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1 Comparación de metodologías para la determinación de toxinas paralizantes en bivalvos relacionadas con el Paralytic Shellfish Poisoning (PSP). Aplicación a la acuicultura en España Duración del proyecto: 3,5 años financiación para inicio actividad , período de ejecución del proyecto Prórroga de 6 meses 2012 Informe Final 23 investigadores 3 subproyectos: Andalucía L.C.C.R.P. Junta de Andalucía Cataluña Galicia IRTA (Coordinación) Departament de Salut Pública ICM CSIC CIMA INTECMAR CSIC IIM IEO Sanidad Exterior

2 Contexto y objetivos PSP Reglamento 854/2004 establece 800 μg eqstx/kg como límite máximo. Reglamento 2074/2005 establece el Bioensayo ratón (MBA) como método oficial; aunque se aceptan métodos alternativos si se demuestra su eficacia. Directiva 86/609/CEE referente a los animales de experimentación Reglamento 1664/2006 se menciona como método alternativo el HPLC con derivatización pre columna(lawrence); AOAC Nombre Abreviatura MU/μmol Toxicidad relativa (MBA) Saxitoxina STX Gonyautoxina 2 GTX Gonyautoxina 3 GTX Neosaxitoxina NEO Gonyautoxina 1 GTX Gonyautoxina 4 GTX Alexandrium tamarensis Alexandrium minutum Alexandrium catenella Alexandrium fraterculus Alexandrium fundyense Alexandrium cohorticula Alexandrium andersonii* Gymnodinium catenatum Pyrodinium bahamense Gonyautoxina 5 GTX5, B N sulfocarbamoyl gonyautoxina 2 C1, epigtx N sulfocarbamoyl gonyautoxina 3 C2, GTX Gonyautoxina 6 GTX6, B N sulfocarbamoyl gonyautoxina 1 C N sulfocarbamoyl gonyautoxina 4 C Decarbamoylsaxitoxina dcstx Decarbamoylonyautoxina 2 dcgtx Decarbamoylonyautoxina 3 dcgtx Decarbamoylneosaxitoxina dcneo, GTX7 Decarbamoylonyautoxina 1 Decarbamoylonyautoxina 4 dcgtx1 dcgtx4

3 Sector Necesidad Sector Necesidad Análisis obligatorios Aplicación de reglamentos Seguridad del producto Fiabilidad del sector Exportación ,05 Tn moluscos análisis PSP Galicia ,17 Tn moluscos > análisis PSP Cataluña 3.341,78 Tn moluscos > 300 análisis PSP Andalucía 4450 Tn moluscos > 600 análisis PSP

4 Metodologías Comparación De Métodos Métodos oficiales Oficiales / No oficiales Toxicológicios / Anticuerpos / Análiticos Cuantitativos / Cribado Bioensayo ratón HPLC con derivatización pre columna Métodos no oficiales HPLC con derivatización postcolumna LC MS/MS Kits comerciales (screening) Citotoxicidad

5 Resultados Episodios Gymnodinium catenatum aparece en el litoral atlántico de la provincia de Cádiz entre los meses de agosto y diciembre, con máximos centrados casi exclusivamente en agosto Ría/Zona Molusco Fecha prohibición Fecha apertura Total días Baiona Mejillón batea 23/06/ /07/ Camariñas Infaunal 24/06/ /07/ Vigo IV.1 Infaunal 17/06/ /06/ Vigo IV.2 Infaunal 19/02/ /03/ Vigo IV.2 Infaunal 03/06/ /07/ Vigo IV.2 Infaunal 26/08/ /09/ Especie fitoplancton Alexandrium sp. Alexandrium sp. Alexandrium sp. Alexandrium sp. Alexandrium sp. Alexandrium sp. Relación de prohibiciones por toxicidad PSP en zonas de producción de moluscos infaunales y mejillón cultivado en viveros flotantes de Galicia en el Especie de fitoplancton Molusco Ría Periodo Total días A. minutun Infaunal Ares-Betanzos junio 30 A. minutun Infaunal Camariñas julio 28 A. minutun Berberecho Baiona VIGO-IV.2 junio-septiembre 88 En la siguiente tabla se resumen los episodios de cierre debidos a toxinas PSP en Todos han sido debidos a Alexandrium minutum.

