ALINEAMIENTO DE DOS SECUENCIAS (pairwise alignment)

Transcripción

1 ALINEAMIENTO DE DOS SECUENCIAS (parwse algnment) El alneamento de una pareja de secuencas permte cuantfcar el grado de smltud que hay entre ellas y determnar s exste algún tpo de relacón entre ambas. Para alnear dos secuencas (X e Y), de longtud n y m, respectvamente, se coloca una encma de la otra de modo que el número de símbolos que concden en una msma poscón sea máxmo. S es necesaro, se pueden ntroducr huecos (ndels) en una de las secuencas para que aumente el número de concdencas. Al alnear dos secuencas, puede ocurrr que una msma poscón esté ocupada por: resduos déntcos (match): Se supone que estos resduos formaban parte de una secuenca ancestral de la que descenden ambas secuencas y que durante la evolucón han permanecdo nvarables. La conservacón de estos resduos ndca que, probablemente, desempeñan un papel mportante para el mantenmento de la estructura y/o funcón de la molécula. En un alneamento, el número de poscones ocupadas por resduos déntcos determna la dentdad entre las secuencas (sequence dentty) y se expresa en %. resduos dstntos pero con propedades boquímcas parecdas: son las denomnadas susttucones conservatvas. El número de poscones ocupadas por resduos déntcos o con propedades boquímcas smlares determna la smltud entre las secuencas (sequence smlarty) y se expresa en %. resduos dstntos (msmatch): Se supone que en esta poscón ha tendo lugar una mutacón. S desconocemos la secuenca ancestral, es mposble saber con segurdad en cuál de las dos secuencas se ha producdo la mutacón. un resduo cualquera en una de las secuencas y un ndel en la otra: Esta crcunstanca se puede deber a la nsercón de un resduo en una de las secuencas (nserton) o a la desaparcón de un resduo en la otra (deleton). Dos secuencas sempre se pueden alnear y puede haber muchos alneamentos posbles. Para determnar cuál es el mejor se utlza un sstema de puntuacón (como, por ejemplo, una matrz de susttucón) que otorga una puntuacón dstnta a cada pareja de caracteres en funcón de que sean guales (match), dstntos (msmatch) o haya un ndel. Además, en caso se que sean dstntos, se otorga a las susttucones conservatvas mayor puntuacón que a las mutacones. La puntuacón de un alneamento se calcula sumando la puntuacón de cada una de las poscones. El alneamento que obtene la mayor puntuacón se denomna alneamento óptmo. S hay más de un alneamento con la msma puntuacón máxma (o muy parecda), será tarea del nvestgador decdr cuál es el que tene mayor sgnfcado bológco. Además de la puntuacón, tambén es mportante estmar la sgnfcacón estadístca del resultado para determnar s las dos secuencas están realmente relaconadas o s su parecdo es fruto del azar. Para comparar dos secuencas se pueden usar varos métodos: El algortmo de la fuerza bruta

2 La matrz de puntos (dot-plot) Algortmos de programacón dnámca: el algortmo de Needleman-Wunsch (para alneamentos globales) y el algortmo de Smth-Waterman (para alneamentos locales) Métodos heurístcos como los algortmos FASTA o BLAST El algortmo de la fuerza bruta Este algortmo ntenta encontrar la secuenca común de mayor tamaño entre dos secuencas X e Y de longtudes m y n, respectvamente. Para ello se consderan todas las subsecuencas posbles de X (2 m ) y se comparan con todas las subsecuencas posbles de Y (2 n ). En total hay que hacer 4 m+n comparacones. S se acepta la presenca de ndels, hay que repetr los cálculos (m + n) veces para examnar la presenca de ndels en todas las poscones posbles de las dos secuencas. En la práctca, este método resulta mposble, tanto por el tempo que se necesta como por los recursos de memora que le harían falta al ordenador. Matrces de puntos (dot-plot) Este método fue descrto por vez prmera en 1970 por Gbbs y McIntyre. Es un tpo de representacón senclla que encuentra todas las concdencas exstentes entre los resduos de las dos secuencas y ofrece una panorámca rápda del parecdo que hay entre ellas. Será tarea del nvestgador determnar cuáles son relevantes y cuáles no. Debe ser nuestra prmera opcón a la hora de comparar dos secuencas ya que permte detectar rápdamente las regones smlares. Es una buena forma de asegurarse de que no vamos a pasar por alto nnguna característca obva. Aunque este método es de gran utldad cuando el parentesco entre las secuencas es lejano, es capaz de dentfcar algunas relacones complejas entre las secuencas como, por ejemplo, domnos protecos repetdos o con el orden alterado, regones palndrómcas, etc. que, de otra forma, serían dfícles de detectar.

