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1 VARIABILIDAD GENÓMICA EN CULTIVARES DE VITIS VINIFERA DE LAS REGIONES PORTUGUESAS DOURO Y VINHOS VERDES DETERMINADA MEDIANTE MARCADORES DE TIPO MICROSATÉLITE I. Castro (1), J.P. Martín (2), J.M. Ortiz (2), J. Garrido (3), O. Pinto-Carnide (1) (1) Instituto de Biotecnologia e Bioengenharia, Centro de Genetica e Biotecnologia, Universidade de Trás-os- Montes e Alto Douro, (CGB-UTAD/IBB), Vila Real, Portugal, [icastro, olindac]@utad.pt (2) Dpto. de Biología Vegetal, Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos, Universidad Politécnica de Madrid, Ciudad Universitária s/n, Madrid, España, [juanpedro.martin, jesusmaria.ortizm]@upm.es (3) Estação Vitivinícola Amândio Galhano, Ap. 23, Arcos de Valdevez, Portugal, (jgarrido@vinhoverde.pt) RESUMEN En el presente trabajo se han estudiado 41 cultivares procedentes de las regiones portuguesas de Douro y Vinhos Verdes, utilizando 6 loci de tipo microsatélite. El número de alelos detectados en el conjunto de las variedades estudiadas varió entre 6 en el locus ssrvrzag47 y 10 en los loci VVS2 y VVMD5, existiendo un total de 50 para todos los loci analizados. La mayor frecuencia alélica fue del 54% para el alelo VVMD La combinación de los patrones obtenidos para los 6 loci permitió distinguir 39 de las 41 variedades estudiadas. La utilización de caracteres ampelográficos de forma complementaria, para una completa identificación de variedades, es altamente recomendable. También se ha confirmado la existencia de cierto número de sinonimias con variedades españolas. SUMMARY A total of 41 cultivars from Douro and Vinhos Verdes regions were studied with six microsatellite loci. The number of alleles detected in all varieties ranged from 6 in ssrvrzag47 to 10 in VVS2 and VVMD5, with a total of 50 for all the loci studied. The highest frequency for an allele was 54% for VVMD The combination of profiles for the six loci was able to distinguish 39 out of the 41 studied accessions. The use of complementary ampelographic characters for identification is highly recommended. A certain number of synonymies to Spanish varieties were confirmed. INTRODUCCIÓN La vid es uno de los cultivos tradicionales y de mayor importancia económica en Portugal. Douro y Vinhos Verdes, dos de las más importantes regiones de Denominación de Origen de Portugal, producen algunos de los más selectos vinos del mundo, únicos y con un alto valor añadido. Douro, creada en 1756, fue la primera región productora de vino establecida, y desde 2001, la zona del valle del Douro está protegida por la UNESCO como Patrimonio Mundial. Entre las distintas técnicas basadas en la PCR, los STMS (Sequence Tagged Microsatellite Sites) o simplemente microsatélites han demostrado tener un gran potencial en la identificación varietal de vid (Thomas, Scott, 1993; Bowers et al., 1996; Sefc et al., 2000;

2 Martín et al., 2003). Se trata de una técnica altamente reproducible, lo cual permite el intercambio de datos entre laboratorios; sin embargo, requiere información previa del genoma a estudiar para diseñar los cebadores específicos que flanquean el microsatélite. En el presente trabajo se han caracterizado 41 variedades de vid cultivadas en las dos regiones antes mencionadas, para lo cual se han utilizado 6 loci STMS. MATERIAL Y MÉTODOS El material vegetal se muestreó en dos colecciones localizadas en cada una de las dos regiones de estudio (Cuadro 1). La extracción del ADN se llevó a cabo utilizando el DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, Calif.). La amplificación para los 6 loci STMS [VVS2 (Thomas, Scott, 1993), VVMD5 y VVMD7 (Bowers et al., 1996), y ssrvrzag47, ssrvrzag62 y ssrvrzag79 (Sefc et al., 1999)] se realizó según Martín et al. (2003). Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis capilar en un secuenciador automático ABI PRISM 377 (PE Applied Biosystems). Dichos fragmentos se detectaron por fluorescencia y el software GENESCAN (PE Applied Biosystems) permitió asignar el tamaño de los mismos. GENESCAN-350 TAMRA (PE Applied Biosystems) se utilizó como marcador interno para estimar los tamaños de los framentos amplificados. Con los datos obtenidos, se realizó un análisis mediante UPGMA para generar un dendrograma de las 41 variedades estudiadas. En dicho análisis se utilizó una matriz de similitudes obtenida al aplicar el coeficiente simple matching sobre los datos de los 50 alelos detectados con los 6 loci STMS. Para este análisis se utilizó el paquete de programas de NTSYSpc (NTSYS, 2000). Al ser los STMS marcadores codominantes, las frecuencias alélicas y genotípicas se obtuvieron por simple conteo. La heterocigosis observada (Ho) fue calculada como el cociente entre el número de genotipos heterocigotos y el total de genotipos obtenidos para cada locus. La heterocigosis esperada (He) se calculó como He=1-Σp i 2, donde p i es la frecuencia del alelo i en la muestra estudiada para cada locus (Nei, 1987). El número efectivo de alelos (NEA) se estimó como NEA=1/Σp i 2 (Kimura, Crow, 1964). Otro parámetro que se calculó fue el contenido de información polimórfica para cada locus (Polymorphism Information Content - PIC), que nos indica la probabilidad de que un individuo sea informativo con respecto a la segregación de sus alelos, y fue calculado según Botstein et al. (1980). Asimismo, para cada uno de los 6 loci de microsatélites, se calculó el poder de discriminación (D; Jones, 1972), como la probabilidad de que dos variedades elegidas al azar puedan ser distinguidas por sus patrones de microsatélites. Este parámetro fue calculado para cada locus como D=1-C, donde C es la probabilidad de coincidencia (C = ΣP i 2, siendo P i la frecuencia de los diferentes genotipos observados en un locus). El poder de discriminación acumulado se calculó como Dt=1-Ct, donde Ct=ΠC es la probabilidad de coincidencia acumulada para los 6 loci analizados.

3 Cuadro 1. Lista de los 41 cultivares de Vitis vinifera estudiados. Se indica la región portuguesa de origen y el color de la baya (B = blanco; N = negro; R = rojo o rosa). Cultivar Color de la baya Región de origen Alfrocheiro N UTAD-Douro Alvarinho B EVAG-Vinhos Verdes Baga N UTAD-Douro Arinto Douro B UTAD-Douro Arinto B UTAD-Douro Avesso B UTAD-Douro Azal B UTAD-Douro Amaral N UTAD-Douro Amaral N EVAG-Vinhos Verdes Batoca B EVAG-Vinhos Verdes Borraçal N UTAD-Douro Brancelho N UTAD-Douro Padeiro N EVAG-Vinhos Verdes Chasselas B EVAG-Vinhos Verdes Espadeiro N EVAG-Vinhos Verdes Gouveio B UTAD-Douro Lameiro B EVAG-Vinhos Verdes Loureiro B UTAD-Douro Malvasia Fina B UTAD-Douro Bical B EVAG-Vinhos Verdes Moscatel Galego Branco B UTAD-Douro Moscatel Galego Roxo R UTAD-Douro Pedral N UTAD-Douro Pinot Blanc B UTAD-Douro Pinot Noir N UTAD-Douro Rabigato B UTAD-Douro Rabo de Ovelha B EVAG-Vinhos Verdes Sousão N UTAD-Douro Sousão Galego N EVAG-Vinhos Verdes Vinhão N EVAG-Vinhos Verdes Tália B UTAD-Douro Trincadeira N UTAD-Douro Tinta Barroca N UTAD-Douro Tinta Carvalha N UTAD-Douro Barca N UTAD-Douro Tinta Francisca N UTAD-Douro Aragonez N UTAD-Douro Tinto Cão N UTAD-Douro Touriga Franca N UTAD-Douro Touriga Nacional N UTAD-Douro Trajadura B UTAD-Douro UTAD Universidade de Trás-os-Montes e Alto-Douro EVAG Estação Vitivinícola Amândio Galhano

