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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Int. Cl. 7 : C12N /49 A61K 31/70 A61K 48/00 C12N /67 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación : Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: Título: Genes sintéticos de HIV. Prioridad: US 182 P GB Titular/es: Merck & Co., Inc. 126 East Lincoln Avenue Rahway, New Jersey 0706, US 4 Fecha de publicación de la mención BOPI: Inventor/es: Shiver, John, W.; Davies, Mary-Ellen; Freed, Daniel, C.; Liu, Margaret, A. y Perry, Helen, C. 4 Fecha de la publicación del folleto de la patente: Agente: Carpintero López, Francisco ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, Madrid

2 Genes sintéticos de HIV. DESCRIPCIÓN Referencias cruzadas con las solicitudes relacionadas Esta es una solicitud no provisional relacionada con el Documento de los Estados Unidos con Nº de Serie / , presentado el 22 de Febrero de Campo de la invención Vacunas HIV Antecedentes de la invención 1. Infección por HIV El Virus-1 de la Inmunodeficiencia humana (HIV-1) es el agente etiológico del síndrome de inmuno deficiencia humana adquirida (SIDA) y los transtornos relacionados. El HIV-1 es un virus ARN de la familia Retroviridae y presenta la organización LTR-gag-pol-env-LTR3 de todos los retrovirus. De manera adicional, el HIV-1 comprende un puñado de genes con funciones regulatorias o desconocidas, que incluyen los genes tat y rev. El gen env codifica la envoltura de glicoproteína vírica que se traduce en forma de un precursor de 1 kilodalton (kda) (gp1) y que a continuación se rompe mediante una proteasa celular para dar como resultado la envoltura de glicoproteína (gp1) externa de 1 kda y la envoltura de glicoproteína (gp41) transmembrana de 41 kda. Gp1 y gp41 permanecen asociadas, y se despliegan sobre las partículas víricas y la superficie de las células infectadas por HIV. Gp1 enlaza con el receptor CD4 presente sobre la superficie de los linfocitos T auxiliares, los macrófagos y otras células diana. Después que la gp1 se enlaza con el CD4, la gp41 media la fusión siendo incluso responsable de la entrada del virus. La infección comienza cuando la gp1 sobre las partículas víricas se enlaza con el receptor CD4 en la superficie de los linfocitos T4 u otras células diana. El virus enlazado se fusiona con la célula diana y transcribe de manera inversa su genoma de ARN en el ADN de doble hélice de la célula. El ADN vírico se incorpora al material genético en el núcleo de la célula, donde el ADN vírico dirige la producción del nuevo ARN vírico, las proteínas víricas y las nuevas partículas de virus. Las nuevas partículas brotan desde la membrana de la célula diana, e infectan otras células. La destrucción de los linfocitos T4, que son críticos para la defensa inmune, es la causa principal de la disfunción inmune progresiva que es la marca característica de la infección por HIV. La pérdida de células diana perjudica de manera grave la capacidad del cuerpo para combatir a la mayor parte de invasores, pero tiene un impacto grave de manera particular en las defensas frente a los virus, hongos, parásitos y algunas bacterias, entre las que se incluyen mycobacteria. El HIV-1 mata las células que infecta mediante replicación, salida de las mismas y daño de la membrana celular. El HIV-1 puede matar las células diana mediante la gp1 vírica que se muestra sobre la superficie de una célula infectada. Puesto que el receptor CD4 de las células T tiene una fuerte afinidad por la gp1, las células sanas que muestran el receptor CD4 se pueden enlazar con la gp1 y fusionarse con células infectadas para formar un sincitio. Un sincitio no puede sobrevivir. El HIV-1 puede también excitar las defensas normales de las células inmunes frente a las células infectadas. Con o sin ayuda de los anticuerpos, las células defensivas citotóxicas pueden destruir una célula infectada que muestra proteínas víricas en su superficie. Finalmente, la gp1 libre puede circular por la sangre de los individuos infectados con HIV-1. La proteína libre puede enlazarse con el receptor CD4 de las células no infectadas haciéndolas aparecer como infectadas y evocar la respuesta inmune. La infección con HIV-1 