3 Para realzar este tpo de análss, se construye una matrz en la cual se coloca una de las secuencas en la parte superor (1ª fla) y la otra en la parte zquerda (1ª columna). La matrz se va rellenando con puntos en aquellas coordenadas (vertcal/horzontal) en las que ambas secuencas contenen el msmo resduo. En muchos casos, sobre todo cuando las secuencas son de ADN, aparecen muchos puntos por smple azar y se genera mucho rudo, lo que dfculta la dentfcacón de las regones de smltud. Esto se puede corregr fáclmente medante un fltrado de los datos. Para fltrar los datos se utlzan ventanas deslzantes. Se colocará un punto (en el centro de la ventana) úncamente s entre ambas ventanas exste un número mínmo de concdencas. La ventana deslzante se defne medante dos parámetros: El tamaño de la ventana (t) (suele ser 15 para el DNA y 2 ó 3 para proteínas) La rgor (r) es el número mínmo de concdencas que debe haber entre las dos ventanas (suele ser 10 para el DNA y 2 para proteínas) para ntroducr un punto en la matrz. Es mportante selecconar correctamente los valores de estos dos parámetros para detectar las regones de nterés. En general, hay que utlzar una ventana del tamaño del elemento que quero localzar: Cuando se comparan secuencas de DNA se usan ventanas largas y rgor elevado (t = 15 y r = 11, por ejemplo) Cuando se comparan secuencas de proteínas, s no se quere usar el fltro se utlzan los valores t =1 y r = 1. Para fltrar las secuencas se usan ventanas cortas y rgor reducdo (t = 2 y r = 2 o t = 3 y r = 2, por ejemplo). Para encontrar domnos cortos con smltud parcal en secuencas que no son muy parecdas (centros actvos, por ejemplo) se usan ventanas más largas y algo más de rgor (t = 20 y r = 5, por ejemplo). Tambén es posble utlzar matrces de puntuacón. Una vez rellenada la matrz: Cualquer regón con secuencas smlares aparece como una dagonal Los ndel se manfestan como desplazamentos de la dagonal: s se compara un mrna con su DNA genómco se pueden dferencar los ntrones y los exones. La transposcón de regones del gen tambén se manfestan como un desplazamento de la dagonal Las regones repetdas aparecen como dagonales paralelas a la dagonal prncpal (s son duplcacones o repetcones drectas) o perpendculares a la dagonal prncpal (s son repetcones nversas) Las secuencas palndrómcas dan lugar a una línea perpendcular a la dagonal prncpal. Estas regones pueden corresponder a (1) secuencas reconocdas por reguladores de la transcrpcón o por enzmas de restrccón, (2) regones complementaras del DNA o del RNA que adoptan una estructura secundara (stem-loop) o (3) transposones de plantas

