UNIVERSIDAD VERACRUZANA

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1 UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE BIOLOGÍA GENERACIÓN DE BROTES DE Coryphantha aff. pycnacantha (Mart.) Lem, (CACTACEAE) A PARTIR DE TALLO DE PLÁNTULAS GERMINADAS in vitro TESIS QUE PARA OBTENER EL TITULO DE: LICENCIADO EN BIOLOGÍA PRESENTA: ESTEBAN FRANCISCO VENTURA DIRECTOR: DRA. BLANCA LILIA NÁDER GARCÍA XALAPA, VER JULIO 2012

2 Dedicatoria Al Gran Arquitecto del Universo por concederme la vida y permitirme adentrarme al mundo de la ciencia para tratar de entender el misterio de la vida. A mi Tía, Ángeles de la Merced Francisco, por ser guía en mi vida, agradezco tus sabios consejos, tu preocupación por mí; eres una gran persona. Te quiero y admiro mucho. A mi Tía, Justiniana de la Merced Francisco, por tu paciencia para educarme, por tu nobleza y tu fe en mí. A Juanita de la Merced Parra por la motivación que me has dado desde pequeño a superarme cada día, por tu dedicación en mí para sobresalir académicamente, eres ejemplo a seguir. Te quiero mucho. Fueron todas ustedes como una madre para mí; es invaluable el apoyo económico y moral y el cariño que me brindan, sin ustedes en mi camino tropezaría mucho para alcanzar una meta; el respaldo para poder estudiar es sin duda la mejor herencia que me han dado. Gracias por estar siempre conmigo y hacer de mí un buen hombre.

3 Agradecimientos A la Dra. Blanca Lilia Nader García por brindarme la oportunidad de trabajar en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales y aceptar ser mi directora de tesis. Agradezco la ayuda y su conocimiento vertido para que esta investigación se concluyera favorablemente. A mis sinodales, el Biólogo Roberto Ortega Ortiz y Biólogo José Facundo Ortega Ortiz, por sus observaciones y correcciones del presente trabajo a fin de que se realizara adecuadamente y sobre todo por el apoyo incondicional cuando lo solicité y por compartir conmigo sus conocimientos excepcionales sobre botánica y taxonomía. Agradezco profundamente al Biólogo Martín López del Valle por fungir, aunque no oficialmente, como Co-Director de este trabajo Recepcional. Gracias por sus consejos tan atinados. Sin duda esta investigación lleva mucho de usted. Además de su conocimiento me llevo su gran amistad. Un especial agradecimiento a mi muy querido Tío, Sergio Hernández Bello, por ser de las pocas personas que ha creído en mí. Gracias por motivarme y por tu valioso apoyo. Ten a bien saber que este trabajo también es tuyo. A mi familia: a mis hermanos y hermanas, por el cariño que han demostrado hacia mí; a cada uno de mis tíos y tías, por sus exhortaciones inteligentes y acertadas; indiscutiblemente a cada uno de mis primos y primas, ustedes forman parte de mi vida, les quiero mucho; a todos mis sobrinos, por el toque de

4 alegría que han dado a mi vida, espero servirles de ejemplo en su formación académica. El más especial agradecimiento a Fanny Ramírez Portilla, por apoyarme en toda la trayectoria de este proyecto; agradezco tus ánimos, tus palabras de aliento, tu cariño y entereza. Gracias por tu amor y comprensión. Eres mi vida. TE AMO. A los colegas, Biol. Fanny, Biol. Betty, Biol. Araceli, Biol. Fátima, Biol. Adrian y Alma, que trabajaron en el laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales. Gracias por ofrecerme su amistad. A mis grandes amigos de la vida, Román, Ángel, Toño, Demetrio, Oscar, Víctor y Santiago (Los ILLUMINATI) por generar en mí esa fuerza de voluntad para seguir adelante; es valioso conocerlos.

5 ESTE TRABAJO SE REALIZÓ EN EL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES, FACULTAD DE BIOLOGÍA, CAMPUS XALAPA, DENTRO DEL PROGRAMA: CULTIVO IN VITRO DE ESPECIES VEGETALES DE IMPORTANCIA ORNAMENTAL, MEDICINAL Y EN PELIGRO DE EXTINCIÓN Y SU VINCULACIÓN A PROCESOS PRODUCTIVOS. BAJO LA DIRECCIÓN DE LA C. DRA. BLANCA LILIA NÁDER GARCÍA.

6 RESUMEN Las semillas de Coryphantha aff. pycnacantha germinaron en medio de cultivo Murashige y Skoog (1962) (MS) adicionado con 30g/L de sacarosa, se usó 4.5g/L de Fitagel como solidificante; dicho medio de cultivo fue sin Reguladores de Crecimiento (RC). Se logró un alto porcentaje de germinación (95% de germinación total). Las plántulas germinadas in vitro presentaron buen tamaño longitudinal. Se demostró que las semillas de Coryphantha aff. pycnacantha son fotoblásticas positivas. Se realizó un barrido hormonal para la inducción a generar brotes de las plántulas en medio de cultivo MS. Mediante dicho barrido hormonal se determinó que 1.5 mg/l de Bencilaminopurina (BAP) y 0.5 mg/l de Ácido naftalenacético (ANA) son las concentraciones adecuadas para la generación de brotes en Coryphantha aff. pycnacantha obteniendo 3.64 brotes por frasco. SUMMARY Coryphantha aff. pycnacantha seeds germinated on Murashige and Skoog medium (MS) (1962) supplemented with 30 g / L sucrose was used 4.5g / L of Fitagel as solidifying, the culture medium was without growth regulators (RC). Achieved a high percentage of germination (95% total germination). Seedlings germinated in vitro showed good longitudinal size. It was shown that the seeds of Coryphantha aff. pycnacantha are photoblastic positive. It was scanned hormonal induction to generate shoots of seedlings in MS medium. By the sweep was determined that 1.5 mg / L benzylaminopurine (BAP) and 0.5 mg / L naphthaleneacetic acid (NAA) concentrations are suitable for causing outbreaks in Coryphantha aff. pycnacantha obtaining 3.64 shoots per jar.

7 ÍNDICE I. INTRODUCCIÓN... 1 II. ANTECEDENTES... 3 II.1 CULTIVO in vitro DE CACTÁCEAS... 4 II.2 CULTIVO in vitro DEL GÉNERO Coryphantha... 7 III. GENERALIDADES...10 III.1 DESCRIPCIÓN DEL GÉNERO Coryphantha...10 III.2 DESCRIPCIÓN DE Coryphantha pycnacantha...10 IV. HIPÓTESIS...13 V. OBJETIVO Y METAS...14 VI. METODOLOGÍA...15 VI.1 OBTENCIÓN DEL MATERIAL BIOLÓGICO...15 VI.2 TRATAMIENTO DE SEMILLAS DE Coryphantha aff. pycnacantha...15 VI.3 TRATAMIENTO FUNGICIDA...15 VI.4 MEDIO ASÉPTICO...16 VI.5 SIEMBRA DE SEMILLAS DE Coryphantha aff. pycnacantha...16 VI.6 ANÁLISIS ESTADÍSTICOS...17 VI.7 INDUCCIÓN A BROTES DE PLANTULAS GERMINADAS in vitro...17 VI.8 ANÁLISIS ESTADÍSTICOS...18 VII RESULTADOS...19 VII.1 DETERMINACIÓN DEL MATERIAL BIOLÓGICO...19 VII.2 TRATAMIENTO DE LIMPIEZA DEL EXPLANTE...19 VII.3 GERMINACIÓN DE SEMILLAS DE Coryphantha aff. pycnacantha...19 VII.4 INDUCCIÓN DE BROTES DE PLÁNTULAS GERMINADAS in vitro...22 VIII DISCUSIÓN...25 IX CONCLUSIÓN...28 X. BIBLIOGRAFÍA...30 GLOSARIO ANEXOS

8 I. INTRODUCCIÓN En el mundo existen diversos tipos de climas y por lo tanto; diversos ecosistemas, conformados por infinidad de organismos: desde unicelulares hasta el ser vivo más grande de la Tierra. Algunos países, a pesar de ser territorialmente extensos; tienen una biodiversidad limitada. En este sentido; México es un país privilegiado por la diversidad biológica excepcional que se distribuye en su territorio, expresada en diversos ecosistemas y numerosas especies con una amplia variabilidad genética. La complicada topografía, unida a las diferencias determinadas por la latitud y la altitud, dan como resultado un mosaico climático con un número muy grande de variantes (Rzedowski, 1978). Por lo tanto; nuestro país se ubica entre los cinco primeros países llamados megadiversos, que albergan entre 60 y 70% de la diversidad biológica conocida del planeta. La diversidad conjunta de especies de México representa aproximadamente 12% del total mundial; dicho de otra manera, 12 de cada 100 especies conocidas en el mundo se encuentran en México (CONABIO, 2006). Ramamoorthy et al. (1998) cita a Ramamoorthy y Lorence, (1987), sostienen que Más de 300 géneros y entre 50 y 60 % de las especies son endémicas del país. Por otro lado; La flora de México es considerada una de las más ricas y variadas del mundo. A ello han contribuido lo accidentado de su fisiografía, las grandes cadenas montañosas, la numerosa variedad de tipos de suelo, los amplios litorales, los altiplanos, los valles, las cuencas fluviales, etc. Presenta también, un elevado índice de endemismo, pues numerosas entidades taxonómicas son autóctonas. (Bravo-Hollis y Scheinvar, 1999) Dentro de algunas plantas suculentas, las más notables que caracterizan el paisaje de las zonas áridas de México se distingue, junto con los magueyes, los mezquites y las yucas, un fascinante grupo vegetal, la familia Cactaceae (Bravo-Hollis, 1978). Bravo-Hollis (1978), sostiene que las cactáceas, son autóctonas del Continente Americano en donde se encuentran distribuidas especialmente en las regiones áridas y semiáridas. México, por sus peculiares condiciones de latitud, topografía y climas es el país que alberga, posiblemente, la mayor cantidad de especies. 1

9 Estas plantas, se distinguen de las demás plantas por algunos de sus caracteres anatómicos y fisiológicos, tales como su estructura crasa, reducción del limbo de las hojas, hipertrofia del pecíolo hasta su transformación en un podario o tubérculo, modificación de las yemas hasta su conformación en areolas, espinación diversa y un metabolismo de tipo ácido crasuláceo (CAM) (Bravo-Hollis, 1978). En resumen, con el correr del tiempo; las cactáceas se han adaptado a los diversos tipos de vegetación señalados, y México es un importante centro de diversificación, pues alberga en su territorio el mayor número de géneros y especies, la mayoría de ellas endémicas (Bravo-Hollis y Scheinvar, 1999). Las cactáceas, por la hermosura de sus flores y formas bizarras, han sido objeto de una nefasta cactofilia. Desde el siglo pasado los traficantes de plantas, principalmente japoneses y alemanes, las han arrancado de su hábitat exportándolas por toneladas para su venta. El saqueo ha sido tan brutal que muchas de las especies están en peligro de extinción (Bravo- Hollis, 1978). Ante esta problemática; es necesario buscar alternativas desde diferentes áreas de la biología para la conservación de la biodiversidad de nuestro país y contribuir a la preservación de la diversidad biológica del planeta. 2

10 II. ANTECEDENTES La ciencia de la biología en el siglo XXI está evolucionando rápidamente porque la tecnología permite adentrarse más en la investigación tanto de campo como de laboratorio, siendo el más desarrollado en laboratorio. Dentro de la biotecnología el cultivo in vitro de tejidos vegetales es un herramienta eficiente para micropropagar especies en extinción. El cultivo de tejido es una herramienta invaluable de la Biología vegetal basada en el concepto de totipotencia y plasticidad celular, términos aplicados a que todas las células de una planta tienen la capacidad de regular la división celular y diferenciación para crecer y así regenerar una nueva planta (Teutonico y Knorr, 1984). Asimismo; mediante estas técnicas es posible lograr la micropropagación de especies en peligro de extinción, ornamentales o alimenticias, la conservación de germoplasma de especies deseables, así como la producción de colorantes, fármacos, sabores y aromas de alimentos o como mecanismo de defensa (Villalobos et al. 1991). Hurtado y Merino (1987) citaron que los primeros intentos en esta técnica fueron realizados por Sacks (1860) y Knops (1861), quienes observaron que los principales nutrientes de las plantas superiores eran sustancias inorgánicas, y prepararon una solución nutritiva que las contenía, la cual ha sido utilizada por muchos investigadores desde entonces. Por su parte, Knauss y Knauss (1979) sugirieron que uno de los problemas de mayores consecuencias en cultivo de tejidos vegetales es la contaminación bacteriana que se presenta en las etapas de multiplicación y/o enraizamiento (Hurtado y Merino, 1987). Hurtado y Merino (1987) indican que los primeros ensayos, tentativas, avances y logros en la obtención de los componentes más adecuados del medio de cultivo, condiciones ambientales y respuesta de los tejidos inoculados para la propagación de una determinada especie, se enfocó especialmente a la obtención de plantas libres de patógenos y enfermedades, propagación masiva de algunas especies de interés económico y biológico, cultivo de diversos órganos y tejidos, como meristemos, callo, óvulos, ovarios, anteras y protoplastos, así como la fusión de los últimos y la regeneración de plantas a partir de éstos, los cual nos permite realizar estudios de diferentes fenómenos morfogenéticos que por otros medios serían imposible de realizar. 3

11 Ramamoorthy et al. (1998) cita a Dougall (1979) quien sugiere que los cultivos de tejidos y células en suspensión tienen una importancia crucial en la producción de compuestos de valor comercial. Morel y Martin (1952) son los primeros investigadores que logran obtener plantas libres de virus en dalia a partir de meristemos apicales de tallo (Huratdo y Merino, 1987) Murashige y Skoog (MS) (1962) desarrollaron un medio nutritivo con el que lograron un crecimiento rápido en tejidos de tabaco. En la actualidad, las sales inorgánicas de ese medio de cultivo se usan con bastante éxito en casi todas las especies. Años más tarde; Murashige, Serpa y Jones (1974) por medio de uso de yemas apicales como inóculos iniciales, obtuvieron un método para la multiplicación masiva de Gerbera jamesonii (Huratdo y Merino, 1987). II.1 CULTIVO in vitro DE CACTÁCEAS En México; Hernández (1999) obtuvo inducción de brotes de Aporocactus flagelliformis en medio MS adicionado con 2.0 mg/l de Bencilaminopurina (BAP) y 0.1 mg/l de Ácido Naftalenácetico (ANA). Recientemente Shishkova et al. (2006) obtienen la regeneración de raíces a partir de callos de Stenocereus gummosus y Ferocactus peninsulae suplementando ANA y Bencilamino (BA). También; Cuellar et al. (2006) obtienen germinación in vitro de semillas de Hylocereus undatus, Stenocereus griseus S. queretaroensis y S. gummosus en medio MS. adicionado con BAP y Kinetina (KIN), en una proporción (2:1 miligramos/litro), como una alternativa para obtener explantes. Por su parte; Khalafalla et al. (2007). Logran la micropropagación del cactus Opuntia ficus-indica, cuando someten los explantes a diversos reguladores de crecimiento BA, AIA, ANA o IBA con diferentes concentraciones de los mismos; la aclimatación fue satisfactoria. Aíra et al. (2006), al experimentar in vitro con semillas de Notocactus magnificus puestas en medio de cultivo MS, consiguen un promedio de germinación de 13%. Posteriormente; a los 22 días, se alcanza una cifra de 26% de germinación. Inducen las 4

12 plántulas a callo para obtener brotes, experimentando con diferentes reguladores de crecimiento (BAP, KIN y AIA) en medio de cultivo MS, obteniendo un promedio de 6 brotes por explante; siendo BAP el regulador que dio mejores resultados. Logran el 45% de enraizamiento de los brotes. Se observo el 20% de sobrevivencia en el proceso de aclimatación. Por otra parte; Morales et al. (2005), obtienen una germinación in vitro que se inicia al séptimo día. El 70 % de las semillas de Stenocereus gummosus colocadas en medio de cultivo MS adicionado con BAP 2 mg/l y K (kinetina) 1 mg/l germinó, con lo cual se obtuvo la formación de callo para su posterior estudio fitoquímico, demostrando la presencia de diversos compuestos como: esteroles, flavonas, alcaloides, carbohidratos, y sesquiterpenlactonas. Acanthocereus occidentalis tuvo 90% de germinación in vitro en medio de cultivo MS con las concentraciones de Reguladores de crecimiento (BAP 2 mg/l y K 1 mg/l), lográndose así brotes múltiple de acuerdo a los resultados de Garza et al. (2005). Así también; Pérez et al. (2002) al utilizar la técnica de cultivo de tejidos vegetales logró aproximadamente el 50% de germinación in vitro de dos especies: Pelecyphora aselliformis y P. strobiliformis. Las plántulas obtenidas a partir de las semillas fueron puestas en medio de cultivo MS, experimentando con diferentes reguladores de crecimiento: (BA, N6-[2- isopentenil] adenina (2iP) y tidiazurón (TDZ) con distintas concentraciones para una producción de brotes. El regulador de crecimiento que arrojó mejores resultados fue BA. El enraizamiento de P. aselliformis fue del 89% y de P. strobiliformis el 87%. La supervivencia de las plantas una vez transferidas al suelo fue de 88% en promedio. Santos et al. (2003) al sembrar semillas de Pelecyphora aselliformis in vitro en medio de cultivo MS, consiguieron el 55% de germinación. Utilizaron las plántulas, obtenidas in vitro, para inducirlas a producción de brotes manipulando diferentes reguladores de crecimiento: BA (Benzyladenina) y K (Kinetina). BA fue el regulador de crecimiento que presentó mejor resultados observando que a los 60 días de su cultivo se obtuvieron

13 brotes por explante. A los 90 días; 3.98 brotes y a los 120 días 4.97 brotes. Se observó un sistema radical vigoroso de las raíces hasta los 10 ó12 meses. Las semillas de Mammillaria voburnensis, sembradas in vitro en medio de cultivo MS, presentaron una germinación del 80% según Ordoñez (2003); dicha germinación se dio en un rango de días posteriores a su siembra. Al suplementar 0.1 mg/l de BAP mg/l de ANA; obtuvieron un promedio de 11 brotes viables por explante a los 60 días. Asimismo; Gómez (2004) micropropaga Myrtillocactus geometrizans mediante semillas cultivadas in vitro utilizando medio de cultivo MS, el mayor porcentaje de germinación fue de 87%. Al utilizar 2.0 mg/l de BA y 0.1 mg/l de AIB; se presenta un mejor resultado para la inducción de brotes. Obtienen un 75% de formación de raíz usando 5 mg/l de AIA y de 7.0 mg/l de IBA. Finalmente; logran el 84% de sobrevivencia de las plántulas. Por su parte; Sánchez-Morán et al. (2007) quienes estudiaron a Browningia candelaris, obtuvieron el 84% de germinación y las plántulas germinadas in vitro en medio de cultivo MS, se cultivaron posteriormente en medio de cultivo con 0.5 mg/l de BA para obtener brotes. Estos brotes fueron usados para los experimentos con BA y meta-topolina (mt) a diferentes concentraciones. La mejor respuesta con BA, se observó en la concentración de 0.5 mg/l, donde se generó un promedio de 8.4 brotes por explante. El mejor tratamiento en este experimento fue el de 0.5 mg/l de mt, generando un promedio de 20.4 brotes por explante. El 86% de las plantas generadas y enraizadas in vitro sobrevivieron en suelo. Asimismo; Azcona (2009); consigue la organogénesis de Melocactus curvispinus subsp. dawsonii a partir de explantes de tallo con 2 mg/l de BAP y 0.5 mg/l de ANA. Con utilización de semillas de Mammillaria haageana subsp. elegans obteniendo el 93% de germinación. En los últimos años; Pérez (2010), experimenta con Ferocactus recurvus que al germinarse in vitro; se obtiene producción de callo. El uso de la diversidad de cortes de los explantes es un factor determinante en el cultivo in vitro en algunas especies como lo indica López (2011) en el caso de Mammillaria sartorii. 6

14 II.2 CULTIVO in vitro DEL GÉNERO Coryphantha Ruvalcaba-Ruíz et al. (2010) cita a Hernández y Godínez, (1994) quienes afirman que el nivel endémico de Coryphantha en México es muy alto y que alcanza el 83%, informan también que en nuestro país es posible encontrar 39 de las 45 especies reportadas y que se reducen en un área pequeña principalmente en los estados de Puebla y Oaxaca. Esto realza la importancia de generar investigaciones con respecto al género Coryphantha ya que varias especies están amenazadas y por ende tienden a desaparecer. Es por ello que a lo largo de los últimos años se han hecho diversos estudios, incluyendo éste, en cultivo in vitro de varias especies de Coryphantha. A pesar del interés de algunos científicos por reproducir especies de este género han sido pocos los trabajos realizados destacando los siguientes: Pérez et al. (1998), desarrollaron un sistema de micropropagación in vitro de 21 especies de cactáceas mexicanas pertenecientes a los géneros Astrophytum, Cephalocereus, Coryphantha, Echinocactus, Echiaocereus, Echinofossulocactus, Ferocactus, Mammillaria, Nyctocereus y Stenocactus. Para este estudio, utilizaron como explante las aréolas de plantas generadas in vitro y segmentos de raíces puestos en medio de cultivo MS. En cuanto a los estudios concretados en Coryphantha clavata, presentó mejor respuesta para formación de brotes: 4.73 brotes por explante, con la concentración 1mg/L de BA; C. radians presentó 4.15 brotes por explante en la concentración 1mg/L de BA y C. durangensis al combinar 1 mg/l de BA y 0.01 de ANA obtienen 4.37 brotes por explante. Obtienen un porcentaje de 90%, 85% y 90% de enraizamiento, respectivamente y un 75%, 65% y 60% de sobrevivencia, respectivamente. Por otra parte; Wakhlu et al. (2000), experimentando con Coryphantha elephantidens obtiene una producción de callo del 96%, al utilizar 9.05 µm de 2,4 ácido diclorofenoxiacético (2,4-D) y 2.3 µm de Kinetina. Inducen a brotes dicho callo adicionando al medio de cultivo MS con 2.3 µm de 2, 4-D y 6.9 µm de Kinetina, obteniendo un rango de 17 a 24 brotes. Dichos brotes presentaron 100% de enraizamiento. 7

15 En otra investigación con Coryphantha retusa realizada por Ruvalcaba-Ruiz et al. (2010), reportan alto porcentaje de germinación y determinan que de explantes de la parte apical adicionado con 2 mg/l de 6-BAP y sin ANA, se presentan 8.8 brotes por explante. Los tratamientos con las concentraciones de BAP de 2 a 3 mg/l produjeron la mayor cantidad de brotes; de 6 a 10 en los explantes de la parte lateral. Todos los brotes tuvieron buena respuesta al enraizamiento y obtuvieron 95% de sobrevivencia. Asimismo; Malda et al. (1999), sembraron semillas in vitro de Coryphantha minima en medio de cultivo MS. Las plántulas germinadas crecieron 7 veces más que una planta ex vitro de la misma edad. En la etapa de proliferación de brotes, además de alta humedad relativa y azúcar en el medio de cultivo, los reguladores de crecimiento (BA, ANA, AIA y Kinetina), demostraron una fuerte influencia en el crecimiento de los brotes. Realizaron a las plántulas análisis de intercambio de gases y actividad fotosintética comparando los resultados con plantas ex vitro. Por su parte; Smith et al. (1991), utilizaron como explante semillas de Coryphantha macromeris y germinaron in vitro en medio de cultivo MS. Para generar callo las plántulas obtenidas se colocaron en medio de cultivo MS adicionado con 44 µm de BA y 0.5 µm de 2,4-D. El callo generado se colocó en un medio de cultivo similar al anterior y obtuvieron 20 brotes por tubo. Lograron el 90% de enraizamiento de los brotes y 64% de sobrevivencia. En el 2008; Ángeles obtiene mayor producción de brotes de Mammillaria pectinifera utilizando 2.5 mg/l BAP y 1.0 mg/l ANA. Asimismo utilizando las mismas concentraciones anteriores de dichos reguladores de crecimiento alcanza brotes de Coryphantha greenwoodii. Navarro (2009), empleo dos medios diferentes para producir callo y posteriormente usó el callo para la formación de brotes siendo 1.0 mg/l de BAP y 1.0 mg/l de ANA la concentración más favorable para la producción de brotes obteniendo en promedio 3 brotes por frasco de Aztekium ritterii. Así también; al trabajar con Coryphantha borwigii obtuvo brotes mediante bajas concentraciones de BAP y ANA a partir de producción de callo. 8

16 Obtiene 70% de enraizamiento de las plántulas y 100% de sobrevivencia en el proceso de aclimatación. En este apartado queda demostrado un interés para reproducir varias especies de cactáceas mediante el cultivo de tejidos vegetales como alternativa que ofrece la biotecnología para fines diversos y mediante resultados eficientes que reportan varios autores se tiene la certeza que el cultivo in vitro es fundamental en el siglo XXI para menguar problemas ambientales en el planeta. 9

17 III. GENERALIDADES III.1 DESCRIPCIÓN DEL GÉNERO Coryphantha (Engelmann) Lemaire, Coryphantha. Nombre de un género de cactáceas que significa con flor encima de la planta. Este tipo de plantas son simples o cespitosas, de tamaño medio hasta pequeñas. Tallo globoso hasta cortamente columnar, tuberculado; tubérculos dispuestos en series espiraladas, cónicos hasta deprimidos, con la base ensanchada y más o menos poligonal. Aréolas monomorfas, la región espinífera en el ápice de los tubérculos. La florífera se extiende por el lado adaxial del tubérculo en un surco que llega a la mitad del tubérculo o hasta cerca de la axila; surco con o sin glándulas. Flores dispuestas en la base del surco de los tubérculos jóvenes cercanos al ápice: infundibuliformes; pericarpelo desnudo o con 1 o 2 escamas pequeñas, tubo receptacular corto, segmentos del perianto numerosos, de color amarillo limón, rosado o purpúreo; estambres numerosos, los primarios insertos en la base del receptáculo; floración diurna, en verano. Fruto desnudo o con 1 o 2 escamitas, jugoso, verdoso. Semillas con testa lisa, reticulada, de color castaño más o menos claro; embrión recto o curvo; perisperma presente (Bravo-Hollis y Sánchez-Mejorada, 1991). III.2 DESCRIPCIÓN DE Coryphantha pycnacantha (Mart.) Lem, Coryphantha pycnacantha (Mart.) Lem., Les Cactées, p. 35, Mammillaria pycnacantha Mart., Nov. Actorum Acad. Caes. Leop.-Carol. German. Nat. Cur. 16 (1): 325, tab. 17, Coryphantha connivens Britton y Rose, The Cactaceae 4: 34, Mammillaria andreae J.A. Purpus y Boed., Zeits. Sukk., p. 251, Coryphantha andreae (J. A. Purpus y Boed.) A. Berger, Kakteen, p. 271, El nombre común de esta especie es: Biznaguita, chichita de burro. Planta solitaria o cespitosa que forma clones. Raíz principal napiforme, cónica. Tallo de color verde azuloso o verde oscuro brillante, globoso a cortamente cilíndrico, el ápice aplanado y hundido, de ca.7 cm de longitud y 5 a 10 cm de ancho. Tubérculos algo separados entre sí, cónicos, romboides en la base. Axila sin lana. Glándulas ausentes. Espinas radiales 7 a 15, en la parte superior de la aréola, blanquecinas o amarillas, conniventes. 10

18 Las superiores 4 a 6, ascendentes, delgadas, cortas; las inferiores divergentes, hasta 1 cm de longitud, encorvadas. Espinas centrales 2 a 4, dispuestas un poco fuera del centro de la aréola, de 13 a 19 cm de longitud, subuladas, encorvadas, divergentes. Flores de color amarillo claro brillante, campanuladas, de 4 a 6 cm de longitud y de ancho en la antesis. Pericarpelo y tubo verdes, glabros. Estambres amarillos, cortos. Estilo amarillo; lóbulos del estigma 8, amarillos. Fruto blanco amarillento en la base y verde en la parte superior, subgloboso, de ca. 1 cm de ancho. Semilla de color anaranjado rojizo, obovoides, de ca. 2.2 mm de longitud; taza del hilo lateral, subbasal; testa reticulada, células con paredes anchas; superficie rugosa. Sus características son: Tipo: cerca de Tlalpan, Rose 8372, 1905 (US). Localidad tipo: México, Oaxaca, cerca de la ciudad de Oaxaca. Altitud: ca m. Florece de abril a julio y fructifica de agosto a octubre. Esta especie crece en el matorral xerófilo crasicaule con pastizales, matorral xerófilo micrófilo, en encinares abiertos y lomeríos. En la zona árida queretano-hidalguense; se encuentra en Querétaro, en San Juan del Río y en el estado de Hidalgo; en Ixquimilpan. Se distribuye en el Valle de México, estado de México, en los municipios de Tequixquiac, Zumpango, Temascalpa, Tultepec, Otumba y Atizapán de Zaragoza y en el Distrito Federal; en las delegaciones de Tlalpan y Miguel Hidalgo. Coryphantha pycnacantha es una planta ornamental cuyo fruto es comestible. Es escasa, y por lo tanto vulnerable por las actividades humanas. No está referida en la NOM-059- ECOL-2001 (SEMARNAT, 2002) (Scheinvar, 2004), pero está anexada a la Lista Roja de la IUCN de especies amenazadas (2002) y se encuentra catalogada En Peligro (Guzmán et al. 2003). Fig.1. Distribución de Coryphantha pycnacantha. Guzmán et al. (2003) Fig.2. Coryphantha pycnacantha, Dicht et al. (2003) 11

19 Fig.3. Hábitat de Coryphantha aff. pycnacantha, Frijol Colorado, Perote, VER. Fig.4. Coryphantha aff. pycnacantha en su hábitat Fig.5. Coryphantha aff. pycnacantha con frutos Fig.6. Semillas de Coryphantha aff. pycnacantha Fig.7. Flor rehidratada de Coryphantha aff. pycnacantha Fig.8. Flor rehidratada de Coryphantha aff. pycnacantha con el estigma mostrando 8 lóbulos 12

20 IV. HIPÓTESIS Ho. Las semillas de Coryphantha aff. pycnacantha germinarán produciendo plántulas en medio de cultivo MS sin reguladores de crecimiento. Ha. Ninguna semilla de Coryphantha aff. pycnacantha germinará y no producirán plántulas en medio de cultivo MS sin reguladores de crecimiento. Ho. Se obtendrán brotes de Coryphantha aff. pycnacantha por medio de Reguladores de crecimiento en plántulas germinadas in vitro utilizando el tallo como explante. Ha. No se obtendrán brotes de Coryphantha aff. pycnacantha por medio de Reguladores de crecimiento en plántulas germinadas in vitro utilizando el tallo como explante. 13

21 V. OBJETIVO GENERAL Inducir la formación de brotes de Coryphantha aff. pycnacantha a partir de plántulas germinadas in vitro utilizando el tallo como explante y a su vez conocer el porcentaje de germinación. METAS Germinar in vitro semillas para obtener plántulas de Coryphantha aff. pycnacantha. Utilizar tallo de éstas plántulas como explante alternativo. Realizar barrido hormonal que repercutan en resultados eficientes y a corto tiempo. 14

22 VI. METODOLOGÍA Los aspectos básicos de ésta metodología para el tratamiento de limpieza de las semillas fueron tomados del trabajo de López (2011); las modificaciones que se hacen en la metodología son a partir de la inducción de brotes. VI.1 OBTENCIÓN DEL MATERIAL BIOLÓGICO Coryphantha aff. pycnacantha fue colectada en la Comunidad de Frijol Colorado, Municipio de Perote, Veracruz., en noviembre La colecta fue realizada por la Bióloga Beatriz López Isabel y por el Biólogo Martin López del Valle con número de colecta 8. Debido a la dificultad para encontrar a Coryphantha aff. pycnacantha se obtuvo sólo un ejemplar el cual fue llevado al Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales de la Facultad de Biología. En este laboratorio fue sembrado en maceta con sustrato de tierra negra y tepecil, y usada como planta stock; se utilizaron las semillas de dicho ejemplar como explantes. Con el apoyo de los biólogos José Facundo Ortega Ortiz y Roberto Ortega Ortiz se trabajó en el Herbario XALU con otro ejemplar colectado para identificarlo. Debido a la falta de caracteres reproductivos se determinó a la especie como Coryphantha aff. pycnacantha. VI.2 TRATAMIENTO DE LIMPIEZA DE LAS SEMILLAS DE Coryphantha aff. pycnacantha Una vez colectados los frutos de la planta se lavaron con agua corriente y jabón Axión, posteriormente se extrajo las semillas de los frutos; se lavaron perfectamente con una solución jabonosa de detergente comercial líquido Axión y posteriormente se enjuagaron con agua corriente; todo dentro de una bolsa de tela (organza) para que las semillas no se dispersaran. VI. 3 TRATAMIENTO FUNGICIDA Después de realizar el procedimiento anterior, la bolsa de organza con las semillas, fue sometida a una solución de Agrimicin 2 g/l por 45 minutos en agitación constante con apoyo de un agitador magnético. 15

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