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1 Redalyc Sistema de Información Científica Red de Revistas Científicas de América Latina, el Caribe, España y Portugal Kairiyama, Claudia;Benhaim, Marcela;Buresti, Patricia;Citatti, Sergio;Pengue, Claudia;Perroni, Nancy;Pittaluga, Sergio;Tonelli, María C. Detección de VIH proviral por nested-pcr utilizando metodología casera (in house) Bioquímica y Patología Clínica, Vol. 71, Núm. 1, -, 2007, pp Asociación Bioquímica Argentina Argentina Disponible en: Bioquímica y Patología Clínica ISSN (Versión impresa): Asociación Bioquímica Argentina Argentina Cómo citar? Número completo Más información del artículo Página de la revista Proyecto académico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto

2 REVISTA BIOQUIMICA Y PATOLOGIA CLINICA VOL 71 Nº Trabajo: págs Pág 49 Detección de VIH proviral por nested-pcr utilizando metodología casera (in house) Claudia Kairiyama 1 Marcela Benhaim 2 Patricia Buresti 3 Sergio Citatti 4 Claudia Pengue 5 Nancy Perroni 6 Sergio Pittaluga 7 María C. Tonelli 8 1 doctora en farmacia y bioquímica 2 bioquímica, Jefa de Laboratorio del Hospital Interzonal Eva Perón 3 bioquímica 4 bioquímico 5 bioquímica 6 licenciada en química 7 bioquímico 8 bioquímico Lugar de Trabajo: Laboratorio Central, Hospital Interzonal de Agudos Eva Perón, San Martín, Provincia de Buenos Aires Enviar Correspondencia a: Marcela Benhaim, Helguera 4445, C 1419 CUK Buenos Aires, , RESUMEN En este trabajo se estudió la sensibilidad de un método de detección de VIH proviral basado en una metodología de PCR anidada cualitativa como ayuda diagnóstica para infección por VIH neonatal. Para ello se estudiaron treinta pacientes con serología positiva VIH, con bajo recuento de linfocitos CD4 y, como control de número de copias capaces de detectar, se utilizó la línea linfoidea 8E5. Se amplificó por nested PCR dos regiones específicas del gen gag VIH. Como control de purificación y estado de conservación de la muestra se amplificó una región del gen constitutivo de β-globina. En los treinta casos se obtuvo amplificación gen gag de VIH para las dos regiones y para el control de β-globina y, para la línea 8E5, se obtuvo positividad para las tres bandas aun en el caso de sólo diez copias de VIH proviral. Se demuestra un alta sensibilidad para esta metodología in house, que la hace apta para su aplicación en diagnóstico pediátrico a un costo accesible para instituciones públicas. Palabras claves PCR anidada, sensibilidad, controles, diagnóstico, infección VIH SUMMARY We studied the sensibility of a proviral HIV detection method, based in a qualitative nested PCR methodology, as a neonatal HIV infection diagnostic tool. 30 hiv infected patients with low CD4 lymphocytes count were monitored and we used the 8E5 lymphoid line to control the number of copies capable of detection. Two specific regions of gag gene of HIV were amplified by nested PCR. For control of purification and preservation state of the sample we amplified a region of β-globin constitutive gene. All cases were positive for amplification of two regions of gag HIV gene and for control of β-globin, and with only 10 copies of proviral HIV, we found three positive bands in the 8E5 cellular line. This in house methodology, thus demonstrates a high sensibility, making it capable for application in pediatric diagnosis with an accessible cost in public institutions. Keywords nested PCR, sensibility, controls, diagnosis, HIV infection Revista ByPC. Incorporada al Latindex. ISSN Código Bibliográfico: RByPC Trabajo Recibido: Aceptado:

3 Detección de VIH proviral por nested-pcr utilizando metodología casera (in house) Introduccion: Es conocida la dificultad para arribar al diagnóstico de infección por VIH en niños menores de dieciocho meses, ya que la posible presencia de anticuerpos maternos no permite realizar técnicas serológicas, lo cual hace necesario el uso de técnicas de detección viral. Entre ellas, la PCR es la técnica más sensible y específica para la detección viral en lactantes. La prueba de antígeno p 24 disociado es desaconsejable para ser usada aisladamente para descartar infección y los cultivos virales resultan inaccesibles, debido a su complejidad, riesgo de contaminación y tiempo requerido para su correcta evaluación (1,2). En nuestro laboratorio se puso a punto una técnica casera (in house), casera, para