la función biológica de los genes, su regulación y sus productos. La Genómica Comparativa compara secuencias de genes y proteínas de diferentes genomas para elucidar las relaciones funcionales y evolutivas. 2

3 La Proteómica es una extensión de la Genómica y su objetivo es el estudio de las proteínas presentes en una célula, en un tejido, en un fluido en un momento dado bajo determinadas condiciones. Define el conjunto completo de proteínas codificadas por un genoma. Incluye: Identificación de todas las proteínas expresadas en una célula bajo determinadas condiciones. La naturaleza y el alcance de cualquier modificación pos-traduccional de las proteínas. Las interacciones proteína-proteína. La localización subcelular de las proteínas. 3

4 GENÓMICA ESTRUCTURAL La Genómica estructural se ocupa de la secuenciación y la comprensión del contenido del genoma. A menudo, uno de los primeros pasos en la caracterización de un genoma es preparar mapas genéticos y físicos de sus cromosomas. Estos mapas proporcionan información sobre las localizaciones relativas de genes, los marcadores moleculares y los segmentos cromosómicos, que suelen ser esenciales para posicionar los segmentos cromosómicos y alinear tramos del ADN secuenciado en una secuencia del genoma completo. MAPAS GENÉTICOS Los mapas genéticos (mapas de ligamiento) proporcionan una aproximación a grandes rasgos de las localizaciones de los genes en relación con las de otros genes conocidos. Estos mapas se basan en la función genética de recombinación. Para la construcción de los mapas se cruzan individuos heterocigotos en dos o más loci genéticos y se determina la frecuencia de recombinación mediante el examen de la progenie. Si la frecuencia de recombinación entre dos loci es del 50%, entonces los loci están ubicados en cromosomas diferentes o están muy separados en el mismo cromosoma. Si la frecuencia de recombinación es menos del 50%, los loci están localizados muy próximos en el mismo cromosoma (pertenecen al mismo grupo de ligamiento). Para los genes ligados, la frecuencia de recombinación es proporcional a la distancia física entre los loci. Las distancias en los mapas genéticos son medidas en porcentaje de recombinación (centimorgans, cm) o unidades de mapa (um). Figura 2. Los mapas genéticos se basan en la frecuencia de recombinación. Marcadores de ADN Distancia en un mapa genético 4

5 Durante muchos años, los genes podían detectarse sólo observando su influencia en un rasgo (fenotipo) y la construcción de mapas genéticos estaba limitada por la disponibilidad de rasgos de un locus individual que podrían examinarse por la evidencia de la recombinación. Al final, esta limitación se superó con el desarrollo de técnicas moleculares, como el análisis de polimorfismos de la longitud del fragmento de restricción, la reacción en cadena de la polimerasa y la secuenciación de ADN, mejorando los mapas genéticos. Los mapas genéticos tienen varias limitaciones, la primera es la baja resolución o el detalle. Segundo, no siempre se corresponden con precisión a las distancias físicas entre los genes. Los mapas genéticos se basan en las tasas de entrecruzamiento, que varía de una parte de un cromosoma a otro, de modo que las distancias de un mapa genético son sólo aproximaciones de distancias físicas reales a lo largo de un cromosoma. A pesar de estas limitaciones, los mapas genéticos han sido fundamentales para el desarrollo de los mapas físicos y la secuenciación de genomas completos. MAPAS CITOGENÉTICOS Los mapas citogenéticos o cromosómicos constituyen una etapa intermedia entre los mapas genéticos y los mapas físicos. Figura 3. Comparación del mapa citogenético del cromosoma 1 del búfalo (BBU1) a la izquierda y la alineación con la secuencia de montaje del cromosoma 1 y 27 del bovino (BTA1 BTA27) a la derecha. Los marcadores comunes a ambos están unidos por una línea sólida de color negro o una línea roja sólida (circulo). Las líneas rojas indican los marcadores que se orientan de forma secuencial pero invertida. 5

