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- Alberto Aranda Rodríguez
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52 HO PGF 2α AAc O O OOH COOH COX-1 COX-2 COOH PGG 2 O COOH PGI 2α HO COOH OH O TxA 2 COOH O O OH H 2 O PGFS O TxAS O OH COOH PGIS PGH 2 PGDS mpges-1 mpges-2 cpges COOH HO O HO OH OH COOH PGD 2 OH COOH HO OH PGE 2 HO O OH TxB 2
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95 Tabla 1: Características clínicas, demográficas y factores de riesgo, de los individuos con AAA y NA incluidos en el estudio. Medidas Niveles mrna Niveles TNFα plasma Características AAA NA AAA Controles Número Diámetro aórtico (mm) a 66± ± SD (<55 mm) 13 (14.6%) - 14 (17.7%) - MD ( mm) 43 (48.3%) - 40 (50.6%) - LD ( 70 mm) 33 (37.1%) - 25 (31.6%) - Edad (años) 71.1± ± ± ±3.0 Hombres 87 (97.8%) 16 (64%) 75 (94.9%) 34 (87.2%) Diabetes mellitus 19 (21.3%) 2 (8%) b 21 (26.6%) 1 (2.6%) Hipertensión 63 (70.8%) 2 (8%) b 60 (75.9%) 14 (35.9%) Dislipemia 54 (60.7%) 2 (8%) b 51 (64.6%) 1 (2.6%) Hábito tabáquico No fumadores 7 (7.9%) 21 (84%) b 8 (10.1%) 30 (76.9%) Fumadores activos 26 (29.2%) 3 (12%) b 19 (24.1%) 6 (15.4%) Ex fumadores c 56 (62.9%) 1 (4%) b 52 (65.8%) 3 (7.7%) Cardiopatía isquémica 20 (22.4%) 0 b 22 (27.9%) 0 Angina de pecho 2 (2.2%) 0 b 4 (5.1%) 0 Infarto de miocardio 6 (6.7%) 0 b 6 (7.6%) 0 Cirugía revascularización coronaria d 12 (13.5%) 0 b 12 (15.2%) 0 Insuficiencia renal crónica e 34 (38.2%) 0 b 23 (29.1%) 0 Diálisis 0 0 b 0 0 Enfermedad arterial periférica 48 (53.9%) 0 b 45 (57%) 0 Ausencia de pulsos 31 (34.8%) 0 b 30 (38%) 0 Claudicación intermitente 17 (19.1%) 0 b 15 (19%) 0 Enfermedad cerebrovascular 7 (7.9%) 1 (4%) b 7 (8.8%) 0 Accidente vascular cerebral 4 (4.5%) 1 (4%) b 5 (6.3%) 0 Ataque isquémico transitorio 3 (3.4%) 0 b 2 (2.5%) 0 EPOC f 26 (29.2%) 0 b 17 (21.5%) 0 Tratamiento con antiagregantes 47 (53.4%) 1 (4%) b 48 (61.5%) 0 Tratamiento con estatinas 57 (64%) 0 b 58 (73.4%) 7 (17.9%) Tratamiento con IECAs (g) 23 (20.7%) 0 b 24 (30.8%) 6 (15.4%) Tratamiento con AINEs (h) 6 (6.7%) 0 b 3 (3.8%) 0 Tratamiento con corticoides 6 (6.7%) 0 b 4 (5.1%) 0 Tratamiento con inmunosupresores 4 (3.5%) 0 b 2 (2.5%) 0 Las variables nominales se presentan como números y porcentajes (%) y las variables continuas como mediana ±DE. (a) Diámetro transversal máximo medido en mm: SD Small Diameter, MD Moderate Diameter y LD Large Diameter. (b) En algunos casos y debido a la naturaleza de las muestras de aorta sana, algunas de las características clínicas pueden no estar recogidas y existe riesgo de infravaloración de las mismas.. (c) Ex fumadores: abandono del Tabaco de >1 año. (d) Mediante cirugía convencional o tratamiento endovascular. (e) Filtrado glomerular estimado (egfr) <60 ml/min/1.73 m 2. (f) Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica. (g) IECAs: Inhibidores Enzima Conversora Angiotensina. (h) AINEs: Anti Inflamatorios No Esteroideos.
