Enzygnost HIV Integral

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1 Enzygnost HIV Integral Enzyme immunoassay for the qualitative detection of HIV infection based on the determination of HIV p24 antigen, antibodies to human immunodeficiency virus of types 1 and 2 (HIV 1 and HIV 2), as well as against antibodies to HIV 1, subtype O, in serum and plasma. Enzymimmunoassay zum qualitativen Nachweis einer HIV Infektion basierend auf der Bestimmung von HIV p24-antigen, Antikörpern gegen die humanen Immundefizienz Viren der Klasse 1 und 2 (HIV 1 und HIV 2), sowie Antikörpern gegen das HIV 1-Subtyp O-Virus in Serum und Plasma. Test immunoenzymatique pour la mise en évidence qualitative d une infection à VIH, basée sur la détection de l antigène VIH p24, des anticorps anti-virus de l immunodéficience humaine des classes 1 et 2 (VIH 1 et VIH 2), ainsi que des anticorps anti-vih 1 sous-type O, dans le sérum ou le plasma. Metodo immunoenzimatico per l'identificazione qualitativa di una infezione HIV, basata sulla determinazione dell'antigene HIV p24, degli anticorpi contro il virus dell'immunodeficienza umana del tipo 1 e 2 (HIV 1 e HIV 2) e degli anticorpi anti-hiv1 sottotipo O, nel siero e nel plasma. Ensayo inmunoenzimático para el reconocimiento cualitativo de una infección por HIV, basado en la determinación del antígeno HIV-p24, de los anticuerpos contra los virus de la inmunodeficiencia humana de la clase 1 y 2 (HIV 1 y HIV 2), así como también, de los anticuerpos contra el virus HIV 1-subtipo O en suero y plasma. O Enzygnost HIV Integral é um teste imunoenzimático para detecção qualitativa de infecção pelo HIV, com base na determinação do antigéneo HIV p24, de anticorpos contra os vírus da imunodeficiência humana das classes 1 e 2 (HIV 1 e HIV 2) e de anticorpos contra o vírus HIV 1 - subtipo O, no soro e no plasma. English: Page 2 to 10 Deutsch: Seite 11 bis 19 Français: Pages 20 à 28 Italiano: Pagina 29 fino 37 Español: Página 38 hasta 47 Português: Páginas 48 a 56 Summary of Test Procedure Page 10 Kurzanleitung Testdurchführung Seite 19 La technique en bref Page 28 Istruzioni in breve, esecuzione del Test Pagina 37 Resumen de la técnica Página 47 Resumo da técnica Página 56 Bibliography/Literatur/Littérature Bibliografía/Bibliografia Page/Seite/Página/Pagina 57 OQTO G11 C0541 (1584) H 1 Edition October 2003

2 Enzygnost HIV Integral Intended Use and Application Enzyme immunoassay for the qualitative detection of HIV infection based on the determination of HIV p24 antigen, antibodies to human immunodeficiency virus of types 1 and 2 (HIV 1 and HIV 2), as well as against antibodies to HIV 1, subtype O, in serum and plasma. The enzyme immunoassay is processed on the BEP II, BEP III and BEP 2000 ELISA processors. The test was developed for testing single samples and not pooled or diluted samples. The product is for in vitro diagnostic use only. Summary and Explanation Acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) was first recognized in 1981 as a clinical picture in its own right. The disease is today considered to involve two different Human Immunodeficiency Viruses (HIV 1 and HIV 2) as causal agents. The HIV 1 virus (synonym: LAV/HTLV-III) was isolated as early as in 1983 (1,2) and a further such pathogenic human virus (HIV 2) was isolated in 1986 (3). A high level of importance is attached to the serological determination of antibodies to HIV, especially in the field of transfusion medicine where measures are needed to prevent the further spread of the disease. Consequently, from 1985 onwards, donor blood was screened for HIV 1 antibodies on a mandatory basis, both by blood banks and manufacturers of plasma products. Subsequent information on the spread of HIV 2 infections revealed that blood donors need to be tested routinely not only for anti-hiv 1 antibodies but also for anti-hiv 2 in order to exclude to the greatest possible extent the potential risk of transmission via blood transfusions or blood-derived products. In 1990 a new type of HIV virus was reported which at first was considered to be serologically of little significance (4). It was not until 1994 that two independent teams succeeded, simultaneously, in sequencing this new subtype (5,6). Parallel to this virological research, several teams were able to demonstrate the serological significance of the virus, now known as HIV 1 subtype O (7,8). This research showed that a multitude of anti-hiv 1+2 assays exhibit weaknesses in detecting subtype O antibodies (9). Consequently, a need arose for reliable concurrent detection of this new HIV variant along with the established HIV 1 and HIV 2 isolates. In some HIV seroconversion samples HIV p24 antigen was detected before the detection of HIV antibodies. To narrow the diagnostic window between the occurrence of HIV infection and its first serological detection it was therefore desirable to supplement the antibody test with a test for HIV p24 antigen. Although the determination of HIV antibodies and/or antigen does not allow definite conclusions to be made on whether infectious HIV 1 or HIV 2 is present in the blood at the time of blood collection, in the same way that a negative result does not exclude the presence of HIV 1 or HIV 2 with certainty, currently the combined antigen/antibody test provides the best means of detecting and eliminating blood donations from HIV-infected donors with a high level of probability. Principle of the Method Enzygnost HIV Integral is an enzyme immunoassay based on the simultaneous determination of HIV antigen and HIV antibody. In the first step, the HIV immunoglobulin in the test sample reacts with the recombinant proteins/ synthetic peptides of HIV 1, HIV 2 and HIV 1 (subtype O) that are coated onto the wells of the microtitre plate. Simultaneously, any HIV p24 antigens present in the test sample can bind to the polyclonal HIV p24 antibodies attached to the wells. The unbound sample constituents are removed by washing and then, in the second step, the specifically bound antibodies are labelled (antigen sandwich) with biotin-conjugated recombinant proteins/synthetic peptides of HIV 1, HIV 2 and/or HIV 1 (subtype O). Simultaneously, any bound HIV antigens are labelled by biotin-conjugated monoclonal HIV p24 antibodies (antibody sandwich). The unbound biotin conjugates are then removed by washing and then, in the third step, Conjugate 2 (streptavidin/pod) reacts with the biotin conjugates specifically bound to the solid phase. The excess Conjugate 2 is then removed and the enzyme activity of the bound conjugate determined (blue colour reaction). The enzymatic conversion of the chromogen is terminated by the addition of Stopping Solution POD (yellow colour reaction). The colour intensity is proportional to the concentration of HIV p24 antigen and HIV antibody present in the sample. OQTO G11 C0541 (1584) H 2 Edition October 2003

3 Reagents Material provided 2 x x 96 Enzygnost HIV Integral: 2 test plates 10 test plates HIV Conjugate 1: 2 x 1 vial 10 x 1 vial HIV Conjugate Buffer 1: 2 x 15 ml 10 x 15 ml HIV Conjugate 2: 2 x 15 ml 10 x 15 ml HIV Sample Buffer: 2 x 15 ml 4 x 15 ml HIV Control, positive: 2 x 1.4 ml 3 x 1.4 ml HIV Control, negative: 2 x 2.0 ml 3 x 2.0 ml Label "Empty bottle for for HIV Conjugate 1" - 1 pcs. Label "Empty bottle for HIV Conjugate 2" - 1 pcs. Package insert 1 pcs. 1 pcs. Barcode table of values 1 pcs. 1 pcs. PE bag 1 pcs. 1 pcs. Additional materials required, but not provided, for the 2 x 96 and 10 x 96 kits: Supplementary Reagents for Enzygnost TMB (Order No. OUVP) Composition Enzygnost HIV Integral test plate Microtitre plate coated with a mixture of recombinant proteins (E. coli) and synthetic peptides from HIV 1 gp41, HIV 1 (subtype O) gp41, HIV 2 gp36, as well as polyclonal antibodies (rabbit) to HIV p24. HIV Conjugate 1 Lyophilized substance consisting of recombinant HIV proteins (E. coli) / synthetic peptides of HIV 1, HIV 2 and HIV 1 (subtype O) as well as monoclonal antibodies (mouse) to HIV p24, biotinconjugated; coloured blue. Reconstitute with 15 ml of HIV Conjugate Buffer 1. HIV Conjugate Buffer 1 Tris buffer containing Sapogenat* and casein; coloured yellow. Preservative: phenol (max. 1 g/l) HIV Conjugate 2 Tris Buffer containing Sapogenat* and streptavidin, peroxidase (POD)-conjugated; coloured red. Preservative: phenol (max. 1 g/l) HIV Sample Buffer Phosphate buffer containing casein and Triton X 100*; coloured red. Preservative: phenol (max. 1 g/l) HIV Control, positive Heat-treated human serum containing antibodies to HIV 1 antigens, stabilized. Nominal absorbance: 0.7 Preservative: phenol (max. 1 g/l) HIV Control, negative Human serum without HIV antigen and without antibodies to HIV 1, HIV 2, and HIV 1 (subtype O) antigens, stabilized. Nominal absorbance: 0.15 Preservative: phenol (max. 1 g/l) Warnings and Precautions 1. For in vitro diagnostic use. 2. Each individual blood donation for use in the manufacture of the control sera is tested for HBsAg, anti-hcv, anti-hiv 1 and anti-hiv 2. Only sera with negative findings are used for manufacturing the negative control serum. The positive control serum is heat-treated (not less than 1 hour at +56 C). OQTO G11 C0541 (1584) H 3

4 Nevertheless, since absence of infectious agents cannot be proven, all materials obtained from human blood should be handled with due care, observing the precautions recommended for biohazardous material (10). 3. It is advisable to wear protective gloves throughout the entire test procedure. 4. Prior to disposal, it is recommended that solid infectious materials should be autoclaved for at least one hour at +121 C. All aspirated solutions should be collected in two receptacles connected in series. These should both contain a disinfectant suitable for inactivating pathogenic human viruses. The concentrations and reaction times specified by the manufacturer must be observed. Preparation of the Reagents Bring all the reagents and samples to +15 to +25 C before beginning the test (without removing the test plate from the container). Test strips not needed for the test must be removed from the holder and stored for later use (see Table 1). The 10 x 96 pack of Enzygnost HIV Integral is supplied with one barcoded label for the HIV Conjugate 1 as well as one for the HIV Conjugate 2. When processing large series of samples on the BEP III, a frequent change of syringe can be avoided by pooling several conjugate vials in a larger bottle (e.g. surplus, unused empty bottles for the Working Chromogen Solution, see Materials required but not provided), and then labelling this vial with the respective label ("Empty bottle for Conjugate..."). This labelled bottle is then placed into the reagent rotor. For each test plate, dilute 20 ml of Washing Solution POD (Supplementary Reagents Kit) to 400 ml with distilled or deionized water. For each test plate, dilute 1 ml of Chromogen TMB with 10 ml of Buffer/Substrate TMB (Supplementary Reagents Kit) in the empty bottle supplied with the kit (= Working Chromogen Solution) and store closed and protected from light. After use rinse the bottle thoroughly with distilled water. For technical reasons (overage) it is not permissible to transfer the contents of the Chromogen TMB vial into the vial of Buffer/Substrate TMB. HIV Conjugate 1 solution: Transfer the entire contents of a vial of HIV Conjugate Buffer 1 (15 ml, coloured yellow) into a vial of HIV Conjugate 1 (lyophilized material, coloured blue). Swirl gently to completely dissolve the lyophilized material. The HIV Conjugate 1 solution then has a green colour. Before use allow the HIV Conjugate 1 solution to equilibrate for at least 15 minutes. Storage and Stability Stored unopened at +2 to +8 C, all components of the Enzygnost HIV Integral kit may be used up to the dates of expiry given on the labels. Once opened, the details given in Table 1 in the Appendix apply. Equipment required: BEP II: For automatic dispensing of reagent and washing BEP III: For automatic processing of the test after dispensing the samples as well as for evaluation BEP 2000: For fully automatic processing and evaluation of the test Pipettes: piston-type pipettes 25, 100 and 1000 µl Incubator: Covered water bath (+37 ± 1 C) or comparable incubation methods All the equipment used in the test must have been validated. Specimens Suitable specimens are individual samples (human sera or EDTA/heparinized/citrated plasma) obtained by standard laboratory techniques. The samples should be stored for not more than 3 days at +2 to +8 C. If the samples are to be stored for a longer period of time, they must be frozen. OQTO G11 C0541 (1584) H 4

5 Method Test procedure using the BEP II 1.Assay scheme: Ascertain the number of wells required (= number of test samples plus 5 wells for the controls). 2.Dispense sample buffer: Introduce 25 µl of sample buffer into each well. 3.Dispense samples: Into 3 wells (A1 to C1) pipette 100 µl/well of the HIV Control, negative, and into 1 well (D1) pipette 100 µl of the HIV Control, positive. Fill each of the subsequent wells with 100 µl/well of undiluted sample. At the end of the series/plate, fill one further well with 100 µl of HIV Control, positive. Alternatively, the HIV Control, positive, can be pipetted in duplicate at the start of the series: Alternative: Into 3 wells (A 1 to C1) pipette 100 µl/well of HIV Control, negative, and into 2 wells (D1 and E1) pipette 100 µl/well of HIV Control, positive. Then fill the subsequent wells with 100 µl/well of undiluted sample. Perform the pipetting steps within 30 min per test plate. 4.Incubate: Cover the test plate with adhesive foil and incubate at 37 ± 1 C for 30 ± 2 minutes, then proceed immediately to the washing step. 5.Wash: Remove the foil, aspirate all the wells and wash 4 times with approx. 0.3 ml/well of washing solution. 6.Dispense HIV Conjugate 1 solution: Fill each well with 100 µl of HIV Conjugate 1 solution, cover with fresh adhesive foil and immediately place in the incubator. 7.Incubate: At 37 ± 1 C for 30 ± 2 min as described in 4.. Then proceed immediately to the next washing step. 8.Wash: Remove foil and wash 4 times as described in Dispense HIV Conjugate 2: Fill each well with 100 µl of HIV Conjugate 2, then cover with fresh adhesive foil and place immediately in the incubator. 10.Incubate: At 37 ± 1 C for 30 ± 2 min as described in 4.. Then proceed immediately to the next washing step. 11. Wash: Remove the foil and wash 4 times as described in Dispense substrate: Fill each well with 75 µl of the Working Chromogen Solution. 13.Incubate: Cover with fresh adhesive foil and incubate at +15 to +25 C for 30 ± 2 min protected from light. 14.Stop reaction: Remove the foil, then add 75 µl of Stopping Solution POD to each well, keeping to the same timing as in Step Read: Read at 450 nm within one hour. The recommended wavelength for the reference measurement is 650 nm (where appropriate, between 615 and 690 nm). Test procedure using the BEP III Before using the BEP III, prepare the test plates and sample dispensing steps (Section 1 and 2 at "Test procedure using the BEP II"). Immediately afterwards place the uncovered test plates (i.e. not covered with adhesive foil) into the BEP III. Note that partially filled test plates need to be made up to at least half plates (6 test strips) by adding "water-filled strips". The test is then processed fully automatically (see BEP III instruction manual). The settings for the incubation times in the BEP III software may differ from the times on the BEP II for technical reasons (system speed) but have been validated for Enzygnost on the BEP III. Test procedure using the BEP 2000 The sample dispensing steps and subsequent processing steps in the test are performed fully automatically in the instrument (see instruction manual for the BEP 2000). Validation of the test The individual absorbance readings for the control sera are used for calculating the mean values if: A neg A pos OQTO G11 C0541 (1584) H 5

6 If one of the three absorbance values of the negative control is outside the specification, this value can be neglected. Both absorbance values of the positive control must comply with the specification. If these specifications are not fulfilled, the test must be repeated. Evaluation of the test On the BEP 2000 and BEP III the results are evaluated automatically. Please consult the instruction manuals for further details in this respect. The following sections apply if the results are evaluated without software assistance. Calculate the mean absorbance of the negative controls, then calculate the cut-off limit by adding 0.450: Cut -off = A neg The retest range is defined as follows: Cut-off to Cut-off The test samples are classed as follows based on the criteria of the test: Result: 1. A sample < cut-off = "negative" 2. A sample > cut-off = "reactive" 3. cut-off A sample cut-off = "equivocal" Samples with absorbances within or above the retest range must be retested in duplicate. If, in the retest, an initially reactive sample yields absorbances which are both below the retest range, the sample is classed negative based on the criteria of the test. If at least one of the two absorbances in the retest is again within or above the retest range the sample is classed as repeatedly reactive. It is essential that all repeatedly reactive samples should be verified using a confirmatory test (e.g. Immunoblot, Nucleic acid analysis). To be on the safe side, a follow-up sample should be tested (about 2 weeks later). Limitations and Interferences 1.Anticoagulants such as heparin, EDTA and citrate do not interfere with the test. 2.Samples that are haemolytic or icteric do not interfere with the test. 3.Samples containing the potential interference factors ANA, E.-Coli and EBV antibodies, as well as sera from pregnant women, were checked in the test. The samples used were found not to interfere with the results. 4.No interferences were observed with heat-treated samples (30 min, 56 C). 5.Serum from insufficiently coagulated blood, and samples which contain microbial contamination, should not be used. Any particulate components in the sample (e.g. fibrin clots, erythrocytes) should be removed before the test. 6.Lipaemic, rheumatoid factors and AMA containing samples, as well as samples with HAV antibodies may lead to a higher reactivity. 7.Enzygnost HIV Integral is a test for the simultaneous detection of HIV p24 antigen and HIV antibodies, and must not be used for the sole detection of HIV p24 antigen. 8.When using thawed samples, ensure good homogenization of the material prior to use. 9.The pack contains a matched set of reagents. Reagents must not be interchanged with other kits unless the reagents are from an identical lot (i.e. they must display the required 6-digit lot numbers printed on the pack and given in the enclosed barcode table of values). Washing Solution POD, Stopping Solution POD and Working Chromogen Solution are exceptions to this requirement. Note that the Working Chromogen Solution must first be prepared from matched components (do not use Chromogen TMB and Buffer/Substrat TMB from kits with a different number). OQTO G11 C0541 (1584) H 6

7 10.Buffer/Substrate TMB, the Working Chromogen Solution and the Stopping Solution POD must not be allowed to come into contact with heavy metal ions or oxidizing substances (do not use pipettes with metal parts in contact with the liquid!). Do not perform the substrate reaction in the proximity of disinfectants containing hypochlorite. If the Working Chromogen Solution has spontaneously developed a blue colour before transferral into the test plate, this indicates that the solution is contaminated; in such cases prepare a fresh solution in a clean container. Skin contact with the above-mentioned solutions is to be avoided. 11.The test plate should be protected from vibration during the incubation phase (e.g. placed on a secured floatation aid, or in a non-circulating water bath); the wells of the plate must be in contact with the thermostatted water. If stabilizers are used to prevent microbial contamination of the water, care must be taken that neither the surface of the test plate nor the wells come into contact with these solutions since such contamination can lead to unspecific reactions. 12.With highly reactive samples the dye may precipitate during the stopping reaction. This does not interfere with the photometric evaluation. 13.The control sera have been prepared from native human sera. As a result, turbidity may occur but this has no effect on the test result. 14.Do not expose the test plate to direct sunlight for an extended period of time before beginning the test. Specific Performance Characteristics Sensitivity and Specificity The results of the sensitivity and specificity studies are shown in Tables 2+3 (Appendix). The sensitivity of the test was established by investigating a total of 515 anti-hiv 1, 164 anti-hiv 2, 26 anti-hiv 1 (subtype O) and 64 HIV antigen positive samples. All the tested HIV antigen/antibody positive samples were found to be positive according to the criteria of Enzygnost HIV Integral. The reactivity of the test in respect to seroconversion samples was investigated using 34 seroconversion panels. Here, Enzygnost HIV Integral was found to detect seroconversion with greater sensitivity than tests that detect only HIV antibody. Nevertheless, when the test is used on a wide scale it is not possible to rule out that some samples may escape detection. When the SFTS Panel was tested (1996), the sample with a declared value of 250 pg HIV antigen/ml (No. 2024) was found to be reproducibly positive. By testing the dilution steps of the SFTS Panel for both the 100 pg sample and the sample with a declared value of 250 pg HIV antigen/ml, an analytical sensitivity between 100 and 250 pg HIV antigen/ml was calculated. The specificity of the test was established by investigating a total of 8851 HIV-negative blood samples. The specificity results obtained were 99.3 % to % (initial testing) and 99.7 % to 100 % (retest). Deviations are possible depending on the sample population, test procedure and other factors. Current knowledge indicates that a positive result in the test does not yield definite evidence that the blood contains infectious HIV 1 or HIV 2, just as a negative result also does not definitely exclude the presence of HIV 1 or HIV 2. Reproducibility The results of the intra-/inter-assay reproducibility study are listed in Table 4 (in the Appendix). These are exemplary data. Deviations from the values are quite possible depending on procedure and other factors. Enzygnost and BEP are registered trademarks of Dade Behring Marburg GmbH in the USA, Germany and other countries. *Sapogenat is a trademark of Clariant. Triton 100 X is a trademark of Merck. Dade Behring Marburg GmbH 0197 Emil-von-Behring-Str. 76 D Marburg OQTO G11 C0541 (1584) H 7

8 Tab. 1 Storage and Stability Material/Reagent State Storage Stability* Enzygnost HIV Integral test plate once opened +2 to +8 C in the 4 weeks bag with the desiccant HIV Conjugate 1 once +2 to +8 C 4 weeks reconstituted +15 to +25 C 2 days HIV Conjugate 2 once opened +2 to +8 C 4 weeks +15 to +25 C 2 days HIV Sample Buffer once opened +2 to +8 C 4 weeks HIV Control, positive once opened +2 to +8 C 4 weeks -20 C 3 months HIV Control, negative once opened +2 to +8 C 4 weeks -20 C 3 months Chromogen TMB once opened +2 to +8 C expiry date Buffer/Substrate TMB once opened +2 to +8 C expiry date Working Chromogen Solution diluted +2 to +8 C 5 days to +25 C 8 hours in closed container protected from light Washing Solution POD once opened +2 to +8 C expiry date (concentrate) diluted 1:20 +2 to +8 C 1 week diluted 1: to +25 C 1 day Stopping Solution POD once opened +2 to +8 C expiry date * use each component by the expiry date at the latest OQTO G11 C0541 (1584) H 8

9 Tab. 2 Sensitivity The sensitivity studies yielded the following data: Sample population Number of samples Initially reactive Anti-HIV 1 pos Anti-HIV 2 pos Anti-HIV 1 (subtype O) pos HIV antigen pos * Seroconversion panel 34 HIV panels Greater sensitivity than with HIV antibody tests * With early seroconversion samples, HIV p24 antigen tests show better sensitivity for the detection of HIV antigen. Tab. 3 Specificity The specificity studies yielded the following data: Sample population Number of samples Initially reactive Retest active Negative sera (A) Negative sera (B) Negative sera (C) Neg. plasmas (D) Tab. 4 Reproducibility In the studies on intra-assay reproducibility the samples were tested in 8-fold replicates on each of 5 days. The coefficients of variation (CV s) were calculated using the variance component model. Enzygnost HIV Integral Sample Mean absorbance % CV P P P P In the studies on inter-assay reproducibility the samples were tested in 8-fold replicates on each of 5 days. The coefficients of variation (CV s) were calculated using the variance component model. Enzygnost HIV Integral Sample Mean absorbance % CV P P P P OQTO G11 C0541 (1584) H 9

10 Tab. 5 Testprocedure and programming steps Enzygnost HIV Integral Testprocedure Menuprogramming (BEP II, BEP III, BEP 2000) for the Prepare reagents BEP 2000 BEP II BEP II 25 µl HIV Sample Buffer 3 x 100 µl HIV Control, negative 1 x 100 µl HIV Control, positive 100 µl undiluted sample each 1 x 100 µl HIV Control, positive BEP III 30 min ± 2 min in the case of partially filled (37 ± 1 C) plates: Add "water-filled strips" to half fill the plates Wash 4 x: BEP II 100 µl HIV Conjugate 1 Solution 30 min ± 2 min (37 ± 1 C) Wash 4 x: BEP II 100 µl HIV Conjugate 2 30 min ± 2 min (37 ± 1 C) Wash 4 x: BEP II 75 µl Working Chromogen Solution 30 min ± 2 min (+15 to +25 C, protected from light) 75 µl Stopping Solution after max. 1 h Read at 450 nm (Reference wavelength: 650 nm) Test result Fully automatic processing Test result MENU NO OPERATE 1 YES Dispense Sample Buffer WASHINGS 0 DISP VOL 25 CHANNEL NO 3 NO OPERATE 2 YES Wash and dispense Conjugate 1 WASHINGS 4 DISP VOL 100 CHANNEL NO 1 NO OPERATE 3 YES Wash and dispense Conjugate 2 WASHINGS 4 DISP VOL 100 CHANNEL NO 2 NO OPERATE 4 YES Wash and dispense chromogen WASHINGS 4 DISP VOL 75 CHANNEL NO 4 NO OPERATE 5 YES Dispense Stopping Solution WASHINGS 0 DISP VOL 75 CHANNEL NO 5 YES MEAS WL 450 REF WL 650 BLK COR NO EVAL MODE 1 GEN CUT NO NEG CONT 3 MAX NEG MIN NEG - FACT NEG - MAX POS - THRESH CUT OFF - OQTO G11 C0541 (1584) H 10

11 Enzygnost HIV Integral Anwendungsbereich und -zweck Enzymimmunoassay zum qualitativen Nachweis einer HIV Infektion basierend auf der Bestimmung von HIV p24-antigen, Antikörpern gegen die humanen Immundefizienz Viren der Klasse 1 und 2 (HIV 1 und HIV 2), sowie Antikörpern gegen das HIV 1-Subtyp O-Virus in Serum und Plasma. Die Abarbeitung des Enzymimmunoassays erfolgt mit den ELISA Prozessoren BEP II, BEP III und BEP Der Test wurde entwickelt für die Untersuchung von Einzelproben, nicht von gepoolten oder verdünnten Proben. Das Produkt darf nur für in vitro diagnostische Zwecke angewendet werden. Diagnostische Bedeutung Das erworbene Immundefizienzsyndrom (AIDS) wurde erstmalig 1981 als eigenständiges Krankheitsbild erkannt. Als ursächlicher Erreger gelten heute zwei verschiedene Human Immundefizienz Viren (HIV 1 und HIV 2). Die Isolierung des HIV 1 (Synonym: LAV/HTLV III) gelang bereits 1983 (1, 2). Im Jahre 1986 wurde ein weiteres Virus (HIV 2) isoliert, das ebenfalls als humanpathogen gilt (3). Die Bedeutung der serologischen Bestimmung von Antikörpern gegen HIV hat besonders für die Transfusionsmedizin unter dem Gesichtspunkt der Prävention zur Verhütung der weiteren Ausbreitung der Erkrankung einen hohen Stellenwert. Folgerichtig wurde ab 1985 die Testung von Spenderblut auf Anti-HIV 1-Antikörper sowohl in Blutbanken als auch bei Herstellern von Plasmaprodukten obligatorisch. Zwischenzeitliche Informationen über die Verbreitung von HIV 2-Infektionen ergaben das Bedürfnis einer routinemäßigen Untersuchung von Blutspendern außer auf Anti-HIV 1- auch auf Anti-HIV 2-Antikörper, um eine potentielle Übertragung durch Transfusion oder aus Blut hergestellten Präparaten nach Möglichkeit auszuschließen. Im Jahre 1990 wurde ein neuartiges HIV beschrieben, welches zunächst serologisch als wenig relevant eingeordnet wurde (4). Erst 1994 gelang gleichzeitig die Sequenzierung dieses neuen Subtyps bei zwei unabhängigen Arbeitsgruppen (5,6). Parallel zu den virologischen Arbeiten konnte von mehreren Arbeitsgruppen die serologische Bedeutung von dem nun als HIV 1- Subtyp O (7,8) genannten Virus gezeigt werden. Danach zeigen eine Vielzahl von Anti-HIV 1+2- Assays Schwächen bei der Detektion von Anti-Subtyp O (9). Folgerichtig entstand der Bedarf zum gleichzeitigen sicheren Nachweis dieser neuen HIV-Variante und den etablierten HIV 1- und HIV 2-Isolaten. Bei einigen HIV-Seroconversionen wurde HIV p24-antigen nachgewiesen, bevor HIV-Antikörper gefunden wurden. Um das diagnostische Fenster zwischen HIV-Infektion und dem ersten serologischen Nachweis noch weiter zu schließen, war es daher sinnvoll, den Antikörpertest um eine HIV p24-antigen Erkennung zu erweitern. Obwohl die Bestimmung von HIV-spezifischen Antikörpern und/oder Antigen keine sicheren Aussagen darüber erlaubt, ob zum Zeitpunkt der Blutentnahme infektiöses HIV 1 bzw. HIV 2 im Blut vorhanden ist, als auch bei negativem Ergebnis keineswegs die Anwesenheit von HIV 1 oder HIV 2 sicher ausgeschlossen werden kann, stellt der kombinierte Antigen-/Antikörpertest dennoch die derzeit beste Möglichkeit dar, Blutspenden von HIV-Infizierten mit sehr großer Wahrscheinlichkeit zu erkennen und zu eliminieren. Prinzip der Methode Enzygnost HIV Integral ist ein Enzymimmunoassay, basierend auf der gleichzeitigen Bestimmung von HIV-Antigen und HIV-Antikörper. Die in der Untersuchungsprobe vorhandenen HIV-spezifischen Immunglobuline reagieren im ersten Schritt mit den in den Vertiefungen der Mikrotitrationsplatten fixierten HIV 1-, HIV 2- und/ oder HIV 1(Subtyp O)- rekombinanten Proteinen/ synthetischen Peptiden. Simultan können in der Untersuchungsprobe vorhandene HIV-p24-Antigene an die fixierten polyklonalen Anti-HIV-p24-Antikörper binden. Nach Entfernung der ungebundenen Probenbestandteile werden im zweiten Schritt die spezifisch gebundenen Antikörper durch Biotin-konjugierte HIV 1-, HIV 2- und /oder HIV 1 (Subtyp O)- rekombinante Proteine / synthetische Peptide markiert (Antigen-Sandwich). Simultan werden gebundene HIV-Antigene durch Biotin-konjugierte monoklonale HIV-p24-Antikörper markiert (Antikörper -Sandwich). OQTO G11 C0541 (1584) H 11 Ausgabe Oktober 2003

12 Nach Entfernung der ungebundenen Biotin-Konjugate reagiert im dritten Schritt das Konjugat 2 (Streptavidin/POD) mit den spezifischen an die Festphase gebundenen Biotin-Konjugaten. Nach Entfernung des überschüssigen Konjugat 2 wird die gebundene Enzymaktivität des Konjugates bestimmt (blaue Farbreaktion). Die enzymatische Umsetzung des Chromogens wird durch Zusatz von Stopplösung POD unterbrochen (gelbe Farbreaktion). Die Farbintensität ist der in der Probe vorhandenen HIV-p24 Antigen- und HIV-Antikörper-Konzentration proportional. Reagenzien Inhalt der Handelspackung 2 x x 96 Enzygnost HIV Integral: 2 Testplatten 10 Testplatten HIV-Konjugat 1: 2 x 1 Flasche 10 x 1 Flasche HIV-Konjugat-Puffer 1: 2 x 15 ml 10 x 15 ml HIV-Konjugat 2: 2 x 15 ml 10 x 15 ml HIV-Probenpuffer: 2 x 15 ml 4 x 15 ml HIV-Kontrolle, positiv: 2 x 1,4 ml 3 x 1,4 ml HIV-Kontrolle, negativ: 2 x 2,0 ml 3 x 2,0 ml Etikett "Leerflasche für HIV-Konjugat 1" - 1 Stück Etikett "Leerflasche für HIV-Konjugat 2" - 1 Stück Packungsbeilage 1 Stück 1 Stück Barcode-Wertetabelle 1 Stück 1 Stück PE-Beutel 1 Stück 1 Stück Zusätzlich benötigte Materialien für die Packungen 2 x 96 und 10 x 96: Zusatz-Reagenzien für Enzygnost TMB (Bestell-Nr. OUVP) Zusammensetzung Enzygnost HIV Integral Testplatte Mit einem Gemisch aus rekombinanten Proteinen (E.Coli) und synthetischen Peptiden aus HIV 1 gp41, HIV 1 (Subtyp O) gp41, HIV 2 gp36, sowie polyklonalen Antikörpern (Kaninchen) gegen HIV p24 beschichtete Mikrotitrationsplatte. HIV-Konjugat 1 Lyophilisat aus HIV 1-, HIV 2- und HIV 1(Subtyp O) -rekombinantem HIV-Protein (E.Coli)/ synthetischen Peptiden und monoklonalen Antikörpern (Maus) gegen HIV p24, Biotin-konjugiert; blau gefärbt. Rekonstitution mit 15 ml HIV-Konjugat-Puffer 1. HIV-Konjugat-Puffer 1 Tris-Puffer mit Sapogenat* und Casein; gelb gefärbt. Konservierungsmittel: Phenol (max. 1g/l) HIV-Konjugat 2 Tris-Puffer mit Sapogenat* und Streptavidin, Peroxidase (POD)-konjugiert; rot gefärbt. Konservierungsmittel: Phenol (max. 1g/l) HIV-Probenpuffer Phosphat-Puffer mit Casein und Triton X 100*; rot gefärbt. Konservierungsmittel: Phenol (max. 1g/l) HIV-Kontrolle, positiv Hitzebehandeltes Humanserum mit Antikörpern gegen HIV 1-Antigene, stabilisiert. Extinktionsrichtwert: 0,7 Konservierungsmittel: Phenol ( max. 1g/l) HIV-Kontrolle, negativ Humanserum ohne HIV-Antigen und ohne Antikörper gegen HIV 1-, HIV 2- und HIV1 (Subtyp O)-Antigene, stabilisiert. Extinktionsrichtwert: 0,15 Konservierungsmittel: Phenol (max. 1g/l) OQTO G11 C0541 (1584) H 12

13 Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen 1. Nur zur in vitro diagnostischen Anwendung. 2. Jede individuelle Blutspende, die zur Herstellung von Kontroll-Sera vorgesehen ist, wurde auf HBsAg, Anti-HCV, Anti-HIV 1 und Anti-HIV 2 untersucht. Für die Herstellung des Kontroll- Serums, negativ, werden nur Sera mit negativem Befund verwendet. Das positive Kontroll- Serum wurde hitzebehandelt ( mindestens 1 Stunde bei + 56 C). Unabhängig davon sollten alle aus menschlichem Blut gewonnenen Proben (z. B. Patientensera) und Produkte (z.b. Kontrollsera) wegen nie völlig auszuschließender Gefährdung durch Krankheitserreger mit angemessener Sorgfalt unter Einhaltung der bei Biogefährdung empfohlenen Sicherheitsmaßnahmen gehandhabt werden (10). 3. Das Tragen von Untersuchungshandschuhen während der gesamten Testdurchführung wird angeraten. 4. Für die Entsorgung fester infektiöser Materialien empfiehlt sich eine Autoklavierung von mindestens 1 Stunde bei +121 C. Alle abgesaugten Lösungen sind in zwei hintereinandergeschalteten Vorlagen zu sammeln. Die Vorlagen sollten ein Desinfektionsmittel enthalten, das geeignet ist, human-pathogene Viren zu inaktivieren. Die vom Hersteller angegebenen Konzentrationen und Einwirkungszeiten müssen beachtet werden. Vorbereitung der Reagenzien Alle Reagenzien und Proben vor Testbeginn auf +15 bis +25 C erwärmen. Dabei die Testplatte nicht dem Behältnis entnehmen. Für die Testdurchführung nicht benötigte Riegel dem Halterahmen entnehmen und für die spätere Verwendung lagern (siehe Tabelle 1). Der Packung Enzygnost HIV Integral 10 x 96 liegt je ein barcodiertes Etikett für das HIV-Konjugat 1 und das HIV-Konjugat 2 bei. Um bei großen Serienlängen einen häufigen Spritzenwechsel am BEP III zu vermeiden, kann es sinnvoll sein, mehrere Abfüllungen der Konjugate in eine größere Flasche (z.b. noch unbenutzte überzählige Leerflaschen für Chromogen-Gebrauchslösung, siehe Zusätzlich benötigte Materialien) umzuschütten, mit dem jeweiligen Etikett "Leerflasche für Konjugat..." zu etikettieren und ins Reagenzienrad einzustellen. Je Testplatte 20 ml Waschlösung POD (Zusatzreagenzien-Kit) mit destilliertem oder entionisiertem Wasser auf 400 ml verdünnen. Je Testplatte 1 ml Chromogen TMB mit 10 ml Puffer/Substrat TMB (Zusatzreagenzien-Kit ) in der mitgelieferten Leerflasche verdünnen (Chromogen-Gebrauchslösung ) und verschlossen unter Lichtschutz aufbewahren. Flasche nach Gebrauch sorgfältig mit destilliertem Wasser spülen. Wegen technisch bedingter Überfüllung ist das Überführen des Flascheninhalts von Chromogen TMB in die Abfüllung Puffer/Substrat TMB nicht zulässig. HIV-Konjugat 1-Lösung: Den gesamten Inhalt einer Flasche HIV-Konjugat-Puffer 1 (15 ml, gelb gefärbt ) in eine Flasche HIV-Konjugat 1 (Lyophilisat, blau gefärbt) überführen. Durch leichtes Schwenken das Lyophilisat vollständig auflösen. Die HIV-Konjugat 1-Lösung ist dann grün gefärbt. Vor Gebrauch sollte die HIV-Konjugat 1-Lösung mindestens 15 Minuten äquilibrieren. Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen Ungeöffnet sind alle Bestandteile der Kombinationspackung Enzygnost HIV Integral bei einer Lagertemperatur von +2 bis +8 C bis zu den auf den Etiketten angegebenen Daten verwendbar. Die Haltbarkeit und Lagerbedingungen der geöffneten Reagenzien sind der Tabelle 1 im Anhang zu entnehmen. Erforderliche Geräte: BEP II: Zur automatischen Durchführung der Reagenzien-Dosierung und der Waschschritte BEP III: Zur automatischen Testabarbeitung nach der Probendosierung sowie Auswertung BEP 2000: Zur vollautomatischen Testabarbeitung sowie Auswertung Pipetten: Kolbenhubpipetten 25, 100 und 1000 µl Inkubator: Bedecktes Wasserbad (+37 ± 1 C) oder vergleichbare Inkubationsmethoden Alle zur Testdurchführung eingesetzten Geräte müssen validiert sein. OQTO G11 C0541 (1584) H 13

14 Untersuchungsmaterial Zur Untersuchung können Einzelproben (Human-Seren oder EDTA/Heparin/Citrat-Plasmen) verwendet werden, welche nach Standard-Labortechniken entnommen wurden. Die Proben sollten maximal 3 Tage bei +2 bis +8 C gelagert werden. Zur längeren Lagerung sind die Proben einzufrieren. Methodik Testdurchführung mit BEP II 1. Ansatzschema: Benötigte Anzahl der Auftragstellen feststellen ( = Anzahl der zu untersuchenden Proben plus 5 Vertiefungen für Kontrollen). 2. Probenpufferdosierung: 25 µl Proben-Puffer je Vertiefung vorlegen. 3. Probendosierung: In 3 Vertiefungen je 100 µl HIV-Kontrolle, negativ (A1 bis C1), in 1 Vertiefung 100 µl HIV-Kontrolle, positiv ( D1 ), in die folgenden Vertiefungen je 100 µl unverdünnte Probe dosieren und am Ende der Serie bzw. Testplatte noch einmal 100 µl HIV- Kontrolle, positiv einpipettieren. Alternativ zu oben aufgeführtem Pipettierschema ist es auch erlaubt, die HIV-Kontrolle, positiv in Doppelbestimmung am Anfang der Testreihe aufzutragen. Pipettierschema: In 3 Vertiefungen je 100 µl HIV-Kontrolle, negativ ( A1 bis C1 ), in 2 Vertiefungen je 100 µl HIV-Kontrolle, positiv ( D1 und E1 ) und in die folgenden Vertiefungen je 100 µl unverdünnte Probe dosieren. Die Pipettiervorgänge sollten innerhalb von 30 min pro Testplatte durchgeführt werden. 4. Probeninkubation: Die Testplatte mit Folie abkleben und 30 ± 2 min bei 37 ±1 C inkubieren, Waschvorgang unmittelbar anschließen. 5. Waschen: Folie abziehen, alle Vertiefungen aussaugen und mit je ca. 0,3 ml Waschlösung 4 mal waschen. 6. Dosierung von HIV-Konjugat 1-Lösung: In jede Vertiefung 100 µl HIV Konjugat 1-Lösung einfüllen, mit neuer Folie abkleben und sofort in den Inkubator stellen. 7. HIV-Konjugat 1 - Inkubation: 30 ± 2 min bei 37 ± 1 C, wie unter 4. beschrieben, inkubieren, Waschvorgang unmittelbar anschließen. 8. Waschen: Folie entfernen und wie unter 5. beschrieben, 4mal waschen. 9. Dosierung von HIV-Konjugat 2: In jede Vertiefung 100 µl des HIV-Konjugates 2 einfüllen, mit neuer Folie abkleben und sofort in den Inkubator stellen. 10. HIV-Konjugat 2-Inkubation: 30 ± 2 min bei 37 ± 1 C, wie unter 4. beschrieben, inkubieren, Waschvorgang unmittelbar anschließen. 11. Waschen: Folie entfernen und wie unter 5. beschrieben, 4 mal waschen. 12. Substratdosierung: In jede Vertiefung 75 µl der Chromogen-Gebrauchslösung einfüllen. 13. Substratinkubation: Mit neuer Folie abkleben und 30 ± 2 min bei +15 bis +25 C lichtgeschützt inkubieren. 14. Stoppreaktion: Folie entfernen. Je Vertiefung 75 µl Stopplösung POD zugeben, dabei den gleichen Zeittakt wie bei Punkt 12. einhalten. 15. Messung: Innerhalb einer Stunde bei 450 nm photometrieren. Als Wellenlänge der Referenzmessung wird 650 nm (ggfs. zwischen 615 nm und 690 nm) empfohlen. Testdurchführung mit BEP III Bei der Abarbeitung mit BEP III müssen die Testplatten einschließlich der Probendosierung (Punkt 1 und 2 der "Testdurchführung mit BEP II") vorbereitet werden. Unmittelbar im Anschluss daran werden die Testplatten offen, d.h. nicht mit Folie abgeklebt, in den BEP III eingegeben. Dabei ist zu beachten, dass teilbestückte Testplatten mit "Wasserriegeln" auf mindestens halbe Testplatten (6 Testriegel) zu ergänzen sind. Die anschließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch (siehe BEP III-Bedienungsanleitung). Die in der BEP III Software eingestellten Inkubationszeiten können auf Grund der technischen Rahmenbedingungen (Gerätetaktung) von denen der BEP II Prozessierung abweichen, sind jedoch in der Kombination BEP III/Enzygnost validiert worden. Testdurchführung mit BEP 2000 Die Probendosierung und anschließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch im Gerät (siehe BEP 2000-Bedienungsanleitung). OQTO G11 C0541 (1584) H 14