6 Con el avance de las técnicas de bandeo cromosómico, la citogenética cuenta con una herramienta de mayor precisión en la individualización de los cromosomas, facilitando su agrupamiento y clasificación morfológica: la determinación de aberraciones cromosómicas de importante incidencia en animales. El estudio citogenético en animales domésticos se ha desarrollado rápidamente en los últimos años. Hoy en día es utilizado como elemento de diagnóstico que permiten detectar un gran número de patologías. A su vez el bandeo cromosómico, ha permitido precisar la localización de genes aportando información al mapa genético. Por otro lado permiten realizar estudios evolutivos de especies relacionadas entre sí. La construcción de los mapas citogenéticos o cromosómicos se realizan utilizando técnicas que no incluyen la reproducción sexual (meiosis) y, por lo tanto, asignan una localización según las regiones citogenéticas (además, estos mapas presentan la ventaja de no requerir del uso de marcadores polimórficos). Esas técnicas son: Hibridación in situ, Híbridos de células somáticas y Híbridos de radiación. Hibridación In Situ. Cuando una secuencia de ADN, en este caso referida como una sonda de ADN (en inglés, probe), es marcada con isótopos radioactivos o fluorescencia, podemos hibridarla con su secuencia complementaria en el ADN genómico de un cromosoma específico y observar la marca directamente sobre el extendido cromosómico con un microscopio óptico. Las células deben estar fijas y los cromosomas esparcidos en un portaobjetos y expuestos a una solución de ph elevado para romper el apareamiento de bases y permitir el acceso a las sondas. La hibridación in situ fluorescente (FISH) es una técnica muy sensible siempre que se cuente con sondas lo suficientemente grandes (y homólogas) y que se suprima la fluorescencia de fondo. La sensibilidad de esta variante de la técnica de hibridación in situ permite localizar una secuencia con una precisión de hasta 30 Mb y de detectar anormalidades cariotípicas en cromosomas metafásicos tanto como interfásicos. Los fluorocromos más empleados son: fluoresceína (FITC), rodamina (XRITC) y Texas Red. Figura 4. Cromosoma 4 que presenta una duplicación de la banda q21 detectado con la técnica FISH La hibridación in situ es la técnica de elección 6 para la localización rápida de los transgenes.

7 Por último, el pintado de cromosomas (del inglés chromosome painting) es una variante del FISH que emplea una mezcla de sondas de ADN derivada de un cromosoma entero o de una región cromosómica de interés. Se utiliza para obtener patrones de regiones homólogas entre diferentes especies y es una forma muy directa de evaluar la cantidad de rearreglos que se produjeron entre dos especies en el curso de la evolución. Híbridos de Células Somáticas Fibroblasto humano Los fibroblastos humanos y las células tumorales de ratón se mezclaron en presencia de polietilenglicol y dan origen a células híbridas denominadas heterocarion Figura 5. La hibridación de células somáticas puede utilizarse para determinar cuál es el cromosoma que contiene el gen de interés. Líneas celulares Célula tumoral del ratón Heterocarion Célula híbrida con núcleos fusionados Para esta técnica se utilizan células híbridas (viables) derivadas de la fusión in vitro de células somáticas de especies diferentes de mamíferos. Aunque se desconoce la razón, se observa que los cromosomas que se van perdiendo en las células híbridas pertenecen exclusivamente a uno de los conjuntos parentales. Por ejemplo, los híbridos humano/roedor tienden a perder (a través de los sucesivos cultivos y en forma preferencial) los cromosomas humanos y quedarse con una mayoría de cromosomas de roedor. Debido a esto, es posible derivar un panel de células híbridas que representen cada cromosoma humano en forma única, sobre un conjunto de cromosomas de roedor. Por lo tanto, todos los genes de origen roedor son retenidos (y se expresan normalmente), mientras que sólo los genes presentes en el único cromosoma humano que quedó retenido en ese híbrido podrán ser localizados por medio del uso de sondas moleculares o el análisis de expresión. De esta manera, detectando patrones de presencia o ausencia de marcadores (o expresión de genes) y correlacionando con los cromosomas presentes en el híbrido, se puede asignar un gen humano a un cromosoma en particular. Los híbridos de células somáticas humano/ ratón, con un complemento limitado de cromosomas humanos (intactos), han sido muy usados para localizar genes humanos en los últimos 20 años, a pesar de ser muy inestables. 7