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100 TABLA 2: Transcritos determinados (mrna) MARCADORES CELULARES Y CITOCINAS VÍA PGE 2 METALOPROTEINASAS VE-Cadherin TIE-1 vwf enos VEGFR-2 CD45 CD68 FLAP BTL-1 NAP-2 VEGF-A VEGFR-1 VEGFR-2 α-actina COX-1 COX-2 mpges-1 EP-1 EP-2 EP-3 EP-4 MMP-2 MMP-9
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103 Tabla 3: anticuerpos y diluciones utilizados Antígeno reconocido Tipo Dilución Proveedor Técnica de análisis COX-2 Policlonal de conejo 1/50 Cayman ABC-POD EP2 Policlonal de conejo 1/1000 Cayman ABC-POD EP3 Policlonal de conejo 1/400 Cayman ABC-POD EP4 Policlonal de conejo 1/100 Cayman ABC-POD mpges-1 Policlonal de conejo 1/50 Sigma ABC-POD vwf Monoclonal de ratón 1/35 Dako ABC-POD CD45 Monoclonal de ratón - Dako ABC-POD Fluorescencia CD68 Monoclonal de ratón - Dako ABC-POD Fluorescencia MMP-2 Monoclonal de ratón 1/15 Abcam ABC-POD Fluorescencia MMP-9 Policlonal de conejo 1/15 Abcam ABC-POD Fluorescencia α-actina Policlonal de conejo 1/200 Abcam Fluorescencia ABC-POD: Avidina biotin
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112 3 *** mrna Log 10, relative to -actin ** * * * -1 VE-Cadherin NA AAA VEGFR-2 vwf TIE-1 enos
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114 * * * mrna normalized median VE-Cadherin VEGR-2 vwf TIE-1 enos media 0.0 NA SD MD LD Aorta diameter
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117 mrna Log 10, relative to -actin *** ** *** * *** -2-3 FLAP NA AAA BTL-1 CD45 CD68 NAP-2
118 1.0 # * 1.0 * # * 0.8 * * 0.8 * * mrna normalized median FLAP BTL-1 CD45 CD68 NAP-2 media mrna normalized median FLAP BTL-1 CD45 CD68 NAP-2 media 0.0 NA SD MD LD Aorta diameter 0.0 NA SD MD LD Aorta diameter
119 mrna Log 10 relative to -actin * NA AAA * -1 VEGF-A VEGFR-1 VEGFR-2
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121 Tabla 2.1: Niveles de transcrito de VEGF-A y de sus receptores en muestras de AAA estratificadas según los factores de riesgo cardiovasculares y enfermedades de base. El número de pacientes de cada grupo se ha indicado previamente en la tabla 1 y los datos se expresan relativos a β-actina x1000. VEGF-A Mediana Percentil 25º-75º Valor p vs ausencia a No fumadores Fumadores No insuficiencia renal Insuficiencia renal No hipertensión Hipertensión No diabetes mellitus Diabetes mellitus No Dislipemia Dislipemia No EPOC b EPOC VEGFR-1 No fumadores Fumadores No insuficiencia renal Insuficiencia renal No hipertensión Hipertensión No diabetes mellitus Diabetes mellitus No Dislipemia Dislipemia No EPOC b EPOC VEGFR-2 No fumadores Fumadores c No insuficiencia renal Insuficiencia renal No hipertensión Hipertensión No diabetes mellitus Diabetes mellitus d No Dislipemia Dislipemia No EPOC b EPOC (a) Mann-Whitney Rank Sum Test. (b) EPOC: Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica. (c) Se encontró p=0.06 aplicando Mann-Whitney Rank Sum Test; tras transformación logarítmica se obtuvo una distribución normal y se encontró p=0.032 aplicando t-student. (d) Tras transformación logarítmica se obtuvo una distribución normal y se encontró p=0.233 aplicando t-student.