4 Una característca mportante de las matrces de puntos es que permten comparar una secuenca consgo msma. En este caso: Hay una dagonal de lado a lado Hay smetría respecto a esa dagonal Las líneas que aparezcan a ambos lados de la dagonal (arrba-abajo o derechazquerda) ndcan repetcones de la secuenca Las secuencas palndrómcas y las repetcones nvertdas aparecen como líneas perpendculares a la dagonal Las áreas con una elevada densdad de puntos (con aspecto de cuadrado o de rectángulo) corresponden a secuencas repetdas o a regones de poca complejdad en las que sólo están presentes unos pocos amnoácdos. Estas regones complcan los alneamentos porque orgnan alneamentos con una puntuacón nusualmente elevada. Hay programas que detectan estas secuencas y las fltran para que no sean tendas en cuenta. EL ALGORITMO DE PROGRAMACIÓN DINÁMICA El algortmo de programacón dnámca es un método computaconal que se basa en el prncpo de que para llegar a la solucón óptma de un problema se pueden utlzar las solucones óptmas de subproblemas más sencllos. Consderemos, por ejemplo, el dagrama de la fgura nferor. A cada tramo del dagrama se le asgna una puntuacón y queremos encontrar la ruta menos costosa que nos lleva desde la salda hasta la meta pasando por el punto A. Para r desde la salda hasta el punto A podemos segur 6 rutas dstntas. Análogamente, para r desde el punto A hasta la meta hay otras 6 rutas dstntas. Por lo tanto, hay 36 rutas dstntas que llevan de la salda hasta la meta pasando por el punto A. Es necesaro evaluar cada una de las 36 rutas para determnar cuál es la menos costosa? La respuesta es que no. Esta es la observacón crucal del asunto, ya que la eleccón de la mejor ruta para r desde la salda hasta el punto A es ndependente de la eleccón de la mejor ruta para r desde el punto A hasta la meta. S determnamos por un lado la mejor ruta para r desde la salda hasta el punto A y, por otro lado, la mejor ruta para r desde el punto A hasta la meta resulta que la mejor ruta para r desde la salda hasta la meta es la suma de las dos anterores. Por lo tanto, sólo es precso evaluar 12 rutas, no las 36 posbles (que es lo que haría el algortmo de fuerza bruta). El problema

5 aún se puede smplfcar más s, de manera sstemátca, dvdmos el problema en más subproblemas. El algortmo de programacón dnámca se puede utlzar para alnear dos secuencas de ácdos nuclecos o de proteínas. Resulta partcularmente mportante porque permte encontrar el alneamento óptmo ya que el problema de encontrar el alneamento óptmo entre dos secuencas de longtud n se puede dvdr en subproblemas más sencllos (encontrar el alneamento óptmo de dos secuencas de longtud n-1, n-2, etc). El algortmo de programacón dnámca permte hacer alneamentos globales (algortmo de Needleman-Wunsch) o alneamentos locales (algortmo de Smth- Waterman). Las dferencas entre un tpo de alneamento y otro son mínmas. Para saber cuál de los dos tpos de alneamento es el más apropado hay que tener claro cuál es el objetvo que se persgue (descubrr motvos estructurales parecdos, decdr s son o no membros de una msma famla o determnar s proceden de un msmo ancestro común). En funcón de este objetvo, tendré que decdr qué tpo de alneamento debo realzar (global o local), qué algortmo hay que utlzar (Needleman- Wunsch o Smth-Waterman) y qué sstema de puntuacón (la matrz de susttucón y las penalzacones por ndels) es el más apropado. Algortmo de Needleman-Wunsch para alneamentos globales En 1970, Needleman y Wunsch dseñaron el prmer algortmo para hacer un alneamento global de dos secuencas. Es un algortmo de programacón dnámca porque garantza la obtencón del mejor alneamento sn tener que realzar todos los alneamentos posbles entre las dos secuencas. Para saber cuál es el mejor alneamento de dos secuencas (X e Y) de longtud m y n, respectvamente, es necesaro defnr un sstema de puntuacón que favorezca las concdencas y penalce las dferencas y los huecos. Veamos un ejemplo: Secuenca X: GTCCTAC (longtud = m = 7) (X 1 = G, X 2 = T, X 3 = C,..., X 7 = C). Secuenca Y: GTACGTATC (longtud = n = 9) (Y 1 = G, Y 2 = T, Y 3 = A,..., Y 9 = C). Sstema de puntuacón: Concdencas = (+ 1); Dferencas = ( 1); Indels = ( 2) El algortmo se ejecuta en varas etapas: 1.- Incalzacón: se construye una matrz (m+1) (n+1). La secuenca X (, X 1, X 2,.., X m ) encabeza cada fla y la secuenca Y (, Y 1, Y 2,..,Y n ) encabeza cada columna. Cada caslla de la matrz posee unas coordenadas (, j) donde ndca el número de la fla y j ndca el número de la columna. La caslla (1,1) se rellena con un 0. Cada caslla de la prmera fla se rellena sumando a la anteror la penalzacón por ndel. Análogamente, cada caslla de la prmera columna se rellena sumando a la anteror la penalzacón por ndel.