8 Híbridos de Radiación (HR) Otra técnica desarrollada para obtener mapas de alta resolución son los paneles de híbridos de radiación (Radiation Hybrid RH), enfoque descripto por Goss y Harris en Las dos grandes ventajas de este sistema son que pueden mapearse marcadores o genes no polimórficos (ya que se evalúa sólo la presencia o ausencia de un marcador) y que se logra una resolución mayor que con los mapas de ligamiento, constituyendo un puente entre éstos y los mapas físicos. Estos paneles de células híbridas se construyen a partir de células donantes (de la especie a ser mapeada) que han sido irradiadas letalmente (ya sea con rayos g o X) para causar la fragmentación de sus cromosomas (por roturas de doble cadena). Las células así irradiadas son fusionadas con líneas celulares receptoras deficientes para un marcador de selección, como ser la timidina quinasa (TK ) o la hipoxantina fosforibosil transferasa (HPRT ). Usando condiciones de selección con medios apropiados, sobrevivirán sólo aquellas células que contengan, por lo menos, algún fragmento cromosómico proveniente de las células dadoras. El concepto teórico es que aquellos loci que se encuentran muy próximos unos de otros serán retenidos en el mismo fragmento cromosómico después de la irradiación. Esta característica es similar al principio de ligamiento genético que hemos visto en los mapas meióticos. Como en los paneles de ADN obtenidos con cruzas de animales, la información de los paneles HR es acumulativa y puede proveer datos para el ordenamiento (de alta resolución) de regiones no polimórficas o no separables por los mapas de ligamiento. 8

9 Figura 6. Híbridos de radiación. Construcción de clones de híbridos de radiación (HR) a partir de células donantes con un único cromosoma humano (híbrido mono-cromosómico) y células receptoras de hámster. Cada clon (abajo) presenta una colección diferente (al azar) de fragmentos del cromosoma humano original. Los 6 loci hipotéticos (A a F) se marcan como + (presencia) o - (ausencia), dando una idea del ordenamiento en el cromosoma original Cuando se evalúa un marcador (por Southern blot, FISH o PCR), el patrón de presencia (+) o ausencia ( ) a través del panel, define el emplazamiento del mismo: aquellos marcadores con el mismo patrón de + y estarán localizados en el mismo bin o posición. Estos estudios se conocen como patrones de retención de marcadores y nos ayudan a determinar la ubicación de un gen o marcador. En estos casos, la unidad para medir la distancia en el mapa es el Ray o el centiray (cr). MAPAS FÍSICOS Los mapas físicos están basados en el análisis directo del ADN y ponen los genes respecto a distancias medidas en el número de pares de bases, kilobases o megabases. Un tipo común de mapa físico es el que conecta piezas aisladas de ADN genómico que fue clonado en bacterias o levaduras. Una de las ventajas es que, por lo general, los mapas físicos tienen resolución mayor y son más exactos que los mapas genéticos. Clones de ADN alineados Figura 7. Los mapas físicos a menudo se utilizan para ordenar los fragmentos de ADN clonados. Mapa genético Cromosoma Mapa físico Secuencia de ADN 9

10 Hay varias técnicas para crear mapas físicos, entre las que se incluyen el mapeo de restricción, que determina las posiciones de sitios de restricción en el ADN; el mapeo del sitio de secuencia específica (sequence-tagged site, STS), que localiza las posiciones de secuencias cortas únicas de ADN en un cromosoma; la hibridación in situ fluorescente (fluorescent in situ hybridization, FISH), por el cual pueden mapearse los marcadores visualmente en sus localizaciones cromosómicas y la secuenciación de ADN. 10