4 RESULTADOS El número de alelos detectado en las 41 variedades analizadas varió entre 6 en el locus ssrvrzag47 y 10 en los loci VVS2 y VVMD5 (ver Cuadro 2), con un total de 50 para los 6 loci estudiados, y una media de 8,3 alelos por locus. El alelo más abundante fue VVMD7-237, con una frecuencia del 54% (Cuadro 2). También fue éste el alelo más frecuente en un estudio similar con cultivares españoles (Martín et al., 2003). Sólo siete alelos (14%) mostraron una frecuencia superior al 25%. Por otra parte, 20 alelos (40%) presentaron frecuencias muy bajas, inferiores a 0,05 (Cuadro 2). Asimismo, se detectaron cuatro alelos únicos, dos en el locus VVMD5 (ambos en la variedad Lameiro ) y otros dos en el locus VVS2 (en las variedades Baga y Azal ). En la Fig. 1 se muestra el dendrograma que refleja las relaciones genéticas obtenidas entre las 41 variedades de vid estudiadas, el cual ha sido generado mediante un análisis de UPGMA aplicado sobre los datos de los 50 alelos detectados con los 6 loci STMS analizados. Se observa claramente que las dos accesiones del cv. Amaral, colectadas en las dos regiones de estudio, corresponden a dos variedades distintas; la accesión de la región Vinhos Verdes (EVAG) es realmente la variedad Amaral, mientras que para la de la región de Douro (UTAD) se requeriría un análisis ampelográfico para su identificación. Algo similar ocurre con Sousão y Sousão Galego. Por otra parte, Brancelho y Sousão, dos variedades tintas de origen gallego, presentan una elevada similitud entre sí, y ello también sucede, aunque algo menos, con las variedades Tinta Barroca y Touriga Franca, dos variedades tintas de Douro. Los genotipos observados en cada locus y sus frecuencias se muestran en el Cuadro 3. El número de genotipos diferentes obtenidos varió entre 13 (ssrvrzag79) y 22 (VVMD5). Para cada uno de los loci, el número de genotipos únicos osciló entre 4 (ssrvrzag79) y 12 (VVMD5), con un total de 47 para todos los loci estudiados. Veintiseis variedades presentaron al menos un genotipo específico para alguno de los loci estudiados. La combinación de los perfiles obtenidos para los 6 loci microsatélites permitió distinguir 39 patrones diferentes en las 41 variedades estudiadas. No se pudieron diferenciar mediante dichos perfiles dos parejas de muestras: Moscatel Galego Branco y Moscatel Galego Roxo por una parte, y Pinot Blanc y Pinot Noir por otra. En ambos casos, la única diferencia ampelográfica detectada fue el color de la baya. Aunque el número de alelos detectados varió entre 6 y 10, el número efectivo de alelos (NEA) osciló entre 3 para el locus VVMD7 y 6 para el locus VVMD5, con un valor medio de 4,68 (Cuadro 4). En las 41 variedades estudiadas, la heterocigosis observada varió entre el 70,7% (VVMD7) y el 90,2% (VVMD5), con una media de 83,3% (Cuadro 4). Por otra parte, la heterocigosis esperada osciló entre el 68% (VVMD7) y el 84,6% (VVMD5), con una media de 77,3% (Cuadro 4). Los valores de la heterocigosis observada siempre fueron ligeramente superiores a los de la heterocigosis esperada en los 6 loci estudiados. Asimismo, los valores de PIC obtenidos siempre fueron ligeramente inferiores a los correspondientes valores de la heterocigosis esperada, de manera que el locus más informativo fue VVMD5 (PIC = 82,8%), mientras que VVMD7 fue el marcador menos informativo (Cuadro 4). Finalmente, los valores de la probabilidad de coincidencia y el poder de discriminación obtenidos para cada uno de los 6 loci STMS, así como sus valores acumulados para el conjunto de los loci, se muestran en el Cuadro 4. El locus ssrvrzag79 muestra el valor más bajo del poder de discriminación (0,825), mientras que el locus VVMD5 presenta el valor más alto (0,936). El valor acumulado, considerando los 6 loci analizados, de dicho poder de discriminación es prácticamente del 100% (0, ), aunque en la realidad sólo se han podido diferenciar 39 de las 41 variedades estudiadas.