la detección cualitativa de VIH proviral mediante una técnica de reacción en cadena de polimerasa PCR anidada (3). El objetivo de nuestro trabajo es estudiar la sensibilidad de este método mediante su aplicación en pacientes infectados con bajo conteo de células T CD4 y el uso de una línea linfoidea 8E5 con número de copias de VIH proviral conocidas como control. Metodo: Se estudiaron treinta pacientes VIH positivo con bajo rango CD4 entre 0 y 195 cél/μl. Como control de número de copias (1 genoma por cél) de DNA HIV proviral, se utilizó una línea linfoidea 8E5 (ATCC CRL- 8993) y se realizaron diluciones de 0, 1, 10,100 y 1000 células resuspendidas en un millón de linfocitos normales. La purificación de ADN genómico se realizó con columnas QiaGen a partir de 200 μl de buffy-coat, con citrato como anticoagulante, ó células resuspendidas en buffer fosfato salino. Se amplificaron dos regiones específicas del gen gag del VIH en dos pasos (fig. 1). Se utilizaron como primers externos JA4gag y JA7gag ; y como primers internos JA5gag , JA6gag , SK431gag y SK462gag (4,5) y (tabla 1). La amplificación que resulta de la nested PCR con los primers JA4, JA7y JA5, JA6 da una banda 131 bp y con los primers JA4, JA7 y Sk431,SK462 da una banda de 142 bp. Como control de purificación y estado de conservación de la muestra se amplificó una región del gen constitutivo β-globina con los primers GH20 y PC04 (210 bp). Los primers fueron sintetizados por Operon Biotechnologies. Se utilizó la enzima Hot Start de Fermentas y un ciclador Perkin Elmer Gene Amp PCR System 2400, donde se realizaron las dos amplificaciones sucesivas, para lo cual primero se activó la enzima durante cinco minutos a 95ºC y luego se cicló treinta veces: desnaturalización 30 seg. a 94º C, annealing 30 seg. a 41ºC y extensión 30 segundos a 72ºC. Las bandas específicas de amplificación se visualizaron al UV en un gel de agarosa 3%, teñido con Bromuro de etidio. El recuento de linfocitos CD4/CD8 se realizó por Citometría de Flujo (EPICS) Coulter, utilizando anti CD8FITC, anticd4 PE y anticd3 PC. En todos los casos se realizaron controles de calidad externo del Ministerio de Salud Pública de la Provincia de Buenos Aires, del PEEC y del Círculo Rioplatense de Citometría de Flujo. Resultados: En todos los casos 30/30 pacientes se observó amplificación para las dos bandas específicas del gen gag y para la banda control de β-globina (Figura 2 y Tabla 2). Para la línea celular 8E5 se obtuvo positividad para las tres bandas, aun en el caso de sólo diez copias de VIH proviral totales (Figura 3 y Tabla 2). En general se visualizó una intensidad mayor en la banda obtenida luego del la Nested con los primers SK431-SK462. Discusion: Según la clasificación propuesta por el CDC en 1994 y las recomendaciones emanadas de Ministerio de Salud de la Tabla 1: Oligonucleótidos para la detección de VIH por PCR. Primer Secuencia 5-3 Gen y localización JA 4 GAAGGCTTTCAGCCCAGAAG gag JA5 ACCATCAATGAGGAAGCTGC gag JA6 TATTTGTTCCTGAAGGGTAC gag JA7 TCTCCTACTGGGATAGGTGG gag SK462 AGTTGGAGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT Gag SK431 TGCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTCT Gag GH20 GAAGAGCCAAGGACAGGTAC β-globina PC04 CAACTTCATCCACGTTCACC β- Globina

4 REVISTA BIOQUIMICA Y PATOLOGIA CLINICA VOL 71 Nº Trabajo: págs Pág 51 Tabla 2: Resultados de las nested PCR`s en muestras de treinta pacientes VIH positivos con recuento de CD4/ul sangre entre 195-0, y en células 8E5 resuspendidas en 1x10 6 linfocitos normales (*). Las intensidades de las bandas específicas visualizadas en el gel de agarosa se especifican de la siguiente manera: (+++) muy fuerte, (++) fuerte, (+) regular, (+/-) baja y (-) nula. CD4 cel / ul β-globina gag Nested JA5-6 gag Nested SK / / / / /- +/ /- +/ Cél. 8E5 β-globina gag Nested JA5-6 gag Nested SK * * Nación, en niños nacidos de madre VIH positiva la infección por VIH se determina según los siguientes criterios: 1.- En menores de dieciocho meses: dos resultados positivos de PCR y/o aislamiento viral y/o antígeno p24 en sangre en dos muestras diferentes. 2.