11 VISUALIZACION DE LOS FRAGMENTOS DE ADN Para la visualización de fragmentos de ADN se encuentran disponibles numerosas técnicas, entre las que se pueden mencionar: 1. La electroforesis es una técnica bioquímica estándar para la separación de moléculas sobre la base del tamaño y la carga eléctrica. Hay varios tipos. Se prepara un gel poroso de agarosa que se funde en una solución buffer. Al enfriarse se solidifica. En uno de los extremos del gel se realizan indentaciones (pocillos) para contener las soluciones con fragmentos de ADN y se somete a una corriente eléctrica que pasa a través del gel. Dado que el grupo fosfato del ADN tiene carga negativa, los fragmentos de ADN migran hacia el extremo positivo del gel. La distancia que recorre cada fragmento depende de su tamaño. Luego se produce la tinción del gel con un colorante específico como bromuro de etidio. La electroforesis es muy utilizada en la tecnología de ADN recombinante. 2. Otra técnica es la Southern blot, sirve para transferir los fragmentos desnaturalizados monocatenarios provenientes de un gel a un medio sólido delgado. Estos fragmentos son cortados por una o más enzimas de restricción. Se puede identificar que clones de una biblioteca contienen una determinada secuencia de ADN y para caracterizar el tamaño de los fragmentos. También se puede utilizar para determinar si un clon contiene todo un gen o solo parte de el. Los fragmentos se separan por electroforesis en gel, lo que produce una serie de bandas. Se tiñe el ADN en el gel con bromuro de etidio y se fotografía o escanea para determinar el número y peso molecular de los fragmentos. El ADN se debe desnaturalizar en fragmentos de cadena sencilla con un tratamiento alcalino. Se cubre el gel con una membrana de nitrocelulosa. Los fragmentos de ADN del gel se transfieren a la membrana colocando la membrana y el gel sobre un pabilo (esponja) sumergida parcialmente en una solución tampón. Se colocan varias capas de papel de celulosa secante. La acción capilar arrastra el tampón por el gel y de esta manera se transfieren los fragmentos de ADN del gel al filtro de nitrocelulosa. Después de la transferencia al gel se coloca en una solución de hibridación de una sonda marcada en forma radiactiva o química. La sonda se unirá a todos los fragmentos de ADN en la membrana que posee secuencias complementarias. Luego se lava la membrana para sacar la sonda no unida y la sonda unida se detecta por autorradiografía u otro método para sondas marcadas. 11

12 Figura 8. Técnica de Southern blot para transferir los fragmentos desnaturalizados monocatenarios provenientes de un gel a un medio sólido delgado. 3. El Nothern blot es la transferencia de ARN también de un gel a un soporte sólido mediante un proceso denominado. La hibridación puede revelar el tamaño de una molécula de ARN mensajero particular, su abundancia o los tejidos en los que se transcribe. 4. El Western blot es la transferencia de la proteína de un gel a una membrana. La sonda puede ser un anticuerpo, utilizado para determinar el tamaño de una proteína y el patrón de expresión. 5. Hibridación in situ (explicada anteriormente) 6. Footprinting del ADN Muchas secuencias del ADN actúan como sitios de fijación para proteínas por ej. las secuencias consenso en promotores que son los sitios a menudo sitios de fijación para los factores de transcripción. Esta técnica se utiliza para determinar las secuencias de ADN fijadas a estas proteínas. 7. Mutagénesis Una manera muy eficaz para estudiar los genes es provocar mutagénesis y estudiar los efectos en el organismo. 12

13 8. Animales transgénicos En ratones y otros mamíferos el ovocito es lo suficientemente grande como para inyectar el ADN de manera directa. En el estado de dos pronúcleos antes de la fecundación. Antes de la fecundación se puede inyectar el ADN en uno de ellos y así unas copias de ADN son inyectadas y se integran al azar mediante un proceso denominado recombinación no homóloga. Los embriones se implantan luego en una hembra seudopreñada, madre sustituta. Figura 9. Animales transgénicos. Los animales alterados son transgénicos y el ADN aportado extraño se denomina transgen. 9. Ratones con desactivación génica Knockout Es una variante que consiste en producir ratones en los que se les desactiva un gen normal. Sus fenotipos ratones con desactivación permiten determinar la función de un gen. La manera habitual es insertar un gen neo que confiere resistencia al antibiótico G418. La inserción rompe el gen blanco y proporciona un marcador conveniente para el encuentro de copias del gen desactivado. Después de transferir el gen desactivado a las células embrionarias se seleccionan mediante el agregado del antibiótico G418. Solo sobrevivirán las células con el gen desactivado. Figura 10. Knock-out. Dentro del ratón la copia normal del gen puede intercambiarse con la desactivada a través de la recombinación. 13

