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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 knúmero de publicación: kint. Cl. 7 : C12N 7/00 C12N /10 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 knúmero de solicitud europea: k Fecha de presentación: k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Utilización de linfocitos transformados con virus herpes saimiri en un procedimiento para la multiplicación de virus del tipo HIV que causan inmunodeficiencia. 30 kprioridad: DE k Titular/es: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT Brüningstrasse Frankfurt am Main, DE k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Nick, Sigrid; Fickenscher, Helmut; Biesinger-Zwosta, Brigitte; Jahn, Gerhard y Fleckenstein, Bernhard k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Elzaburu Márquez, Alberto ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 1 ES T3 2 DESCRIPCION Utilización de linfocitos transformados con virus herpes saimiri en un procedimiento para la multiplicación de virus del tipo HIV que causan inmunodeficiencia. Se ha visto en los últimos años que la infección por virus del tipo HIV que causan inmunodeficiencia representa un problema serio, en cuya solución se investiga intensamente. Se ha descubierto en el marco de los trabajos de investigación en todo el mundo que la enfermedad de inmunodeficiencia, que se denomina SIDA, no está causadaporunúnico virus que pertenece a los virus de RNA, sino que la enfermedad es causada por al menos dos grandes grupos de virus HIV. Los diferentes agentes tienen una elevada variabilidad genética, y la mayoría se pueden clasificar en uno de los grupos ya conocidos de virus HIV. Puesto que los virus HIV no disponen de un metabolismo propio, la reproducción se lleva a cabo en el laboratorio con la ayuda de líneas celulares con fines de investigación o diagnóstico. Se conocen diferentes líneas celulares para la reproducción de los virus del tipo HIV causantes de inmunodeficiencia. Sin embargo, se ha descubierto que las diferentes cepas de virus o aislados virales, en particular aquellos que proceden de pacientes seropositivos asintomáticos, no se pueden reproducir o lo hacen muy difícilmente en las líneas celulares conocidas. Por ello, los virus de este tipo se hacen crecer frecuentemente en cultivos primarios de linfocitos, que se deben preparar de nuevo en cada ocasión. El rendimiento en virus que se obtiene en este caso es bajo y las propiedades de reproducción de las células primarias varían. La misión de la presente invención es, por tanto, poner a disposición un procedimiento para la replicación de virus del tipo HIV causantes de inmunodeficiencia, con el cual se puedan replicar en particular las cepas de HIV o los aislados clínicos primarios que se reproducen débilmente. El procedimiento según la invención se caracteriza porque los virus se replican con la ayuda de linfocitos transformados con virus Herpes saimiri. El virus Herpes saimiri induce los linfomas de células T de diferentes especies de monos del Nuevo Mundo y en conejos. Frecuentemente el virus Herpes saimiri se encuentra en monos ardilla sudamericanos (Saimiri ciureus), pero no es patógeno. Cepas del virus Herpes saimiri, subgrupo C, transforman de manera eficaz linfocitos humanos procedentes del timo o de la sangre periférica de donantes humanos en líneas celulares T que se reproducen continuamente (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 89, páginas , abril 1992). Los linfocitos utilizables en el marco del procedimiento según la invención son preferiblemente linfocitos que proceden del timo humano, de la sangre periférica humana o de la sangre del cordón umbilical humano. Es posible producir linfocitos apropiados, por ejemplo, aislando las células con ayuda de centrifugación por gradientes de densidad con Histopaque (1,1 g/ml; Pharmacia), para obtener células mononucleares, que se estimulan a continuación con fitohemaglutinina P. Por otra parte, en el caso de obtención a partir de la sangre, los eritrocitos se pueden separar por sedimentación con dextrano, y los leucocitos se pueden sedimentar del sobrenadante. Los timocitos se obtienen de tejido de timo triturado, que se obtiene normalmente de niños a los que se ha sometido a una operación de corazón. Células estimuladas y no estimuladas se hicieron crecer en recipientes apropiados de cultivo con una densidad de 1x10 6 células por ml, y se inocularon con 10 4 a10 6 dosis infecciosas de virus Herpes saimiri. Las células estimuladas con fitohemaglutinina se complementaron adicionalmente con interleuquina 2 recombinante (0 U/ml). Se examinó laformación de virus infecciosos mediante el co-cultivo de los linfocitos con células renales de mono. Las células tienen estructuras en su superficie, que poseen determinadas funciones tal como, p. e., diferentes receptores. Estas estructuras superficiales se utilizan para la identificación de las células. Se ha encontrado ahora, que líneas celulares de este tipo son particularmente apropiadas para la replicación de virus del tipo HIV, que tienen en la superficie la llamada molécula CD4 +. Dentro del marco del procedimiento según la invención se utilizan preferiblemente células transformadas con virus Herpes saimiri, que se seleccionan del grupo formado por las siguientes líneas celulares: PB-W, CB-1 y Lucas (PNAS, 89, páginas , abril 1992) o PB-M, CB- 23 y Kesting (Simmer, B., Berthold, S., Biesinger, B., Müller-Fleckenstein, I., Kalden, J., Platzer, E., Fleckenstein, B., manuscrito en preparación). De manera particularmente ventajosa, el procedimiento según la invención se puede utilizar para la replicación de virus de tipo HIV que sólo se replican muy difícilmente. Algunas cepas causan considerables dificultades para su cultivo en el laboratorio. Esto es especialmente válido para las cepas que proceden de pacientes que no tienen ningún síntoma clínico, pero que son seropositivos. El presente procedimiento representa un sistema de cultivo muy ventajoso para virus causantes de inmunodeficiencia. Las células linfoides humanas, transformadas con virus Herpes saimiri, que son CD4-positivas, son muy sensibles a la infección con los prototipos de cepas de HIV HIV- 1 IIIB yhiv-2 ROD, y producen entonces grandes cantidades de virus. Estas líneas celulares son muy particularmente apropiadas para la replicación de aislados de HIV-2, que tienen un limitado espectro celular y proceden de pacientes asintomáticos. Además, las células transformadas con virus Herpes saimiri ofrecen ventajas si se co-cultivan con células de linfocitos donantes procedentes de sangre periférica. En el co-cultivo se hacen crecer los linfocitos que se han aislado de un donante, que preferiblemente es HIV positivo, junto con otras células o líneas celulares. Las células transformadas con virus Herpes saimiri muestran una replicación mejorada si se ponen en contacto