6 2.- Rellenado de la matrz: En cada caslla (, j) se coloca el valor S (, j) que cumpla la sguente condcón: S (, j) S( = max S( S(, 1, j 1, j) j 1) 1) + ( X, Y j ) + ( X, ndel) + ( ndel, Y ) j (X,Y j ) = +1 (s concden los caracteres) ( ) (X,Y j ) = 1 (s los caracteres no concden) ( ) (X, ndel) = 2 (ndel en secuenca Y) ( ) (ndel, Y j ) = 2 (ndel en secuenca X) ( ) En la caslla (2, 2) el valor que se ntroduce es el máxmo de las tres posbldades, que son: +1 (la suma de 0 y la puntuacón de una concdenca, flecha nclnada); 4 (la suma de 2 y la puntuacón de un ndel en la secuenca Y, flecha vertcal) y 4 (la suma de 2 y la puntuacón de un ndel en la secuenca X, flecha horzontal). El valor máxmo es +1. Para las etapas sguentes hay que recordar que al valor +1 se ha llegado desde el valor 0 (se ndca medante una flecha punteada).

7 En la caslla (2, 3) el valor que se ntroduce es el máxmo de las tres posbldades, que son: 3 (la suma de 2 y la puntuacón de una dferenca, flecha nclnada), 1 (la suma de +1 y la puntuacón de un ndel, flecha horzontal) y 6 (la suma de 4 y la puntuacón de un ndel, flecha vertcal). El valor máxmo es 1. Para las etapas sguentes hay que recordar que al valor 1 se ha llegado desde el valor +1 (se ndca medante una flecha punteada). De esta forma se rellenan todas las casllas de la matrz. La puntuacón máxma del alneamento es la que aparece en la caslla nferor derecha: Retorno (traceback): Consste en encontrar la ruta que nos ha llevado a alcanzar la puntuacón máxma. En esta etapa nos serán de gran ayuda las flechas punteadas que hemos do colocando durante la etapa de rellenado. La ruta que nos ha llevado hasta el alneamento óptmo es la que aparece sombreada en color azul claro en la tabla nferor.

8 En este caso hay dos alneamentos óptmos posbles entre las secuencas X e Y, ya que en la caslla (4, 5) hay un 0 que puede provenr de la caslla (4,4) ntroducendo un ndel en la secuenca X o de la caslla (3,3), aceptando una dferenca (msmatch). Los dos alneamentos encontrados son los sguentes: G T A C G T A T C G T C C T A C (total = +1) G T A C G T A T C G T C C T A C (total = +1) En este caso será tarea del nvestgador decdr cuál de los dos alneamentos óptmos es el que tene más sentdo bológco (s es que alguno lo tene). Algortmo de Smth-Waterman para alneamentos locales En 1981, Smth y Waterman dseñaron un algortmo para hacer un alneamento local de dos secuencas. El objetvo consste en localzar pequeñas regones de smltud local en dos secuencas que, aparentemente, no guardan nnguna relacón entre sí. Estas