5 Cuadro 2. Tamaño de los alelos en pares de bases (TA) y frecuencias alélicas (FA) obtenidas en las 41 variedades de Vitis vinifera analizadas con 6 loci STMS (ssrvrzag47, VVMD5, ssrvrzag62, VVMD7, VVS2 y ssrvrzag79). La columna L indica el código de letra utilizado para designar los alelos en cada uno de los loci y que servirá para definir los genotipos en el Cuadro 3. ssrvrzag47 VVMD5 ssrvrzag62 VVMD7 VVS2 ssrvrzag79 L TA FA TA FA TA FA TA FA TA FA TA FA A 155 0, , , , , ,024 B 157 0, , , , , ,037 C 159 0, , , , , ,146 D 161 0, , , , , ,317 E 165 0, , , , , ,402 F 171 0, , , , , ,024 G 232 0, , , , ,024 H 234 0, , , ,024 I 236 0, , ,012 J 238 0, ,049 Alfrocheiro UTAD Baga UTAD Malvasia Fina UTAD Padeiro EVAG Amaral UTAD Vinhão EVAG Espadeiro EVAG Brancelho UTAD Sousão UTAD Gouveio UTAD Bical EVAG Rabigato UTAD Tinta Francisca UTAD Chasselas EVAG Alvarinho EVAG Avesso UTAD Arinto Douro UTAD Tinta Carvalha UTAD Arinto UTAD Trajadura UTAD Batoca EVAG Loureiro UTAD Pedral UTAD Amaral EVAG SousãoGalego EVAG Azal UTAD Borraçal UTAD Tinto Cão UTAD Lameiro EVAG Trincadeira UTAD Pinot Blanc UTAD Pinot Noir UTAD Rabo de Ovelha EVAG Tinta Barroca UTAD Touriga Franca UTAD Barca UTAD Touriga Nacional UTAD Moscatel Galego Branco UTAD Moscatel Galego Roxo UTAD Tália UTAD Aragonez UTAD Nivel de similitud Fig. 1. Dendrograma de las 41 variedades de vid estudiadas, generado mediante análisis de UPGMA usando la matriz de similitudes obtenida al aplicar el coeficiente simple matching sobre los datos de los 50 alelos detectados con los 6 loci STMS analizados.