es casi siempre fatal, y en la actualidad no existe cura para la infección por HIV-1. Todavía no están disponibles vacunas efectivas contra la infección por HIV-1. Debido al peligro de inversión o de infección, no se pueden usar probablemente virus vivos atenuados como vacuna. La mayor parte de soluciones con subunidades de vacuna no han resultado útiles en la prevención de una infección por HIV. Los tratamientos de la infección por HIV-1, aunque prolongan la vida de algunas personas infectadas, muestran importantes efectos secundarios. Existe por tanto una gran necesidad de tratamientos y vacunas efectivos para combatir esta infección letal. 2. Vacunas La vacunación es una forma efectiva de prevenir enfermedades y se ha demostrado que tiene éxito contra algunos tipos de infección vírica. Determinar la forma de presentar antígenos HIV-1 al sistema inmunológico humano, con el fin de excitar inmunidad humoral y celular protectora, es una tarea difícil. Hasta la fecha, los intentos de generar una vacuna efectiva contra HIV no han tenido éxito. En los pacientes de SIDA los virus libre sólo están presentes en bajas cantidades. La transmisión de HIV-1 se estimula por interacción intercelular, por fusión y formación de sincitios. Por tanto, los anticuerpos generados frente a virus libres o subunidades víricas resultan por lo general ineficaces para eliminar las células infectadas por virus. 2

3 Las vacunas explotan la capacidad del cuerpo de recordar un antígeno. Después de los primeros encuentros con un antígeno dado, el sistema inmune genera células que retienen un recuerdo inmunológico del antígeno durante toda la vida del individuo. La exposición posterior al antígeno estimula la respuesta inmune, es decir, que da como resultado la eliminación o inactivación del patógeno. El sistema inmune se enfrenta a los patógenos en dos formas: mediante respuestas humorales y mediadas por células. En la respuesta humoral, los linfocitos generan anticuerpos específicos que se enlazan con el antígeno inactivando de esta manera el patógeno. La respuesta mediada por células implica linfocitos T citotóxicos y auxiliares que atacan y destruyen de forma específica las células infectadas. El desarrollo de vacunas con virus HIV-1 presenta problemas debido a que los HIV-1 infectan algunas de las mismas células del sistema inmunológico que la vacuna necesita activar (es decir, los linfocitos T4). Sería ventajoso desarrollar una vacuna que desarrolle una vacuna que inactive el HIV antes que se produzca el desequilibrio del sistema inmunológico. Una tipo de vacuna de HIV particularmente adecuada generaría una respuesta inmune anti-hiv que reconocería las variantes del HIV y que funcionaría en individuos HIV positivos al inicio de su infección. Un desafío principal para el desarrollo de vacunas frente a virus, de forma particular aquellos que tienen una tasa de mutaciones muy elevada, tal como el virus de la inmunodeficiencia humana, contra la que sería deseable la excitación de respuestas neutralizantes y protectoras, es la diversidad de proteínas de envoltura vírica entre las diferentes cepas o aislados víricos. Puesto que los linfocitos T citotóxicos (CTL) tanto de ratones como de seres humanos son capaces de reconocer epitopos derivados de proteínas víricas internas preservadas, y se cree que son importantes en la respuesta inmune frente al virus, se han dirigido los esfuerzos al desarrollo de vacunas CTL capaces de proporcionar protección heteróloga frente a diferentes cepas víricas. Se sabe que los CTL CD8 + matan las células infectadas con virus cuando sus receptores de células T reconocen péptidos víricos asociados con las moléculas MHC de clase 1. Los péptidos víricos se derivan de proteínas víricas sintetizadas por vía endógena, sin tener en cuenta la localización o función de la proteína frente al virus. De esta forma, debido al reconocimiento de los epitopos procedentes de las proteínas víricas preservadas, los CTL pueden proporcionar protección de cepa cruzada. Los péptidos capaces de asociarse con las MHC de clase I para el reconocimiento de CLT se originan a partir de proteínas que están presentes o de paso a través del citoplasma o del retículo endoplasmático. Por