3 3 ES T3 4 con linfocitos alogénicos procedentes de sangre periférica. Este mecanismo se podría controlar mediante las interacciones de las moléculas CD2 ycd8, ypodría elevar la producción de HIV. Se pudieron mantener las líneas celulares transformadas con virus Herpes saimiri de manera estable durante al menos un año, y no se pudo detectar ninguna eliminación de virus Herpes saimiri infecciosos. Se parte del hecho, por tanto, que el virus HIV no induce la producción de virus Herpes saimiri. El procedimiento según la invención es particularmente útil para la replicación de virus HIV en grandes cantidades, en particular de aislados de HIV-2 procedentes de pacientes asintomáticos. Se estableció lalínea celular Jurkat (sinónimo JM) en 1976, a saber de un paciente con este nombre. Se cultivóensangredeunmuchachode14 años con leucemia aguda de linfocitos T (ALL). Esta línea celular T se cultiva en suspensión, produce después de su estimulación interleuquina-2 y lleva los típicos marcadores de superficie de las células T (CD2, CD3, CD4, CD, CD6, CD7, CD34, CD4, TCR β). Jurkat se utiliza como modelo que se puede cultivar de forma sencilla para células T humanas en numerosos trabajos de biología celular y de bioquímica. La línea celular ha sido descrita, entre otros, por Pawelec et al. (Eur. J. Immunol. 12: , 1992). Ejemplo 1 Se investigaron diferentes líneas celulares que expresan la molécula CD4. Se utilizó comocon- trol la línea celular P1084, que ciertamente expresa la molécula marcadora de la superficie CD8, pero no la molécula CD4. Se infectó cadacultivo de 4 x 10 6 células con 1 ml de suspensión de virus de HIV-1 IIIB sin células (Popovic et al., Science, 224, páginas , 1984), HIV-2 ROD (Clavel et al., Nature, 324, páginas , 1986) o HIV- 2 NEP (Nick, S., Häfner, Y., Diniz, C. A., Jahn, G., Detection of HIV infection in a Nepalese individual, AIFO en prensa, 1993), como se describe con más detalle en Böhm et al., Cytometry, 13, páginas , 1992, y se sembraron en placas de cultivo celular. Las actividades de la transcriptasa inversa (RT) de las suspensiones que se utilizaron para la infección eran de cpm/ml para HIV- 1 IIIB, cpm/ml para HIV-2 ROD y cpm/ml para HIV-2 NEP. Para determinar la replicación de HIV en estos cultivos, se midió la actividad de la transcriptasa inversa en los sobrenadantes de los cultivos (Böhm et al., Cytometry, 13, páginas , 1992). Recientemente se ha aislado la cepa vírica HIV-2 NEP de un paciente nepalés asintomático. Este aislado se replica solamente en células MOLT-4 clon 8 y en linfocitos del cordón umbilical. Hasta ahora habían falladotodos los intentos de infectar otras células T o líneas de macrófagos, incluso aunque se utilizara una elevada dosis infecciosa. Además, se investigó, si las células transformadas con virus Herpes saimiri pueden sustituir a los linfocitos primarios en el aislamiento del virus. Se separaron los linfocitos del paciente y se cocultivaron directamente con CB-1 o células Kesting. Demaneraalternativaaesto,lascélulas del paciente se estimularon previamente con OKT-3 (Ortho Diagnostic Systems GmbH, Neckargemünd) durante tres días (Eberlein et al., Virus Res., 19, páginas , 1991). De forma paralela a esto, se aisló HIV-1 mediante una técnica estándar de co-cultivo de linfocitos (Eberlein et al., op. cit.). Se midió la producción de virus HIV-1 mediante la detección del antígeno p24, a saber en los sobrenadantes del cultivo los días 14, 21 y 28. Las cepas tipo HIV-1 IIIB yhiv-2 ROD se replicaron sobre todas las líneas celulares transformadas con virus Herpes saimiri, que llevan el marcador de superficie CD4 y que causaron la muerte de la célula en el espacio de 16 días. Los resultados de las investigaciones se representan en las figuras 1 y 2. La línea celular de control P-1084, que no tiene el marcador de superficie CD4, no era susceptible de infectarse con HIV-1 o HIV- 2 ROD y sobrevivió. Las líneas celulares Kesting y CB-1 produjeron las mayores cantidades en HIV-1 IIIB yhiv-2 ROD. Aunque las líneas celulares transformadas con virus Herpes saimiri, que estaban infectadas con HIV-2 NEP, no mostraron ninguna variación citopática, se encontraron elevadas actividades de transcriptasa inversa en los sobrenadantes de todas las líneas celulares, que llevan el marcador celular CD4. En este caso se trata de las líneas celulares Kesting, Lucas, CB- 1, CB-23 y PB-M. Los resultados se representan en la figura 3. La actividad de la transcriptasa inversa, que se liberaba de las células CB-23, era inclusomayorquelaqueseliberabadelalínea celular MOLT-4 clon 8. Los resultados muestran que las células transformadas con el virus Herpes saimiri, que tienen el marcador celular CD4 +,representan un sistema muy productivo para virus del tipo HIV-2 que en otro caso crecerían sólo débilmente. Ejemplo 2 Además se investigó si las líneas celulares CB- 1 y/o Kesting pueden reemplazar a los linfocitos aislados de la sangre del cordón umbilical para el aislamiento inicial de virus HIV-1. Se cocultivaron linfocitos de la sangre periférica de cuatro donantes con síntomas de inmunodeficiencia junto con linfocitos de la sangre del cordón umbilical, que estaban estimulados con OKT-3 o con CB-1, o con líneas celulares Kesting. Los resultados se exponen en la siguiente Tabla 1. En dos casos (donantes H. F. R. y A. T.) tuvo éxito el aislamiento de HIV-1 sólo en co-cultivos estándar de linfocitos (L/L). Por el contrario, en los cultivos del paciente B. K. H. se pudieron medir elevadas cantidades de p24 en cultivos de CB-1 (L/CB- 1) y en cultivos de Kesting (L/Kesting) después de 2 semanas; mientras que el co-cultivo estándar de HIV-1 daba sólo después de 2 semanas un resultado positivo. Además de esto, la cantidad del antígeno viral producido era diez veces mayor en las líneas celulares CB-1 y Kesting. Se aisló dos veces virus HIV del paciente D. P. con un intervalo de seis semanas. Primero se cocultivaron directamente los linfocitos del donante procedentes de sangre periférica con células CB- 1 y Kesting. En el segundo experimento se estimularon previamente los linfocitos de la sangre periférica con OKT-3 y entonces se co-cultivaron 3