6 Cuadro 3. Genotipos observados (GO) y frecuencias genotípicas (FG) en 41 variedades de Vitis vinifera analizadas con 6 loci STMS (ssrvrzag47, VVMD5, ssrvrzag62, VVMD7, VVS2 y ssrvrzag79). El código de letra de los genotipos corresponde a las combinaciones de las letras asignadas a los alelos en el Cuadro 2. ssrvrzag47 VVMD5 ssrvrzag62 VVMD7 VVS2 ssrvrzag79 GO FG GO FG GO FG GO FG GO FG GO FG AB 0,024 AB 0,098 AA 0,049 AE 0,049 AA 0,122 AC 0,049 AC 0,024 AE 0,073 AB 0,073 BB 0,293 AB 0,049 BD 0,049 AD 0,024 AG 0,024 AD 0,049 BC 0,146 AD 0,049 BE 0,024 AE 0,049 AI 0,024 AE 0,122 BD 0,049 AE 0,024 CC 0,024 AF 0,073 BB 0,049 AG 0,049 BE 0,024 AG 0,098 CD 0,073 BB 0,024 BC 0,024 BB 0,073 BF 0,049 AJ 0,024 CE 0,098 BC 0,049 BE 0,122 BC 0,024 BG 0,024 BD 0,049 CG 0,024 BD 0,220 BF 0,024 BD 0,195 BH 0,049 BE 0,024 DD 0,073 BE 0,122 BG 0,049 BE 0,049 BI 0,146 BG 0,073 DE 0,366 CC 0,024 BH 0,073 BF 0,024 CF 0,024 CF 0,049 EE 0,098 CD 0,024 BI 0,049 BG 0,049 DF 0,024 CG 0,024 EF 0,049 CE 0,049 CG 0,098 CD 0,024 DI 0,024 DE 0,049 EG 0,024 DE 0,195 CH 0,049 DD 0,049 EG 0,024 DG 0,220 EH 0,049 EE 0,073 DE 0,024 DE 0,024 EI 0,024 DH 0,024 EF 0,024 EE 0,024 DF 0,024 FI 0,024 DJ 0,024 EF 0,024 DG 0,073 GH 0,024 EG 0,024 EG 0,024 EF 0,024 GI 0,024 EH 0,024 EG 0,024 GJ 0,049 EI 0,024 FH 0,024 GG 0,024 HI 0,049 Cuadro 4. Número de genotipos observados (Go), número de genotipos posibles entre paréntesis (Gp), número efectivo de alelos (NEA), heterocigosis observada (Ho) y esperada (He), probabilidad de coincidencia (C) y poder de discriminación (D) con los 6 loci STMS analizados (VVS2, VVMD5, VVMD7, ssrvrzag47, ssrvrzag62 y ssrvrzag79) en las 41 variedades de Vitis vinifera. Locus G 0 (G p ) NEA Ho He PIC C D ssrvrzag47 15 (21) ,753 0,123 0,877 VVMD5 22 (55) ,828 0,064 0,936 ssrvrzag62 18 (28) ,768 0,087 0,913 VVMD7 16 (45) ,660 0,143 0,857 VVS2 18 (55) ,789 0,097 0,903 ssrvrzag79 13 (36) ,666 0,175 0,825 Medias -- 4,68 0,833 0,773 0, Acumulados ,17 x ,

7 DISCUSIÓN El material vegetal estudiado, procedente de dos regiones relativamente próximas situadas en el norte de Portugal, muestra una elevada variabilidad, como lo demuestra el hecho de haberse obtenido hasta 10 alelos distintos en dos de los loci analizados. El número de genotipos diferentes encontrados varió entre 13 y 22, lo cual, nuevamente, demuestra la existencia de una alta variabilidad. Por otra parte, aunque el número de alelos y/o genotipos observados nos suele indicar el grado de diversidad que puede detectar un locus STMS, el número efectivo de alelos y el PIC parecen estar directamente relacionados con el valor del poder de discriminación de un locus microsatélite. Los resultados obtenidos indican que los parámetros de NEA y PIC pueden ser usados para evaluar la utilidad de diferentes marcadores de tipo microsatélite en la caracterización de cultivares de vid. Una selección previa de aquellos loci que resulten más informativos puede reducir el tiempo y el coste necesarios para caracterizar cualquier colección de vides. Asimismo, un valor medio de heterocigosis superior al 80%, nos viene a señalar que, en la muestra analizada, el número de genotipos heterocigotos es aproximadamente 4 veces mayor que el de homocigotos, lo cual nos indica de nuevo el elevado nivel de variabilidad genética existente en dicha muestra. El dendrograma obtenido muestra la existencia de dos grupos claramente separados, uno en el que se incluyen las dos variedades de Moscatel, Galego Branco y Galego Roxo, y las variedades Tália y Aragonez, esta última sinónima de Tinta Roriz, que es el Tempranillo, extensamente cultivado en España, y por otra parte se encuentran las otras 37 variedades