lo general, las proteínas exógenas que entran en la ruta de procesado endosómico (como es el caso de los antígenos que presentan las moléculas MHC de clase II), no son efectivos para generar respuestas CTL CD8 +. La mayor parte de los esfuerzos para generar respuestas CTL han usado vectores replicantes para producir el antígeno de la proteína en el interior de la célula, o se han centrado en la introducción de péptidos en el citosol. Estas soluciones tienen limitaciones que pueden reducir su utilidad como vacunas. Los vectores retrovirales muestran restricciones en el tamaño y estructura de los péptidos que pueden expresar en forma de proteínas de fusión a la vez que mantienen la capacidad del virus recombinante para replicarse, y la eficacia de vectores tales como vaccinia para posteriores inmunizaciones puede quedar comprometida por las respuestas inmunes frente a los propios vectores. Igualmente, los vectores víricos y los patógenos modificados tienen riesgos inherentes que pueden prohibir su uso en seres humanos. Además, la selección de epitopos de péptido a presentar depende de la estructura del antígeno MHC del individuo y, por tanto, las vacunas de péptido pueden tener eficacia limitada debida a la diversidad haplotipos de MHC en poblaciones no consanguíneas. 3. Vacunas de ADN Benvenisty, N., y Reshef, L. [PNAS 83, 91-9, (1986)] demostraron que se podía expresar el ADN precipitado con CaCl 2 introducido en ratones por vía intraperitoneal (i.p.) intravenosa (i.v.) o intramuscular (i.m.). La inyección i.m. de vectores de expresión de ADN sin el tratamiento con CaCl 2 en ratones, dio como resultado la captación de ADN por las células musculares, y la expresión de la proteína codificada por el ADN. Los plásmidos se mantuvieron de manera episomal y no se replicaron. Posteriormente se observó expresión persistente tras inyección i.m. en el músculo esquelético de ratas, peces y primates y en el músculo cardíaco de ratas. La técnica de utilizar ácidos nucleicos como agentes terapéuticos se describe en el Documento WO 90/192 (4 de Octubre de 1990), en el que se usan polinucleótidos desnudos para vacunar vertebrados. No es necesario para el éxito del procedimiento que la inmunización sea intramuscular. La introducción de microproyectiles de oro recubiertos con ADN que codifica la hormona de crecimiento bovina (BGH) en la piel de los ratones dio como resultado la producción de anticuerpos anti BGH en el ratón. Se utilizó un inyector de chorro para transfectar los tejidos de piel, músculo, grasa y mamarios de los animales vivos. Se han revisado los procedimientos para introducir ácidos nucleicos. Zhu y col. demostraron que la inyección intravenosa de un complejo ADN:liposoma catiónico en ratones daba como resultado la expresión sistémica de un transgen clonado [Science 261:9-211 (9 de Julio de 1993). Ulmer y col., [Science 9: , (1993)] informaron de la protección heteróloga frente a la infección del virus de la gripe por inyección intramuscular de ADN que codificaba proteínas del virus de la gripe. La necesidad de agentes terapéuticos y profilácticos específicos capaces de excitar respuestas inmunes deseadas frente a patógenos y antígenos tumorales se consigue mediante la presente invención. De particular importancia en esta solución terapéutica es la capacidad de inducir respuestas inmunes de las células T que pueden evitar infecciones 3

4 o enfermedades causadas incluso por cepas de virus que son heterólogas de la cepa a partir de la cual se ha obtenido el gen del antígeno. Esto es de particular interés cuando se trata con un virus como el HIV, del que se sabe que muta rápidamente y del que se han aislado muchos aislados virulentos [véase por ejemplo, LaRosa y col., Science 249: (1990), que identifica 24 aislados distintos de HIV]. En respuesta a esta diversidad reconocida, los investigadores han intentado generar CTL basados en la inmunización de péptidos. De esta forma, Takahashi y col., [Science ; (1992] han informado de la inducción de células T citotóxicas con amplia reactividad cruzada que reconocen un determinante de cubierta de HIV (gp1). Sin embargo, estos investigadores reconocieron la dificultad de conseguir una respuesta CTL con reactividad