14 Reacción en Cadena de la Polimerasa para amplificar el ADN (PCR) Permite amplificar los fragmentos de ADN miles a millones de veces en el transcurso de unas pocas horas. Puede utilizarse con cantidades pequeñas de ADN original incluso una sola molécula. La PCR ha revolucionado la biología molecular y es hoy una de las técnicas moleculares más utilizadas. La base de la PCR es la replicación catalizada por una ADN polimerasa, que tiene dos requisitos esenciales: un molde de ADN monocatenario a partir del cual puede copiarse una nueva cadena de ADN y un cebador al que pueden agregarse los nuevos nucleótidos. Debido a que una molécula de ADN consta de 2 cadenas de nucleótidos cada una puede servir como molde para producir una nueva molécula de ADN, la cantidad de ADN se duplica con cada replicación. El punto de partida de la síntesis de ADN en el molde es determinado por la elección de los cebadores. Los cebadores utilizados en la PCR son los fragmentos cortos de ADN, de manera típica de 17 a 25 nucleótidos de longitud, que son complementarios a las secuencias conocidas en el molde. Para cada cadena se utiliza un cebador diferente. Para llevar a cabo la PCR se comienza con: una solución que incluye el ADN blanco (ADN por ser amplificado), la ADN polimerasa, los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfatos los cebadores que son complementarios a las secuencias cortas en cada cadena de ADN blanco los iones magnesio y otras sustancias que son necesarias para que se produzca la reacción. Una reacción en cadena de la polimerasa incluye 3 pasos: Paso 1: una solución de ADN se calienta entre 90ºC y 100ºC para romper los puentes de hidrógeno entre las dos cadenas de nucleótidos y producir así los moldes monocatenarios necesarios. La mezcla de la reacción se mantiene a esta temperatura durante sólo uno o dos minutos. Paso 2: la solución de ADN se enfría con rapidez a una temperatura entre 30ºC y 65ºC y se mantiene así durante un minuto o menos. Los cebadores se adhieren a sus secuencias complementarias en las cadenas molde. Paso 3: la solución se calienta entre 60ºC y 70ºC, temperatura a la cual la ADN polimerasa puede sintetizar cadenas nuevas de ADN mediante el agregado de nucleótidos a los cebadores. En el transcurso de unos pocos minutos se producen dos moléculas nuevas de ADN bicatenario por cada molécula original de ADN. 14

15 Luego se repite cada ciclo completo. Con cada ciclo, la cantidad de ADN se duplica; de modo que éste aumenta en forma geométrica. Una molécula de ADN aumenta a más de moléculas en 10 ciclos de PCR, a más de un millón de moléculas en 20 ciclos y a más de mil millones de moléculas en 30 ciclos. Cada ciclo se completa en el término de unos pocos minutos; por tanto, en unas pocas horas se obtiene una amplificación grande de ADN. Figura 11. Pasos de la PCR Dos innovaciones importantes facilitaron el uso de la PCR: El descubrimiento de la ADN polimerasa que es estable a las temperaturas elevadas (polimerasa Taq). El desarrollo de cicladores térmicos automatizados, es decir, máquinas que provocan los cambios de temperaturas rápidos requeridos para los diferentes pasos de la PCR. En la actualidad la PCR se utiliza con frecuencia en lugar de la clonación génica, pero tiene varias limitaciones. El uso de PCR requiere el conocimiento previo de parte de la secuencia del ADN para permitir la construcción de cebadores. Otra limitación es que el tamaño de los fragmentos que pueden amplificarse por la polimerasa Taq estándar suele ser menor de 2000 pb. A pesar de sus limitaciones la PCR se utiliza habitualmente en una amplia gama de aplicaciones moleculares. 15