4 ES T3 6 (O/L/CB-1; O/L/Kesting). El sistema de cultivo convencional y las células CB-1 tuvieron éxito en un grado similar. El aislamiento sobre células Kesting únicamente tenía éxito si se utilizaban linfocitos previamente estimulados procedentes de la sangre periférica. En resumen, se puede deducir que, aunque el resultado de aislamiento del HIV-1 era heterogéneo, en dos casos el uso de células transformadas con virus Herpes saimiri era superior al procedimiento estándar. TABLA 1 Replicación de aislados recientes clínicos de HIV-1 con células transformadas con virus Herpes saimiri Paciente Cultivo p24 p24 p24 [pg/ml] [pg/ml] [pg/ml] Día 14 Día 21 Día 28 H.F.R. L/L L/CB L/Kesting B.H.K. L/L L/CB L/Kesting D.P. L/L L/CB L/Kesting D.P. L/L O/L/CB O/L/Kesting A.T. L/L O/L/CB O/L Kesting L/L: Técnica estándar de co-cultivo de linfocitos (Eberlein et al., Virus Res. 19, páginas , 1991) L/CB-1; L/Kesting: Co-cultivo directo de linfocitos de pacientes de sangre periférica y células CB-1 o Kesting O/L/CB-1; O/L/Kesting: Co-cultivo después de 3 días de estimulación previa con OKT- 3. Los resultados obtenidos en los ensayos se representan en las siguientes figuras. La figura 1 muestra la replicación de HIV-1 IIIB en líneas celulares T transformadas con virus Herpes saimiri. Se infectaron 4x10 6 células con 1 ml de HIV-1 IIIB, que contenían una suspensión de cpm/ml en actividad de transcriptasa inversa, como se describe en Böhm et al., Cytometry, 13, páginas , Se ensayaron muestras del sobrenadante del cultivo para la actividad de la transcriptasa inversa en los tiempos indicados. La figura 2 muestra la replicación de HIV- 2 ROD en las líneas celulares T transformadas con virus Herpes saimiri. La actividad de la transcriptasa inversa de la suspensión de HIV-2 ROD, que se utilizó para la infección, era de cpm/ml. La figura 3 muestra la replicación de HIV- 2 NEP en las líneas celulares T transformadas con virus Herpes saimiri. La actividad de la transcriptasa inversa de la suspensión de HIV-2 NEP,quese utilizó para la infección, era de cpm/ml