cruzada verdadera, y sugieren que existe una dicotomía entre el cebado o reestimulación de células T que es muy riguroso, y el estímulo de la función del efector, incluyendo la citotoxicidad para CTL ya estimulados. Wang y col., informaron acerca de la estimulación de respuestas inmunes en ratones frente a HIV por inoculación intramuscular con un gen HIV clonado genómico (no conectado). Sin embargo, el nivel de respuestas inmunes conseguido en estos estudios fue muy bajo. De manera adicional a Wang y col., el constructo utilizado como pieza esencialmente genómica de HIV codifica las secuencias que codifican Tat/REV-gp1-Tat/REV contiguos. Tal como se describe en detalle a continuación, este es un sistema subóptimo para obtener un nivel alto de expresión de la gp1. Esto es también potencialmente peligroso debido a que la expresión de Tat contribuye a la progresión del Sarcoma de Kaposi. El Documento WO 93/17706 describe un procedimiento para la vacunación de un animal frente a un virus, en el que las partículas del vehículo se recubrieron con un constructo de gen y las partículas recubiertas se aceleraron hacia el interior de las células de un animal. Con relación al HIV, se propuso usar esencialmente el genoma entero, menos las repeticiones del extremo terminal de gran tamaño. Este procedimiento representa un riesgo sustancial para los pacientes. Se cree de manera general que los constructos de HIV deberían contener menos de aproximadamente el 0% del genoma de HIV para asegurar la seguridad de la vacuna; esto asegura que las fracciones enzimáticas y las proteínas reguladoras víricas, muchas de las cuales que tienen funciones desconocidas o mal comprendidas se han eliminado. De esta manera, quedan numerosos problemas si va a surgir una vacuna útil para el HIV humano a partir de la tecnología de liberación de genes. La presente invención contempla cualquiera de los procedimientos conocidos para introducir polinucleótidos en el tejido vivo para inducir la expresión de las proteínas. Sin embargo, esta invención proporciona un inmunógeno nuevo para introducir HIV y otras proteínas en la ruta de procesado del antígeno para generar de manera eficiente CTL y anticuerpos específicos de HIV. El producto farmacéutico es efectivo como una vacuna para inducir respuestas inmunes neutralizantes anti HIV y HIV tanto celulares como humorales En esta presente invención, los problemas señalados anteriormente se dirigen y resuelven mediante el suministro de inmunógenos de polinucleótidos que, cuando se introducen en una animal, dirigen la expresión eficiente de las proteínas de HIV y los epitopos. Las respuestas inmunes generadas de esta manera son efectivas en el reconocimiento de HIV, en la inhibición de la replicación de HIV, en la identificación y muerte de las células infectadas con HIV, y presentan reactividad cruzada frente a muchas cepas de HIV. 4. Utilización del Códon y el Contexto del códon Los emparejamientos de los códones de los organismos no son precisamente aleatorios, y difieren de organismo a organismo. Esta información se usa para construir y expresar genes alterados o sintéticos que tienen los niveles deseados de eficiencia de traducción, para determinar qué regiones en un genoma son regiones codificadoras de proteínas, para introducir los emplazamientos de pausa de traducción en genes heterólogos, y para determinar las relaciones o el origen ancestral de las secuencias de nucleótidos. La expresión de genes heterólogos extraños en organismos transformados es en la actualidad cosa común. Se han insertado con éxito un gran número de genes de mamíferos, entre los que se incluyen, por ejemplo, murina y genes humanos, en organismos monocelulares. Las técnicas estándar a este respecto incluyen la introducción de genes extraños que se van a expresar en un vector tal como un plásmido o un fago, y utilizar este vector para insertar el gen en un organismo. Los promotores nativos de dichos genes se sustituyen de manera habitual con promotores fuertes compatibles con el huésped en el que el gen se inserta. La maquinaria de secuenciamiento de proteínas permite la elucidación de las secuencias de aminoácidos de incluso cantidades insignificantes de proteína nativa. A