16 SECUENCIACION SECUENCIACIÓN DEL ADN En cierto sentido, un ADN clonado o no, no está completamente caracterizado hasta que se conoce su secuencia nucleotídica. La capacidad de secuenciar ADN ha permitido grandes avances en el conocimiento de la organización del genoma y de los genes, incluyendo su estructura, función y mecanismos de regulación. Los primeros métodos para la secuenciación rápida de ADN se desarrollaron entre 1975 y Frederick Sanger y col. crearon el método de secuenciación dideoxi basado en la elongación del ADN; Allan Maxam y Walter Gilbert desarrollaron un segundo método basado en la degradación química del ADN. El método de Sanger se convirtió con rapidez en el procedimiento estándar para la secuenciación de cualquier fragmento purificado de ADN. Método químico de Maxam y Gilbert Un fragmento de ADN se marca radioactivamente en sus extremos con gamma 32P ó gamma 32S datp por acción de la polinucleótido quinasa. La técnica consiste en romper estas moléculas marcadas con reacciones químicas específicas para cada una de las cuatro bases. Cuatro alícuotas de la misma muestra se tratan bajo condiciones distintas, posteriormente el tratamiento con piperidina rompe la molécula de ADN a nivel de la base modificada. Los productos de estas cuatro reacciones se resuelven en función de su tamaño en geles de poliacrilamida donde la secuencia puede leerse en base al patrón de bandas radioactivas obtenidas. Esta técnica permite la lectura de unas 100 bases de secuencia. 16

17 Figura 12. Método químico de Maxam y Gilbert. Método enzimático de Sanger En este método se utilizan pocos reactivos tóxicos y cantidades menores de radioactividad que en el método de Maxam-Gilbert, y su característica particular es el uso de didesoxinucleótidos trifosfato (ddntps) como terminadores de la Base nitrogenada cadena de ADN. Los ddntps son desoxinucleótidos de los 4 nucleótidos diferentes (datp,dttp, dctp y dgtp) que carecen de uno de los grupos hidroxilo, de manera que cuando uno de estos nucleótidos se incorpora a una cadena de ADN en crecimiento, esta cadena no puede continuar elongándose ya que la enzima ADN polimerasa necesita un extremo 3 OH para añadir el siguiente nucleótido, y el ddntp, marcado en forma radioactiva o química, incorporado carece de este grupo hidroxilo. Al terminar 17

18 la elongación de la cadena, se producen varios fragmentos de ADN de longitud variable, los cuales son desnaturalizados por calor y separados por tamaño (con una resolución de un solo nucleótido) mediante electroforesis en gel de poliacrilamida - urea. Cada una de las cuatro reacciones de síntesis se corre en calles individuales (A, T, G y C) y se visualizan las bandas de ADN mediante autorradiografía o luz ultravioleta. Las bandas obtenidas en el gel corresponden a los fragmentos de ADN de diferentes longitudes ADN monocatenario que debe ser secuenciado Los cuatro ddntp Figura 13. El método de didesoxi de secuenciación de ADN se basa en la terminación de la síntesis de ADN. Autorradiograma de la electroforesis en gel Secuencia de la cadena obtenida complementaria Secuencia de la cadena molde original Una banda en una calle indica un fragmento de ADN que es el resultado de una terminación de la cadena tras la incorporación de un didesoxinucleótido (ddatp, ddgtp, ddctp o ddttp). El nucleótido terminal puede ser identificado de acuerdo al didesoxinucleótido que se añadió en la reacción que dio lugar a esa banda. Las 18

19 posiciones relativas entre las cuatro calles se utilizan entonces para leer la secuencia de ADN. Secuenciación automática de Sander Durante muchos años, la secuenciación del ADN se realizó sobre todo en forma manual y era una técnica laboriosa y costosa. En la actualidad, la secuenciación se lleva a cabo mediante aparatos automatizados que utilizan colorantes fluorescente y escáneres de láser para los miles de secuencias de pares de bases en unas pocas horas. Figura 14. Esquema de la secuenciación por el método automático de electroforesis capilar con la secuencia obtenida. Los ddntp utilizados en la reacción automatizada se marcan cada uno con un colorante fluorescente distinto. Las cuatro reacciones pueden tener lugar en el mismo tubo de ensayo y pueden colocarse en el mismo pocillo durante la electroforesis, dado que cada dntp se marca en forma distintiva. Los aparatos de secuenciación recién desarrollados llevan a cabo la electroforesis en tubos capilares que contienen gel. Los fragmentos de diferentes tamaños producidos por la reacción de secuenciación se separan dentro de un tubo y al migrar pasan por delante de un haz de láser y un detector. 19