9 regones conservadas suelen ser mportantes para el mantenmento de la estructura y/o funcón de las secuencas. Es una versón lgeramente modfcada del algortmo de Needleman y Wunsch y, por lo tanto, tambén es un algortmo de programacón dnámca que garantza la localzacón de los fragmentos de las secuencas con mayor smltud local. Para saber cuál es el mejor alneamento es necesaro defnr un sstema de puntuacón que favorezca las concdencas y penalce las dferencas y los huecos. Veamos un ejemplo: Secuenca X: GTACGTATC (longtud = n = 9) (X 1 = G, X 2 = T, X 3 = A,..., X 9 = C) Secuenca Y: CAGTATCGT (longtud = m = 9) (Y 1 = C, Y 2 = A, Y 3 = G,..., Y 9 = T) Sstema de puntuacón: Concdencas = (+ 1); Dferencas = ( 1); Indels = ( 2) El algortmo se ejecuta en tres etapas: 1.- Incalzacón: se construye una matrz (m+1) (n+1). La secuenca X (, X 1, X 2,.., X m ) encabeza cada fla y la secuenca Y (, Y 1, Y 2,..,Y n ) encabeza cada columna. Cada caslla de la matrz posee unas coordenadas (, j) donde ndca el número de la fla y j ndca el número de la columna. Las casllas de la prmera fla y de la prmera columna se rellenan con ceros. Esta es la prmera dferenca con el algortmo de Needleman y Wunsch para hacer alneamentos globales.

10 2.- Rellenado de la matrz: En cada caslla (, j) se coloca el valor S (, j) que cumpla la sguente condcón: S (, j) S( = max S( S(, 1, j 1, j) j 1) 0 1) + ( X, Y j ) + ( X, ) ndel + ( ndel, Y j ) (X,Y j ) = +1 (s concden los caracteres) ( ) (X,Y j ) = 1 (s los caracteres no concden) ( ) (X, ndel) = 2 (ndel en la secuenca Y) ( ) (ndel, Y j ) = 2 (ndel en la secuenca X) ( ) Esta condcón es la segunda dferenca con el algortmo de Needleman y Wunsch. Al elmnar los valores negatvos susttuyéndolos por un 0, se ponen de manfesto las dversas regones de smltud local. En la caslla (2, 2) el valor que se ntroduce es el máxmo de las cuatro posbldades, que son: 0, 1 (la suma de 0 y la puntuacón de una dferenca, flecha nclnada); 2 (la suma de 0 y la puntuacón de un ndel en la secuenca Y, flecha vertcal) y 2 (la suma de 0 y la puntuacón de un ndel en la secuenca X, flecha horzontal). El valor máxmo es 0. Para recordar que a este valor se ha llegado desde la caslla (1,1) colocamos una flecha punteada. De esta forma se rellenan todas las casllas de la matrz. La puntuacón máxma del alneamento puede aparecer en cualquer caslla. En este caso es un 5 (caslla sombreada en azul claro).

11 3.- Rastreo (traceback): Consste en encontrar la ruta que nos ha llevado a alcanzar la puntuacón máxma. En esta etapa nos serán de gran ayuda las flechas punteadas que hemos do colocando durante la etapa de rellenado de la matr<. La ruta que nos ha llevado hasta el alneamento óptmo es la que aparece sombreada en la tabla nferor. Tambén se ha sombreado en color amarllo otra ruta que corresponde a otro posble alneamento local que no es el óptmo, ya que sólo ha alcanzado una puntuacón de 4. Por tanto, el alneamento local óptmo entre las secuencas X e Y (sombreado en color azul claro) es el sguente: C A G T A T C G T G T A C G T A T C Hay otro alneamento local con una puntuacón de 4, que requere la adcón de un ndel en una de las secuencas:. C A G T A T C G T G T A C G T A T C Será tarea del nvestgador decdr cuál es el que tene más sentdo bológco (s es que alguno de ellos lo tene). No olvdemos que los alneamentos son modelos matemátcos que se ajustan a un sstema de puntuacón arbtraro que puede reflejar en mayor o menor grado la realdad bológca.