partir de estas secuencias de aminoácidos se pueden inferir las secuencias de ADN que codifican dichas proteínas. La síntesis de ADN es una técnica en rápido desarrollo, y se pueden construir fácilmente los genes sintéticos que corresponden a aquellas secuencias de ADN inferidas A pesar del conocimiento naciente de los sistemas de expresión y el ADN recombinante, quedan obstáculos significativos cuando se intenta expresar un gen extraño o sintético en un organismo. Muchas proteínas activas nativas, por ejemplo, se glicosilan de manera diferente de la que se produce cuando se expresan en un huésped extraño. Por esta razón, se pueden preferir huéspedes eucariotas tales como levaduras a los huéspedes bacterianos para expresar muchos genes de mamíferos. El problema de la glicosilación continua siendo tema de investigación. Otro problema se comprende peor. A menudo la traducción de un gen sintético, incluso cuando se acopla con un promotor fuerte, procede de manera mucho menos eficiente a la que cabría esperar. Esto último es especialmente verdadero para los genes exógenos extraños al organismo de expresión. Incluso cuando el gen se transcribe de manera 4

5 suficientemente eficiente, de tal manera que se producen cantidades recuperables del producto de la traducción, la proteína está inactiva o distinta de cualquier manera en sus propiedades respecto de las de la proteína nativa Se reconoce que el último problema se debe de manera habitual a las diferencias en el plegado de la proteína en diversos organismos. La solución a este problema ha sido elusiva, y los mecanismos que controlan el plegado de la proteína son poco comprendidos. Se cree que los problemas relacionados con la eficiencia de traducción están relacionados con el efecto de contexto del códon. La las regiones de los genes que codifican proteínas en todos los organismos están sujeta a una amplia variedad de restricciones funcionales, algunas de las cuales depende de los requerimientos para codificar una proteína que funciona de manera apropiada, así como a las señales de traducción apropiadas de inicio y detención. Sin embargo, se han discernido diversas características de las regiones que codifican la proteína que no son fácilmente comprensibles en los términos de estas restricciones. Dos tipos importantes de dichas características son aquellos que implican la utilización del códon y el contexto del códon. Se sabe que la utilización del códon está muy sesgada y varía de manera considerable entre diferentes organismos. Se ha demostrado que los modelos de utilización del códon están relacionados con la abundancia relativa de isoaceptores del ARNt. Los genes que codifican proteínas de abundancia alta frente a baja muestran diferencias en sus preferencias por el códon. Ha sido ampliamente descrita la posibilidad de desviaciones en el uso de los codones que altera las velocidades de elongación de los péptidos. Aunque las diferencias en la utilización del códon se asocian con diferencias en las velocidades de traducción, los efectos directos de la elección de códon han sido difíciles de demostrar. Otras restricciones propuestas sobre los modelos de utilización del códon incluyen maximizar la fidelidad de la traducción y optimizar la eficiencia cinética de la síntesis de proteínas. Aparte del uso no aleatorio de los codones, se ha acumulado evidencia considerables acerca de que el reconocimiento códon/anticódon está influenciado por secuencias externas al propio códon, un fenómeno denominado contexto del códon. Existe una fuerte influencia de los nucleótidos cercanos sobre la eficiencia de la supresión de codones sin sentido así como codones con sentido incorrecto. Claramente, la abundancia de la actividad supresora en poblaciones bacterianas naturales, así como el uso de codones de terminación para codificar la selenocisteína y la fosfoserina requieren que la terminación sea dependiente del contexto. Se ha demostrado que los efectos de contexto similares influencian la fidelidad de la traducción, así como la eficiencia de la iniciación de la traducción. Los análisis estadísticos de las regiones que codifican proteínas de E. coli han demostrado otra manifestación del contexto del códon. La presencia de