122 χ
123 Tabla 2.2: χ 2 Análisis de los factores de riesgo y enfermedades asociadas. Variables EPOC Fumadores activos HTA χ 2 =1.494 χ 2 =3.371 p=.222 p=.066 EPOC p=.004 χ 2 =8.464 Fumadores activos Diabetes mellitus Dislipemia Diabetes Mellitus χ 2 =1.801 p=.180 χ 2 =.0006 p=.981 χ 2 =.0326 p=.857 Dislipemia χ 2 =.0318 p=.859 χ 2 =.082 p=.775 χ 2 =.0009 p=.976 χ 2 =2.55 p=.110 Insuficiencia Renal χ 2 =4.448 p=.035 χ 2 =9.952 p=.002 χ 2 =1.223 p=.269 χ 2 =.04 p=.842 χ 2 =.003 p=.957 HTA: Hipertensión arterial EPOC: Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica
124 2 VEGFR-1 2 VEGFR mrna Log 10, relative to -actin VEGFR-2 R=0.300; p= R=0.364; p= VEGFR R=0.614; p= mrna vwf Log 10, relative to -actin R=0.643; p= mrna a-actin Log 10, relative to -actin α
125 2 VEGFR-1 2 VEGFR mrna Log 10, relative to -actin VEGFR-2 0 R=0.328; p= VEGFR R=0.410; p= mrna CD45 Log 10, relative to -actin -1 R=0.395; p= mrna CD68 Log 10, relative to -actin
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128 mrna Log 10 relative to -actin NA AAA MMP-2 *** *** MMP-9
129 400 median 25 th percentile 75 th percentile 160 P=0.07 P= mrna MMP-2 relative to -actin * * * mrna MMP-9 relative to -actin * * 0 0 NA SD MD LD Aorta diameter NA SD MD LD Aorta diameter
130 NA x600
131 AAA b AAA b x100 x400 Figura 3.5: Detalle inmunotinción para MMP-2 en VSMC capa media de muestras de AAA. AAA AAA x600 x400
132 mrna vwf Log 10, relative to -actin R=0.407; p= mrna -actin Log 10, relative to -actin R=0.509; p= mrna CD68 Log 10, relative to -actin R=0.276; p= mrna CD45 Log 10, relative to -actin R=0.252; p= mrna MMP-2 Log 10, relative to -actin mrna MMP-2 Log 10, relative to -actin
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135 Figura 3.10: Detalle inmunotinción para MMP-9 capa media, en muestras de AAA.
136 mrna vwf Log 10, relative to -actin mrna -actin relative to b-actin mrna CD68 relative to b-actin R=0.604; p= mrna MMP-9 Log 10, relative to -actin mrna CD45 relative to b-actin R=0.279; p= mrna MMP-9 Log 10, relative to -actin
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140 Tabla 3.1: Niveles de transcritos de MMP-2 y de MMP-9 en muestras de aorta aneurismática (AAA) estratificadas en función de los factores de riesgo cardiovasculares. El número de pacientes de cada grupo se ha mostrado previamente en la Tabla 1. Los datos se expresan relativos a β-actina x1000. MMP-2 Median 25 th -75 th percentile p value vs no-factor a No fumadores Fumadores <0.001 No insuficiencia renal Insuficiencia renal No hipertensión Hipertensión No diabetes mellitus Diabetes mellitus No Dislipemia Dislipemia No EPOC b EPOC MMP-9 No fumadores Fumadores No insuficiencia renal Insuficiencia renal No hipertensión Hipertensión No diabetes mellitus Diabetes mellitus No Dislipemia Dislipemia No EPOC b EPOC (a) (b) Mann-Whitney Rank Sum Test. EPOC: Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica.
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144 3 mrna Log 10 relative to -actin *** *** * NA AAA COX-1 COX-2 mpges-1
145 18 median 25 th percentile 75 th percentile mrna COX-1 relative to -actin * * * mrna COX-2 relative to -actin * * * 0 NA SD MD LD NA SD MD LD Aorta diameter Aorta diameter β
146 a b
147 b
148 2 COX-1 2 COX mrna Log 10, relative to β -actin COX COX mrna vwf Log 10, relative to β-actin mrna α-actin Log 10, relative to β-actin 2 COX-1 2 COX mrna Log 10, relative to β -actin COX-2 R=0.670; p= COX mrna CD45 Log 10, relative to β-actin mrna CD68 Log 10, relative to β-actin
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151 mrna mpges-1 Log 10, relative to -actin mrna vwf Log 10, relative to -actin R=0.522; p= R=0.718; p= mrna -actin Log 10, relative to -actin mrna mpges-1 Log 10, relative to -actin mrna CD45 Log 10, relative to -actin mrna CD68 Log 10, relative to -actin Figura 4.11: Correlación entre la expresión de mpges-1 y los marcadores de diferentes estirpes leucocitarias.