- En mayores de dieciocho meses: serología repetidamente positiva por métodos de tamizaje y confirmación por WB o IFI o con los criterios mencionados en 1. Considerando las técnicas recomendadas para menores de dieciocho meses, que es el motivo de nuestra preocupación, la determinación de antígeno p24 tiene una sensibilidad de aproximadamente un 45%, que la hace inaplicable para ser usada de manera aislada. El aislamiento del VIH por cultivos virales sigue siendo hoy en día una técnica de referencia con adecuada sensibilidad y especificidad, absolutamente necesaria cuando se necesita establecer la fenotipificación VIH, pero su empleo queda restringido a laboratorios muy bien equipados con complejos sistemas de contención biológica (nivel P3) y, por lo tanto, inaccesible para numerosos centros asistenciales. La técnica más ampliamente usada en centros de salud es la reacción en cadena de la polimerasa por tener una adecuada sensibilidad y especificidad y oportunidad en la entrega de resultados, a diferencia de la técnica de cultivo. En el caso de la PCR, el grado de estandarización de estas pruebas, así como la disponibilidad de reactivos, es desigual. La estandarización de ensayos caseros es en general laboriosa debido al número de variables que deben ajustarse

5 Detección de VIH proviral por nested-pcr utilizando metodología casera (in house) Figura 1: Esquema de los oligonucleótidos específicos para gag HIV-1 empleados en las nested PCR s. para su óptimo funcionamiento. Existen reactivos comerciales para PCR diagnóstica de VIH-1, pero sus precios siguen siendo muy elevados, ya que también incluyen el costo de la aparatología que sólo puede ser utilizado para esos kits. También es una dificultad real en el uso de técnicas PCR la falta de criterios internacionalmente aceptados en la validación de resultados, por lo que debe considerarse en forma escrupulosa cada caso clínico en particular. En un estudio anterior efectuado entre los años 2001 y 2003 en nuestro Hospital sobre la metodología de VIH PCR casera empleada en este trabajo, evaluamos en ciento cuarenta casos la sensibilidad clínica de este ensayo, analizados según el Test de Bayes. Ciento ocho casos corresponden a niños menores de dieciocho meses nacidos de madres portadoras del VIH, otros dieciocho casos eran pacientes adultos con más de un ELISA VIH positivo pero WB indeterminado, nueve de pacientes con sintomatología y clínica sospechosa pero serología negativa; y cinco casos provenientes de accidente laboral relacionado con fuente VIH positiva. De los ciento ocho casos pediátricos analizados, se obtuvieron amplificación específica de la región gag en seis casos (5,6 %); de estos seis casos, 5/6 provenían de niños cuyas madres y neonato no habían recibido profilaxis antirretroviral (ARV) o la habían recibido de manera incompleta. De dieciocho casos con serología por WB indeterminado, catorce (77/%) resultaron positivos por esta metodología siendo pacientes con SIDA en etapa terminal, y de los otros cuatro casos, tres eran mujeres en período de embarazo o puerperio. De nueve pacientes con sintomatología y clínica sospechosa pero serología negativa, sólo uno (11%) resultó positivo por esta técnica. En todos los casos de PCR negativa, luego se demostró una etiología no relacionada con VIH o ausencia de infección por VIH. Finalmente, los cinco casos provenientes de exposiciones ocupacionales arrojaron resultados negativos. La sensibilidad en ese estudio resultó del 100 % y la especificidad diagnóstica mayor del 95 %, por lo que representó una herramienta de suma utilidad como ayuda diagnóstica en casos de VIH pediátricos y WB indeterminado. No se registraron casos de falsos negativos. A pesar de que los resultados previos sobre la utilidad clínica de esta metodología fueron realmente alentadores, en este nuevo trabajo nos abocamos a desarrollar controles de sensibilidad que nos permitieran fijar los límites de detec- Figura 2: Detección de VIH-1 proviral en sangre de pacientes infectados con bajo recuento de CD4. Electroforesis en gel de agarosa 3% de productos esperados del segundo round de PCR, 131bp (nested JA5/JA6) y 142bp (nested SK431/SK462). Calle: 1) control VIH-1 positivo, 2) 0 CD4/ul, 3) y 4) 3 CD4/ul, 5) 6 CD4/ ul y 6) 49 CD4/ul. Figura 3: Detección de copias de VIH-1 proviral en células linfoideas 8E5 por nested PCR. Electroforesis en gel de agarosa 3% de productos esperados del segundo round de PCR, 131bp (nested JA5/JA6) y 142bp (nested SK462/ SK431); y PCR de B-Globina 260bp. Calles: 1) control VIH-1 positivo, 2) 1 copia, 3) 10 copias, 4) 100 copias, 5) 1000 copias y 6) 0 copias de VIH-1 proviral 8E5.