un códon concreto en una posición influencia fuertemente la frecuencia de incidencia de algunos nucleótidos en los codones vecinos, y estas restricciones del contexto difieren de manera marcada para los genes expresados a niveles altos frente a bajos. Aunque se ha reconocido el efecto contexto, el valor predictivo de las reglas estadísticas que relacionan los nucleótidos preferidos adyacentes a los codones es relativamente bajo. Esto ha limitado la utilidad de dichos datos de preferencia de nucleótidos para seleccionar codones para efectuar los niveles deseados de eficiencia de traducción. La llegada de los equipos de secuenciamiento automatizado de nucleótidos ha hecho que se disponga de grandes cantidades de datos de secuencias para una amplia variedad de organismos. La compresión de estos datos presenta sustanciales dificultades. Por ejemplo, es importante identificar las regiones que codifican el genoma con el fin de relacionar los datos de la secuencia genética con las secuencias de proteína. De manera adicional, los ancestros del genoma de algunos organismos son de sustancial interés. Algunas secuencias que son víricas en origen se han incorporado ahora de manera estable en el genoma de los organismos eucariotas. Las propias secuencias víricas se pueden haber originado en otra especie esencialmente no relacionada. Puede ser importante una comprensión del ancestro de un gen para destacar analogías correctas entre genes relacionados y sus productos de traducción en otros organismos. Existe necesidad de una mejor comprensión de los efectos del contexto del códon sobre la traducción, y de un procedimiento para determinar los codones apropiados para cualquier efecto de traducción deseados. Existe también necesidad de un procedimiento para identificar las regiones que codifican el genoma a partir de los datos de las secuencias de nucleótidos. Existe también necesidad de un procedimiento para controlar el plegado de la proteína y para asegurar que un gen extraño se plegará de manera apropiada cuando se exprese en un huésped. Los genes alterados o construidos de acuerdo con las eficiencias traducciones adecuadas serían de un valor significativo. Otro aspecto de la práctica de las técnicas de ADN recombinante para la expresión por microorganismos de las proteínas de interés industrial y farmacéutico es el fenómeno de preferencia del códon. Aunque se ha indicado anteriormente que la maquinaria existente para la expresión del gen está formada por células huésped genéticamente transformadas, que operarán para construir un producto deseado dado, los niveles de expresión alcanzados en un microorganismo pueden estar sujetos a una amplia variación, dependiendo en parte de las formas alternativas específicas del código genético que especifica el aminoácido en un gen exógeno insertado. Un códon triplete de cuatro posibles bases de nucleótidos puede existir en 64 formas variantes. Que estas formas proporcionan el mensaje para únicamente aminoácidos diferentes (así como la iniciación y terminación de la transcripción) significa que algunos aminoácidos se pueden codificar por más de un códon. Debido a ello, algunos aminoácidos tienen tanto como seis codones alternativos redundantes mientras que algunos otros tienen un único códon requerido. Por razones no completamente comprendidas, los codones alternativos no están todos presentes de manera uniforme en el ADN endógeno

6 de diferentes tipos de células y parece existir una jerarquía natural variable o preferencia para algunos codones en algunos tipos de células Como ejemplo, el aminoácido leucina se especifica por uno cualquiera de los seis codones de ADN que incluyen CTA, CTC, CTG, CTT, TTA, y TTG (que corresponden, respectivamente a los codones del ARN, CUA, CUC, CUG, CUU, UUA y UUG). El análisis exhaustivo de las frecuencias de los codones del genoma de los microorganismos ha revelado que el ADN endógeno de E. coli contiene de manera más habitual el códon específico de la leucina CTG, mientras que el ADN de levaduras y mohos del limo incluye de manera común un códon TTA que específico de la leucina. En vista de esta jerarquía, se mantiene de manera general que la probabilidad de obtener altos niveles de expresión de