6 Resultados cultivos, muestras, exposiciones mar, exposiciones laboratorio Balones de cultivo de 8 L con Alexandrium minutum. Molusco IEO IRTA INTECMAR Almeja (blanco) Si Si Si Almeja nivel 420 µg/kg Si Si Si Almeja nivel 950 µg/kg Si Si Si Berberecho blanco Si No Si Berberecho nivel 450 µg/kg Si No Si Berberecho nivel 1270 µg/kg Si No Si Vieira (blanco) Si No Si Longueirón (blanco) Si No Si Relación de moluscos naturalmente contaminados con PSP en episodios de Alexandrium sp. Sala de challenge en la que se realizó la primera exposición en laboratorio % A.fundyense(CCMP1719) GTX4 GTX1 dcgtx3 dcgtx2 neostx STX toxinas Se muestra el perfil de toxinas y abundancia de las mismas en porcentaje para la cepa CCMP1719 de Alexandrium fundyense. X X ng μl -1 Puerto Bivalvo GTX4 GTX1 GTX2 GTX3 μg STXeq Vilanova i la Geltrú Vilanova i la Geltrú Cambrils Mejillón Ostión Mejillón Ostión Mejillón Ostión Almeja 0,62 0,16 0,37 3,23 Localización de los puntos de exposición de los bivalvos durante la floración de A. minutum ocurrida en el puerto de Vilanova i la Geltrú entre el 8 y el 11 de abril de ,66 0,24 0,24 0,01 0,02 0,48 0,14 0,24 0,01 0,03 0,01 0,01 0,01 kg ,71 849, ,91 30,55 45,90 1,46 *4.926,41

7 Resultados MBA, MIST Alert TM, cultivos celulares Bioensayo ratón: Método AOAC Official Method Paralytic Shellfish Poison. Biological Method. MIST Alert TM : Puede dar falsos positivos en valores cercanos al LMP. (Izquierda). Efecto sobre la viabilidad celular de un extracto de mejillón con dopaje de STX. (Derecha). Efecto sobre la viabilidad celular de un extracto de mejillón con dopaje de STX con paso adicional de purificación por columna C18.

8 Resultados Extracciones, LC MS/MS En la fase de preparación de muestras a partir de moluscos nos encontramos con un paso de limpieza no resuelto actualmente y que limita en gran medida la duración de las columnas además de la habitual presencia de interferentes no tóxicos. Análisis de una muestra de Argopecten purpuratus conteniendo STX, GTX2 y GTX3, por el método de LC-MS/MS Es necesario el desarrollo de métodos de preparación de la muestra adaptados a tanto a las condiciones cromatográfica (HILIC) como a las de ionización en el espectrómetro de masas (ESI), antes de que se pueda utilizar para el control rutinario de la toxicidad de bivalvos.

9 Resultados HPLC Pre Columna, HPLC Post Columna Pre Columna abreviado Aplicable con perfiles de Alexandrium en el Mediterráneo. Extracción Purificación SPE-C18 Oxidación con periodato Post Columna Andalucía Aplicable pero tiempo excesivo Análisis por HPLC-FLD AOAC HPLC Method Presencia picos No hay picos Ensayo MBA Muestra NEGATIVA

10 Resultados Aplicabilidad Tiempo Costes REVISAR DADES INTECMAR Tiempo de ejecución del ensayo /análisis por muestra. Andalucía: Laboratorio de Control de Calidad de los Recursos Pesqueros Tiempo de muestra (h) HPLC MBA HPLC Pre Jellet Pos * 3,7 12,3 2,2 Galicia: Intecmar 1,5 3,5 Galicia: Centro de Investigacións Mariñas 2,1 Catalunya: Institut de Recerca i Tecnología Agroalimentaries 1,0 0,5 Catalunya: Laboratori Salut Pública de Tarragona 2,2 1,4 Coste de ejecución del ensayo /análisis por muestra. Andalucía: Laboratorio de Control de Calidad de los Recursos Pesqueros Galicia: Intecmar Coste muestra (euros) HPLC MBA HPLC Pre Jellet Pos* 105,8 392,7 96,6 25,66/ 40,83 59,35 Galicia: Centro de Investigacións Mariñas 144,2 Catalunya: Institut de Recerca i Tecnología Agroalimentaries 116,6 47,5 Catalunya: Laboratori Salut Pública de Tarragona 249,6 118,6

11 Resultados Adecuación por Autonomías, Futuro Andalucía: Bioensayo ratón Posible HPLC Post Columna pero requerimiento de infraestructuras complejas Galicia: Bioensayo ratón HPLC Post Columna representaría incremento de costes y nuevas inversiones Cataluña: Bioensayo ratón actualmente Posibilidad en un futuro: HPLC Pre Columna como screening Secundado por Bioensayo ratón

12 Conclusiones Impacto Sector Algunas conclusiones: Consolidación de una red de laboratorios con acceso a diferentes metodologías que fortalece el potencial en España ante episodios por toxinas potencialmente conflictiivos Los perfiles toxínicos segúna las zonas de estudio pueden condicionar la eleccción de una metodología u otra adaptada a la región. La mejora e implementación de diferentes metodologías cromatográficas para el análisis de toxinas PSP aporta mayor resolución y definición de las toxinas paralizantes presentes, favoreciendo la predicción de potenciales eventos. Se identifican estrategias de screnning complementadas con protocolos de cuantificación de toxinas, y potencial aplicabilidad en Cataluña. En las otras comunidades a corto plazo no se preven cambios en cuanto a metodología de análisis. Sector: Los laboratorios de control disponen de mayores informaciones para toma de decisiones respecto a estrategias de vigilancia de toxinas PSP En circunstancias controladas los kits de Jellett podrían ser utilizados por el sector con la limitación de la existencia de algunos falsos positivos en presencia de toxinas PSP por debajo del MLP

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