6 REVISTA BIOQUIMICA Y PATOLOGIA CLINICA VOL 71 Nº Trabajo: págs Pág 53 ción en cuanto a número de copias virales y a la presencia de células CD4 en los pacientes investigados. Está ya demostrado que los principales blancos para infección por VIH son los linfocitos T helpers CD4. (6), aunque no todas las subpoblaciones presentan la misma susceptibilidad. Los linfocitos TH1 serían menos proclives a la infección viral que los TH0 y TH2 (7 y 8) y, en cambio, los linfocitos CD4 de memoria son más susceptibles (9). A pesar de que los linfocitos CD4, como vemos, son los principales blancos para la infección viral, otras células también están involucradas, como por ejemplo macrófagos y células dendríticas (10 y 11). Por la especial importancia de las células CD4 en la progresión de la infección, pareció oportuno probar la respuesta de nuestra metodología casera frente a pacientes con valores muy diversos de células CD4. Los resultados obtenidos demuestran que aun en uno de los dos casos en que no se detectaron en sangre células CD4, obtuvimos una positividad franca en las bandas y, en el otro, una positividad débil. La línea celular usada en este trabajo como control del límite de detección de la PCR nested fue la 8E5 de origen humano, de estirpe linfoblástica, que contiene un solo genoma defectivo proviral de VIH por célula. Pudimos comprobar que nuestra técnica tiene un límite de detección adecuado, ya que se detectó positividad a partir de 10 copias de HIV proviral por muestra. Comparando con técnicas comerciales (13), la performance de nuestra técnica in house demostró ser sensible, rápida y confiable para la detección de infección por VIH y su puesta en marcha nos permitió mejorar el diagnóstico clínico en aquellos casos en que los métodos serológicos son inaplicables. Bibliografía: 1. Ministerio de Salud de la Nación. Recomendaciones para el diagnóstico y tratamiento de VIH SIDA en Pediatría, Ministerio de Salud de la Nación. Recomendación para la Prevención de la transmisión perinatal de VIH. Unidad Coordinadora Ejecutora VIH/SIDA/ETS Argentina, noviembre de Kairiyama C., Canella V., Corazza R., Tonelli C., Pallone E. y Benhaim M. Aplicación de HIV DNA PCR in house como ayuda-diagnóstico de infección por HIV. Ponencia presentada a las Jornadas de Actualización Científica del Hospital Eva Perón de San Martín, noviembre de Albert, Jan Fenyo, Eva Maria. Simple, Sensitive, and Specific Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 in Clinical Specimens by Polimerase Chain Reaction with Nested Primers, Journal of clinical microbiology, July 1990, pp Kwok, Shirley Sninsky, John. PCR Detection oh Human Immunodeficiency Virus Type 1 Proviral DNA Sequences, en David H. Persing et al. edd. Diagnostic Molecular Microbiology. Principles and Applications. American Society for Microbiology, 1993, pp Klatzmann D., Barre Sinoussi M.T., Nugeyre C., Dauquet E., Vilmer C., Griscelli F., Brun-Vezinet C., Rouzioux J., Gluckman J., Chermann J. Selective tropism of lymphadenopathy-associated virus for helper-inducer T-lymphocytes, Science 225 (1984), Clerici M., Balotta C., Moroni L., Ferrario E., Riva C., Trabattoni D., Rodolfo A., Villa M., Shearer G., Moroni M., Galli M. Type I cytokine production and low prevalence of viral isolation correlate with long-term non-progression in HIV infection AIDS, Res Hum Retro 12 (1996), Maggi E., Mazzetti M., Ravina A.,Annunziato F., de Carli M., Piccinni P., Manetti R., Carbonari M., Pesce A., del Prete G., Romagnani S. Ability of HIV to promote a TH1 to TH0 shift and to replicate preferentially in TH2 and TH0 cells, Science 265 (1994), Adleman L., Wofsy D., T cell homeostasis: implications in HIV infection, J AIDS 6 (1993) Gartner S., Markovitz D., Kaplan M., Gallo R., Popovic, M. The role of mononuclear phagocytes in HTLV-III/LAV infection, Science 233 (1986), Patterson S., Knight S. Susceptibility of human peripheral blood dendritic cells to infection by human immunodeficiency virus J, Gen Virol 68 (1987), , 12. Kabamba-Mukadi, Benoît 1 ; Henrivaux, Philippe 2 ; Ruelle, Jean 1 ; Delferrière, Nicole 1 ; Bodéus, Monique 1, Goubau, Patrick. Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) proviral DNA load in purified CD4+ cells by LightCycler Real-time PCR. BMC Infect Dis. 2005; 5: 15. Agradecimientos: Agradecemos especialmente a la doctora Moira Vignoles del Centro Nacional de Referencia para el SIDA, Facultad de Medicina UBA, por proveernos de los controles de 8E5.

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