5 7 ES T3 8 REIVINDICACIONES 1. Procedimiento para la reproducción de virus causantes de inmunodeficiencia del tipo HIV, caracterizado porque los virus se replican con la ayuda de linfocitos transformados con virus Herpes saimiri. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque los linfocitos humanos se transforman con virus Herpes saimiri, con virus Herpes del grupo C o del grupo no A-no B. 3. Procedimiento según una de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque los linfocitos son CD4-positivos. 4. Procedimiento según una de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque los linfo citos humanos proceden del timo, sangre periférica, sangre del cordón umbilical, nódulos linfáticos, vasos linfáticos, bazo o médula ósea.. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque los virus causantes de la inmunodeficiencia del tipo HIV proceden de pacientes seropositivos asintomáticos. 6. Procedimiento según una de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque los linfocitos transformados con virus Herpes saimiri se co-cultivan con otras células. 7. Procedimiento de linfocitos transformados con virus Herpes saimiri, que se utilizan en un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, para la replicación de virus causantes de inmunodeficiencia de tipo HIV NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluída en la mencionada reserva.

6 6 ES T3

7 ES T3 7

8 8 ES T3

11 Número de publicación: 2 208 435. 51 Int. Cl. 7 : A61K 31/255. 72 Inventor/es: Baumgart, Joachim. 74 Agente: Curell Suñol, Marcelino

11 Número de publicación: 2 208 435. 51 Int. Cl. 7 : A61K 31/255. 72 Inventor/es: Baumgart, Joachim. 74 Agente: Curell Suñol, Marcelino 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: 2 8 43 1 Int. Cl. 7 : A61K 31/2 A61P 37/06 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: 009799.2 86 Fecha

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11 knúmero de publicación: 2 121 469. 51 kint. Cl. 6 : A47J 27/022

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11 kn. de publicación: ES 2 038 571. 51 kint. Cl. 5 : C12P 21/08

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11 kn. de publicación: ES 2 075 426. 51 kint. Cl. 6 : B60C 9/22. k 73 Titular/es: Compagnie Generale des. k 72 Inventor/es: Delias, Alain

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11 kn. de publicación: ES 2 076 749. 51 kint. Cl. 6 : B23F 15/06

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11 Número de publicación: 2 210 964. 51 Int. Cl. 7 : B28C 5/18. 72 Inventor/es: Cerutti, Carlo. 74 Agente: Curell Suñol, Marcelino

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