20 Cuando los fragmentos pasan por el láser, sus colorantes fluorescentes se activan y la fluorescencia resultante se detecta por un escáner óptico. Cada colorante emite fluorescencia de una longitud de onda característica que se lee en el escáner óptico. Para la interpretación, la información ingresa en una computadora y los resultados se imprimen como un conjunto de picos en un gráfico (Fig. 14). Los aparatos de secuenciación automatizados pueden contener 96 tubos capilares o más, lo que permite leer secuencias de a pb en unas pocas horas. Secuenciación automática en geles desnaturalizantes de acrilamida/bisacrilamida La secuenciación automática mediante geles desnaturalizantes, se realiza polimerizando un gel de acrilamida/bisacrilamida entre dos cristales montados adecuadamente sobre el cassette que sirve de soporte para los mismos y que posteriormente se acoplará en el secuenciador automático para proceder a la carga de la muestras. El número de muestras que podemos cargar en cada gel, viene determinado por el número de pocillos que posee el peine (de dientes de tiburón) que utilicemos. Hay peines de cuatro tamaños distintos: de 36, 48, 64 y 96 pocillos. La electroforesis se desarrolla durante 7 horas, y se puede realizar una lectura de unos 700pb aproximadamente, dependiendo siempre de la calidad del ADN, de la correcta cuantificación del mismo, de la utilización del primer adecuado, y de la polimerización correcta del gel de acrilamida/bis principalmente. Cuando las muestras a secuenciar tienen una longitud no superior a 400pb, podemos disminuir el tiempo de la electroforesis a 3.5 horas, aumentando la velocidad de barrido del laser, y el resultado es igualmente optimo. Figura 15. Esquema de los geles desnaturalizantes. 20

21 Secuenciadores automáticos capilares Existen instrumentos de electroforesis capilar que proporcionan una alternativa clara al sistema basado en geles de acrilamida/bisacrilamida donde este soporte ha sido sustituido por un polímero que se inyecta de forma automática en un capilar antes de cargar la muestra de secuenciación; las muestras se van analizando una a una. Este tipo de secuenciadores se utiliza para lecturas no superiores a unos 450pb. El equipo funciona de forma completamente automática inyectando las muestras (que se preparan exactamente igual que durante la secuenciación en geles y se colocan en una placa de 96 pocillos), en un capilar previamente cargado con un cierto polímero que funciona como lo hace la matriz de acrilamida-bisacrilamida-urea de los geles de secuencia, permitiendo resolver fragmentos de ADN de cadena sencilla que se diferencian en una única base. A una altura determinada el laser detecta la fluorescencia emitida por cada cadena sencilla de ADN fluorescente y traduce esta emisión de fluorescencia en la secuencia correspondiente. Una vez desarrollada la electroforesis de la primera muestra, el capilar se vacía rellenándose nuevamente con polímero fresco. Se inyecta a continuación una segunda muestra, se procede a desarrollar nuevamente la electroforesis y así sucesivamente. Figura 16. Secuenciador ABI Prism 310 LAS PRINCIPALES VENTAJAS DE ESTOS NUEVOS EQUIPOS SON: Automatización completa de todo el proceso, no siendo necesaria siquiera la presencia de un técnico que cargue las muestras en los diferentes capilares del equipo. Rapidez en el análisis de cada muestra: dado el pequeño diámetro de los capilares, se pueden aplicar voltajes mayores que en los geles de acrilamida:bisacrilamida:urea, por lo que pueden leerse del orden de 450 nucleótidos en el plazo de una hora mientras que esta misma longitud de secuencia necesita unas 2-4 horas en un secuenciador en gel. El tiempo necesario del proceso es, para la polimerización del mismo, unas dos horas y para la preelectroforesis, una hora aproximadamente. 21

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