un polipéptido rico en leucina por un huésped de E. coli dependerá en alguna extensión de la frecuencia de utilización del códon. Por ejemplo, un gen rico en codones TTA será con toda probabilidad mal expresado en E. coli, mientras que un gen rico en CTG expresará el polipéptido probablemente de manera superior. De manera similar, cuando las células de levadura son la transformación proyectada de las células huésped para la expresión de un polipéptido rico en leucina, un códon preferido para uso en un ADN insertado será TTA. Las implicaciones del fenómeno de preferencia del códon en las técnicas de ADN recombinante son manifiestas, y el fenómeno puede servir para explicar errores anteriores en alcanzar altos niveles de expresión de genes exógenos en organismos huésped transformados con éxito un códon menos preferido puede estar presente de forma repetida en el gen insertado, y la maquinaria de expresión de la célula huésped puede no funcionar de forma tan eficaz. Este fenómeno sugiere que los genes sintéticos que se han diseñado para incluir codones preferidos de células huésped proyectadas proporcionan una forma preferida de material genético extraño para la práctica de técnicas de ADN recombinante.. Vehiculado de proteínas La diversidad de funciones que tipifican las células eucariotas depende de la diferenciación estructural de sus límites de membrana. Para generar y mantener estas estructuras, las proteínas deben ser transportadas desde su emplazamiento de síntesis en el retículo endoplasmático a los destinos predeterminados por toda la célula. Esto requiere que las proteínas en transito desplieguen señales de clasificación que sean reconocidas por la maquinaria molecular responsable de dirigir la selección de la vía, localizada en los puntos de acceso de las rutas de vehiculado principales. Las decisiones de clasificación de la mayor parte de proteínas necesitan realizarse sólo una vez a medida que atraviesan sus rutas biosintéticas, ya que su destino final, la localización celular donde realizan su función, se convierte en su residencia permanente. El mantenimiento de la integridad intracelular depende en parte de la clasificación selectiva y el transporte preciso de las proteínas a sus destinos correctos. En los últimos años se ha diseccionado la maquinaria molecular de reconocimiento y se estudiado ampliamente la localización de las proteínas. Se han identificado motivos de secuencia definidos en proteínas que pueden actuar como marcadores de dirección. Se han encontrado numerosas señales de clasificación asociadas con las regiones citoplásmicas de las proteínas de membrana. Resumen de la invención Se proporcionan moléculas de ADN sintético que codifican env de HIV y se proporcionan modificaciones de env de HIV. Los codones de las moléculas sintéticas incluyen los codones preferidos de las células huésped proyectadas. Las moléculas sintéticas proporcionan formas preferidas del material genético extraño. Se pueden usar las moléculas sintéticas en forma de vacuna de polinucleótido que proporciona inmunoprofilaxis efectiva frente a la infección por HIV mediante la neutralización de la inmunidad mediada por células y anticuerpos. Esta invención proporciona polinucleótidos que, cuando se introducen directamente en un vertebrado in vivo, incluyendo mamíferos tales como primates y seres humanos, inducen la expresión de las proteínas codificadas en el interior del animal. De manera específica se proporciona un polinucleótido sintético según se define en la reivindicación 1. Breve descripción de los dibujos La Figura 1 muestra el cassette de env de HIV en función de las estrategias de expresión. La Figura 2 muestra las respuestas de la vacuna de ADN mediada por las respuestas anti-gp1. La Figura 3 muestra los títulos ELISA de anti-gp1 del suero de vacuna de ADN de murina. La Figura 4 muestra la expresión relativa de la gp1 tras la transfección del cultivo celular PNV con env de HIV. 6 La Figura muestra las respuestas medias anti-gp1 según ELISA que siguen a la vacunación con tpa-gp143/opta frente al ADN optb La Figura 6 muestra la neutralización de HIV mediante el suero de vacuna de ADN de murina. 6

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