152 5 median 25 th percentile 75 th percentile mrna mpges-1 relative to -actin NA SD MD LD Aorta diameter
153 2 1 *** *** *** mrna Log 10 relative to -actin NA AAA -4 EP-1 EP-2 EP-3 EP-4
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156 100 EP-1 EP-2 EP-3 80 EP-4 % of mrna relative to -actin MVEC VSMC
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158 mrna EP-4 Log 10, relative to -actin -1 2 R=0.552; p= mrna CD45 Log 10, relative to -actin -1 2 R=0.329; p= mrna CD68 Log 10, relative to -actin R=0.449; p= R=0.439; p= mrna vwf Log 10, relative to -actin mrna -actin Log 10, relative to -actin
159 10 median 25 th percentile 75 th percentile 8 mrna EP-4 relative to -actin 6 4 * * * 2 0 NA SD MD LD Aorta diameter
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162 Tabla 4.1. Transcrito de isoenzimas COX y de mpges-1 en muestras de AAA estratificadas según factores de riesgo y enfermedades concomitantes. El número de pacientes de cada grupo se indica en la tabla 1 (Material y Métodos), los datos se expresan relativos a β-actina x1000. COX-1 Mediana Percentil 25º-75º Valor p vs ausencia a No fumadores Fumadores No insuficiencia renal Insuficiencia renal No hipertensión Hipertensión No diabetes mellitus Diabetes mellitus No Dislipemia Dislipemia No EPOC b EPOC COX-2 No fumadores Fumadores No insuficiencia renal Insuficiencia renal No hipertensión Hipertensión No diabetes mellitus Diabetes mellitus No Dislipemia Dislipemia No EPOC b EPOC mpges-1 No fumadores Fumadores No insuficiencia renal Insuficiencia renal No hipertensión Hipertensión No diabetes mellitus Diabetes mellitus No Dislipemia Dislipemia No EPOC b EPOC c (a) (b) (c) Mann-Whitney Rank Sum Test. EPOC: Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica. Se encontró p=0.06 aplicando Mann-Whitney Rank Sum Test; tras transformación logarítmica se obtuvo una distribución normal y se encontró p=0.057 aplicando t-student.
163 Tabla 4.2. Niveles plasmáticos de PGE 2 en muestras de AAA estratificadas según factores de riesgo y enfermedades concomitantes. El número de pacientes de cada grupo se indica en la tabla 1 (Material y Métodos). Niveles de plasma de PGE 2 se expresan en pg/ml. Mediana Percentil 25º-75º Valor p vs ausencia a Plasma-PGE 2 No fumadores Fumadores No insuficiencia renal Insuficiencia renal No hipertensión Hipertensión No diabetes mellitus Diabetes mellitus No Dislipemia Dislipemia No EPOC b EPOC (a) (b) Mann-Whitney Rank Sum Test EPOC: Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica.
164 Tabla 4.3. Transcrito de niveles de receptores PGE 2 en muestras de AAA estratificadas según factores de riesgo y enfermedades concomitantes. El número de pacientes de cada grupo se indica en la tabla 1 (Material y Métodos). los datos se expresan relativos a β-actina x1000. EP-2 Mediana Percentil 25º-75º Valor p vs ausencia a No fumadores Fumadores No insuficiencia renal Insuficiencia renal No hipertensión Hipertensión No diabetes mellitus Diabetes mellitus No Dislipemia Dislipemia No EPOC b EPOC EP-3 No fumadores Fumadores No insuficiencia renal Insuficiencia renal No hipertensión Hipertensión No diabetes mellitus Diabetes mellitus No Dislipemia Dislipemia No EPOC b EPOC EP-4 No fumadores Fumadores No insuficiencia renal Insuficiencia renal No hipertensión Hipertensión No diabetes mellitus Diabetes mellitus No Dislipemia Dislipemia No EPOC b EPOC (a) Mann-Whitney Rank Sum Test (b) EPOC: Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica
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