estudiadas. Probablemente esta separación de estos dos grupos se deba a un origen geográfico diferente de las cuatro variedades mencionadas. La existencia de dos parejas de variedades que salen iguales con los seis microsatélites utilizados y que son las dos Moscatel por una parte y los dos Pinot, Blanc y Noir por otra, es algo que ya ha ocurrido en otros estudios previos, y que responde a la marcada similitud, desde el punto de vista genético entre variedades que se diferencian solamente en el color de la baya, probablemente debido a la ocurrencia de una mutación que afecta exclusivamente a este carácter, y que resulta muy difícil de detectar mediante análisis molecular (Bowers et al., 1996). Por lo tanto, los 6 loci de microsatélites nos permiten diferenciar 39 de las 41 variedades estudiadas, sin embargo, para poder diferenciar todas las variedades se necesitaría recurrir a datos de caracterización ampelográfica. Por otra parte, se han confirmado numerosas sinonimias entre variedades portuguesas y otras españolas, previamente mencionadas en la literatura, como es el caso de Alvarinho (Albariño), Alfrocheiro (Albarín Negro), Borraçal (Caíño tinto), Gouveio (Godello), Moscatel Galego (Moscatel de Grano Menudo), Vinhão (Sousón), Pedral (Pedrol) y Trajadura (Treixadura). En cuanto a las dos regiones estudiadas, como puede apreciarse en el dendrograma, no se observa separación entre ambas, posiblemente por tratarse de variedades con origen relativamente próximo entre ellas. Del presente trabajo se puede concluir, por una parte, que tanto en la región de Vinhos Verdes como en la de Douro existe una marcada variabilidad entre las variedades existentes. Por otra, se confirma una vez más, la necesidad de completar los análisis moleculares con la determinación de caracteres ampelográficos cuando se pretende identificar variedades de vid o detectar sinonimias entre variedades.

8 AGRADECIMIENTOS This work was supported by a FCT grant (SFRH/BD/22955/2005). REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Botstein D., White R.L., Skolnick M. y Davis R.W., Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Hum. Genet., 32: Bowers J.E., Dangl G.S., Vignani R. y Meredith C.P., Isolation and characterization of new polymorphic simple sequence repeat loci in grape (Vitis vinifera L.). Genome, 39: Jones D.A., Blood samples: probability of discrimination. J. Forens. Sci. Soc., 12: Kimura M. y Crow J.F., The number of alleles that can be maintained in a finite population. Genetics, 49: Martín J.P., Borrego J., Cabello F. y Ortiz J.M., Characterization of Spanish grapevine cultivar diversity using sequence-tagged microsatellite site markers. Genome, 46: NTSYS NTSYS-PC, numerical taxonomy and multivariate analysis system. Version 2.1. Setauket, New York, U.S.A.: Exeter Publishing Ltd. Nei M., Genetic distance and molecular phylogeny. In: Population genetics and fishery management. Ryman N. y Utter F., Eds. Seattle: University of Washington Press. pp Sefc K.M., Regner F., Turetschek E., Glössl J. y Steinkellner H., Identification of microsatellite sequences in Vitis riparia and their applicability for genotyping of different Vitis species. Genome, 42: 1 7. Sefc K.M., Lopes M.S., Lefort F., Botta R., Roubelakis-Angelakis K.A., Ibáñez J., Pejic I., Wagner H.W., Glössl J. y Steinkellner H., Microsatellite variability in grapevine cultivars from different European regions and evaluation of assignment testing to assess the geographic origin of cultivars. Theor. Appl. Genet., 100: Thomas M.R. y Scott N.S., Microsatellite repeats in grapevine reveal DNA polymorphisms when analysed as sequence-tagged sites (STSs). Theor. Appl. Genet., 86: