Análisis de la Diversidad Genética de Tomate Silvestre (Solanum lycopersicum var. cerasiforme) de México Mediante Microsatélites

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2 Análisis de la Diversidad Genética de Tomate Silvestre (Solanum lycopersicum var. cerasiforme) de México Mediante Microsatélites Alfonso Sánchez Bernal 1, Karen V. Pineda Hidalgo 1, Misael O. Vega García 1, Pedro Sánchez Peña 2, Jeanett Chávez Ontiveros 1, José Ángel López Valenzuela 1. 1 Maestría en Ciencia y Tecnología de Alimentos, Facultad de Ciencias Químico-Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria, C.P Culiacán, Sinaloa. 2 Facultad de Agronomía, Universidad Autónoma de Sinaloa, Km.17.5 Carretera Culiacán-Eldorado, C.P * Alfonso Sánchez Bernal; Tel.: (667) ; asbe23@hotmail.com / jalopez@uas.uasnet.mx; Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular. Área del Conocimiento:.Agrobiotecnología Resumen: Se determinó la diversidad genética de 14 accesiones de tomate silvestre de diferentes regiones de México utilizando 17 microsatélites. Se encontró un promedio de 5.3 alelos por locus y una diversidad genética total de 0.72, demostrando una amplia base genética de las accesiones estudiadas. Palabras Clave: Tomate; microsatélite; cerasiforme; diversidad genética Abstract: The genetic diversity of 14 wild tomato accessions from different regions of Mexico was determined using 17 microsatellites; the average number of alleles per locus was 5.3 and the total genetic diversity was 0.72, demonstrating a broad genetic basis for the accessions studied. Keywords: Tomato; microsatellite; cerasiforme; genetic diversity 1. Introducción El tomate (Solanum lycopersicum L) es una de las hortalizas de mayor importancia económica y social en el mundo. Durante su evolución y proceso de domesticación, particularmente en Europa y América del norte, las especies cultivadas de tomate han sido sometidas a cuellos de botella impuestos por la selección y cosecha de pocas especies [1]; el tomate silvestre, S. lycopersicum var. cerasiforme,

3 2 es considerado el ancestro común de las formas domesticadas. La región Andina es considerada como el centro de origen y México el centro de domesticación de esta especie, la cual es altamente invasiva y se adapta a una amplia variedad de condiciones climáticas y geográficas [2]. El uso de herramientas moleculares puede facilitar el mejoramiento del cultivo de tomate mediante la selección asistida por marcadores y de esta manera mejorar aspectos agronómicos y alimentarios, así como también facilitar el rastreo para conferir resistencia ante algunas enfermedades [3]. Es por ello que las variedades silvestres de tomate constituyen una fuente de genes útiles para el mejoramiento de las especies domesticadas, así como también para la evaluación de la diversidad entre los cultivos de una región determinada [4]. Sin embargo, no existen estudios de caracterización molecular de la diversidad genética de las poblaciones silvestres de tomate en México empleando microsatélites, solo existen reportes de la diversidad en algunas poblaciones de tomate de los estados de Michoacán y Sinaloa [5]. Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue analizar la diversidad genética molecular de accesiones de tomate silvestre de México mediante microsatélites. 2. Materiales y Métodos Materiales Se emplearon 179 individuos correspondientes a 14 accesiones de tomate silvestre (Solanum lycopersicum var. cerasiforme) colectadas en diferentes regiones de México. Métodos 1.- Extracción de ADN Se realizó de acuerdo a la metodología descrita por Tel-zur y col [6] con algunas modificaciones.

4 3 2.- Obtención de microsatélites Se siguieron las recomendaciones de Mazzucato y col [7] para la reacción en cadena de la polimerasa y se utilizaron 17 microsatélites distribuidos uniformemente en el genoma del tomate. La separación de los fragmentos obtenidos se realizó por electroforesis [8]. El gel se tiñó con una solución de bromuro de etidio (0.01 µg/ml) y los productos se digitalizaron en presencia de luz ultravioleta con un fotodocumentador Chemidoc XRS (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), utilizando el programa Quantity One (Bio-Rad) para la adquisición y análisis de las imágenes. 3.- Análisis de los datos a) Diversidad genética Se determinó la diversidad génica total (HT) de las accesiones, la diversidad génica entre individuos de una misma accesión (HS) y la diferenciación relativa entre las accesiones o coeficiente de diferenciación genética (GST) de acuerdo con Nei y Kumar [9]. Todos estos análisis se realizaron con ayuda del programa PowerMarker versión 3.25 [10]. b) Cálculo de la distancia genética y agrupamiento Se determinaron las frecuencias alélicas para cada una de las accesiones y posteriormente se obtuvo la matriz de distancia basada en el coeficiente de Rogers (1972) [10]. Con esta matriz se realizó un análisis de agrupamiento con el método UPGMA y se visualizó el dendograma correspondiente utilizando el programa NTSYSpc 2.1 [12].

5 4 3. Resultados Microsatélite Numero de Alelos Tamaño de alelos (pb) CIP AT OC TAT OCT OTA OTA OC OCT OTA OTA AAT SSR TMS SSR TMS SSR SSR Promedio Cuadro 1. Variación alélica y contenido de información polimórfica (CIP) de los microsatélites utilizados. Población Estado Color de fruto Promedio de alelos por locus Diversidad genética (Hs) Altamirano Chiapas Rojo Barras Sinaloa Rojo Camaza Sinaloa Amarillo Cartagena Chiapas Rojo Cosco Veracruz Rojo F Ruiz Chiapas Rojo Kilim Yucatán Rojo Licopenne Sinaloa Rojo Pancharosa Sinaloa Amarillo Placharosa Sinaloa Amarillo Pomparosa Sinaloa Amarillo Porvenir Oaxaca Rojo Tumbisca Michoacán Rojo Villamaza Sinaloa Amarillo Total/Promedio Cuadro 2. Diversidad genética dentro de las 14 accesiones de tomate silvestre.

6 Población Altamirano Barras Camaza Cartagena Cosco F Ruiz Kilim Licopenne Pancharosa Placharosa Pomparosa Porvenir Tumbisca Villamaza Altamirano 0 Barras Camaza Cartagena Cosco F Ruiz Kilim Licopenne Pancharosa Placharosa Pomparosa Porvenir Tumbisca Villamaza Cuadro 3. Matriz de distancia genética entre las accesiones de tomate silvestre empleando el coeficiente de Rogers [10]. Altamirano Kilim Camaza Pomparosa Placharosa Barras Cosco Cartagena Pancharosa FRuiz Tumbisca Villamaza Porvenir Licopenne Coeficiente de Rogers Figura 1. Agrupamiento de 14 accesiones de tomate silvestre (Solanum lycopersicum var. cerasiforme). El análisis de agrupamiento se realizó mediante el método UPGMA basado en la distancia de Rogers [10].

7 6 4. Discusión En el cuadro 1 se presenta el número y tamaño de los alelos amplificados para cada uno de los microsatélites utilizados, así como el contenido de información polimórfica (CIP). En conjunto los 17 marcadores detectaron un total de 88 alelos en los 173 genotipos analizados, obteniendo un rango de 3 a 9 alelos por locus y un promedio de 5.3. El tamaño de los alelos varió de 99 a 500 pb. El promedio total de alelos por locus (5.2) encontrado en el presente estudio fue superior a lo reportado para 17 variedades provenientes de un banco de germoplasma en Canadá y dos líneas parentales comerciales (2.7), pero estuvo cercano a los valores obtenidos en colecciones grandes de líneas nativas y puras (4.3 y 4.8 respectivamente) [3,12]. El valor CIP promedio de los marcadores fue de 0.68 (Cuadro 1). El marcador con menor CIP fue OCT3 (0.49), el cual permitió la amplificación de 5 alelos, mientras que el mayor valor de CIP fue de 0.82 en los marcadores AT29 y OC6, lo que corresponde con el mayor número de alelos amplificados (9). El valor CIP promedio fue superior al reportado previamente para 4 líneas S. lycopersicon var cerasiforme (0.25) y muy cercano al reportado para 8 líneas pertenecientes a diversas especies silvestres de tomate (0.64) [13]. Además del alto poder discriminatorio de estos marcadores, se encontró una asociación altamente significativa con algunas características de calidad y nutricionales, tales como firmeza, peso del fruto, acidez titulable, contenido de vitamina C y licopeno (datos no mostrados). El valor de diversidad genética total fue de 0.72 (Cuadro 2), ligeramente mayor al obtenido en accesiones de S. lycopersicon var. cerasiforme, peruvianum y chilense (0.60, 0.56 y 0.51 respectivamente) [14,15]. El promedio total de alelos dentro de las accesiones fue de 2.64 con un rango de 1.82 (Kilim) a 3.41 (Cosco). El alto valor de diversidad genética observado en el presente estudio puede deberse al hecho de que los marcadores utilizados presentaron un alto grado de polimorfismo, tal y como se reporta en un

8 7 análisis de 87 líneas en Myanmar [16] donde se atribuyó esto a la diversidad cultural en los manejos agrícolas de la región estudiada. A partir del análisis de frecuencias alélicas se construyó una matriz de distancia genética entre las 14 accesiones de tomate silvestre (Cuadro 3). En la que los valores del coeficiente de Rogers [10] entre poblaciones variaron de 0.35 (Camaza x Pomparosa) a 0.67 (Kilim x Licoppene) con un promedio de 0.50, valores similares han sido reportados para accesiones de S. lycopersicon var. cerasiforme de diversas regiones del mundo ( y ) [17,18]. El análisis de agrupamiento (UPGMA) de los datos de la matriz de distancia genética generó un dendrograma que representa en forma gráfica las relaciones genéticas entre las poblaciones (Figura 1), el cual agrupó primeramente a las accesiones Camaza y Pomparosa por presentar la menor distancia genética. La accesión Licoppene estuvo más alejada genéticamente, lo que concuerda con el hecho de que es un híbrido comercial, por lo tanto, esta población presentó el valor más alto de distancia genética al ser comparada con el resto de las poblaciones. En general, accesiones con características similares de color y forma del fruto se agruparon entre si. 5. Conclusiones El número de alelos por locus (5.2) y la diversidad genética total (0.72) encontrados en este estudio demuestran una amplia base genética de las accesiones de tomate estudiadas, representando un reservorio genético con gran potencial para ser utilizado en el mejoramiento de características de interés agroalimentario. Agradecimientos Esta investigación fue financiada por el Programa de Fomento y Apoyo a Proyectos de Investigación (PROFAPI 2011) de la Universidad Autónoma de Sinaloa.

9 8 Referencias [1] Rick CM Tomato Lycopersicon esculentum (Solanaceae). En: Simmonds NW (ed), Evolution of crop plants. Longman, London p [2] Bai Y, Lindhout P: Domestication and Breeding of Tomatoes: What have We Gained and What Can We Gain in the Future? Annals of Botany 2007, 100: [3] Mazzucato A, Papa R, Bitocchi E, Mosconi P, Nanni L, Negri V, Picarella ME, Siligato F, Soressi GP, Tiranti B, Veronesi F Genetic diversity, structure and marker-trait associations in a collection of Italian tomato (Solanum lycopersicum L.) landraces. Theor Appl Genet 116: [4] Freedman ML; Reich D; Penney KL; McDonald GJ; Mignault AA; Patterson N; Gabriel SB; Topol EJ; Smoller JW; Pato CN Assessing the impact of population stratification on genetic association studies. Nature Genetics 36: [5] Sánchez-Peña, P Estructura genética y selección de la resistencia a la mosquita blanca (Bemisia tabaci) en poblaciones de tomate silvestre. Tesis Doctoral, Universidad Nacional Autónoma de México. [6] Tel-zur, N.; Abbo, S.; Myslabodski, D.; y Mizragi, Y Modified CTAB Procedure for DNA Isolation from Epiphytic Cacti of the Genera Hylocereus and Selenicereus (Cactaceae). Plant Molecular Biology Reporter 17: [7] Wang W, Vignani R, Scali M, Cresti M A universal and rapid protocol for protein extraction from recalcitrant plant tissues for proteomic analysis. Electrophoresis 27, 2782 C [8] Nei, M. y Kumar, S Molecular evolution and phylogenetics. Oxford University Press, New York, NY, EUA 333 p. [9] Liu, K. y Muse S.V PowerMarker: Integrated analysis environment for genetic marker data. Bioinformatics 21: [10] Rogers, J.S Measures of genetic similarity and genetic distance. En: Studies in Genetics VII. University of Texas Publication 7213, Austin, TX, EUA pp [11] Rohlf, F. J., NTSYSpc 2.1 Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis Sistem. Exeter Software, Setauket. New York. [12] Solomon B, Mengyu, Zhoufei W, Hongsheng Z Assessment of genetic variation in tomato (Solanum lycopersicum L.) inbred lines using SSR molecular markers. Journal Genetics Genomics 35: [13] Frary A, Xu Y, Liu J, Mitchell S, Tedeschi E, Tanksley SD Development of a set of PCRbased anchor markers encompassing the tomato genome and evaluation of their usefulness for genetics and breeding experiments. Theoretical Applied Genetics 111: [14] García-Martínez S, Andreani L, García-Gusano M, Geuna F, Ruiz JJ Evaluation of amplified fragment length polymorphism and simple sequence repeats for tomato germplasm fingerprinting: utility for grouping closely related traditionalcultivars. Genome 49:

10 [15] Alvarez AE, Van de Viel CCM, Smulders MJM y Vosman B Use of microsatellites to evaluate genetic diversity and species relationship in the genus Lycopersicon. Theoretical Applied Genetics. 103: [16] Yi, SS; Jatoi, SA; Fujimura, T; Yamanaka, S; Watanabe, J.; Watanabe, KN Potential loss of unique genetic diversity in tomato landraces by genetic colonization of modern cultivars at a non-center of origin. Plant Breeding 127: [17] He C.; Poysa V. y Yu K Development and characterization of simple sequence repeat (SSR) markers and their use in determining relationships among Lycopersicon esculentum cultivars. Theorical Applied Genetics 106: [18] Terzopoulos P.J. y Bebeli P.J. DNA and morphological diversity of selected Greek tomato (Solanum lycopersicum L.) landraces. Scientia Horticulturae