15 Testvalidierung Die Einzelmeßwerte der Extinktionen für die Kontroll-Sera werden zur Berechnung der Mittelwerte eingesetzt, wenn: -0,010 E neg. 0,150 E pos. 0,700 Von den drei Extinktionswerten der negativen Kontrolle kann ein außerhalb der Spezifikation liegender Wert vernachlässigt werden. Die Extinktionswerte der positiven Kontrolle müssen beide die Spezifikation erfüllen. Werden diese Spezifikationen nicht erfüllt, ist der Test zu wiederholen. Testauswertung Die Auswertungen erfolgen mit BEP 2000 und BEP III automatisch. Bitte dazu die Bedienungsanleitungen heranziehen. Die nachfolgenden Kapitel sind bei Auswertung ohne Softwareunterstützung zu beachten. Aus den Extinktionswerten der negativen Kontrolle wird der Mittelwert gebildet. Zur Grenzwertberechnung wird zum Extinktionsmittelwert der negativen Kontrolle ein Wert von 0,450 addiert. Grenzwert (cut off) = E neg. + 0,450 Als grenzwertiger Bereich wird definiert: Grenzwert bis Grenzwert - 0,05 Nach den Kriterien des Tests werden die Untersuchungsproben wie folgt klassifiziert: Testergebnis: 1. E Probe < cut off - 0,05 = "negativ" 2. E Probe > cut off = "reaktiv" 3. cut off - 0,05 E Probe cut off = "grenzwertig" Proben, die Extinktionswerte im grenzwertigen Bereich oder höhere Extinktionen ergeben, sind in Doppelbestimmung erneut zu testen. Ergeben sich für initial reaktive Proben bei beiden Einzelwerten der Wiederholungstestung Extinktionswerte unterhalb des grenzwertigen Bereiches, ist die Probe nach den Kriterien des Tests als negativ anzusehen. Bei erneut grenzwertigem oder höherem Extinktionswert bei mindestens einem der beiden Einzelwerte gilt die Probe als wiederholt reaktiv. Alle wiederholt reaktiv reagierenden Proben sollten unbedingt einer Bestätigung mit Hilfe sogenannter Konfirmationstests (z.b. Immunoblot, Nucleinsäure-Analyse) zugeführt werden. Sicherheitshalber sollte eine Folgeabnahme (ungefähr 2 Wochen später) erneut analysiert werden. Einschränkungen und Fehlerquellen 1. Antikoagulantien wie Heparin, EDTA und Citrat beeinflussen das Testergebnis nicht. 2. Hämolytische oder ikterische Proben führen zu keiner Testbeeinträchtigung. 3. Proben mit den potentiell störenden Substanzen ANA, Antikörpern gegen E.-Coli und EBV, sowie Seren von Schwangeren wurden mit dem Test überprüft. Mit den eingesetzten Proben wurde keine Beeinflussung des Testergebnisses beobachtet. 4. Bei hitzebehandelten Proben ( 30 min, 56 C ) wurde keine Störung beobachtet. 5. Ungenügend geronnene Seren und mikrobiell kontaminierte Untersuchungsproben sollten nicht eingesetzt werden. Eventuell vorhandene partikuläre Komponenten (z.b. Fibrin-Gerinnsel, Erythrozyten) sollten vor der Testdurchführung entfernt werden. 6. Lipämische, rheumafaktorhaltige, AMA-haltige, sowie Proben mit Antikörpern gegen HAV können zu erhöhter Reaktivität führen. 7. Enzygnost HIV Integral ist ein Test zum gleichzeitigen Nachweis von HIV p24-antigen und HIV- Antikörpern und darf nicht zur alleinigen Detektion von HIV p24-antigen eingesetzt werden. OQTO G11 C0541 (1584) H 15

16 8. Bei aufgetauten Proben ist auf eine gute Homogenisierung des Materials zu achten. 9. Die Reagenzien (ausgenommen Waschlösung POD, Stopplösung POD und die aus den chargengebundenen Reagenzien Chromogen TMB und Puffer/Substrat TMB hergestellte Chromogen-Gebrauchslösung) sind nur chargengebunden zu verwenden, d. h. nur in der Kombination der einzelnen 6-ziffrigen Chargen-Bezeichnung (Ch.-B.), die auf der Packung aufgedruckt, bzw. der separat beigepackten Barcode-Wertetabelle zu entnehmen sind. 10. Puffer/Substrat TMB, Chromogen-Gebrauchslösung und Stopplösung POD dürfen nicht in Kontakt mit Schwermetallionen oder oxidierenden Substanzen kommen (keine Pipetten mit flüssigkeitsführenden Metallteilen verwenden). Die Substratreaktionen nicht in der Nähe von Hypochlorit-haltigen Desinfektionsmitteln durchführen. Eine spontane Blaufärbung der Chromogen-Gebrauchslösung vor der Übertragung in die Testplatte deutet auf Kontamination hin; eine frische Lösung ist in einem sauberen Gefäß anzusetzen. Hautkontakt mit den vorgenannten Lösungen ist zu vermeiden. 11. Die Testplatte soll während der Inkubation ruhig liegen ( z. B. auf fixierter Schwimmhilfe oder im nicht zirkulierenden Wasserbad); die Kavitäten sind dabei in Kontakt mit dem temperierten Wasser. Werden Stabilisatoren zur Verhinderung der Verkeimung des Wassers verwendet, so ist sorgfältig darauf zu achten, daß weder die Testplattenoberfläche noch die Näpfchen mit diesen Lösungen in Kontakt kommen, da dadurch unspezifische Reaktionen hervorgerufen werden können. 12. Bei stark reaktiven Proben kann bei der Stoppreaktion der Farbstoff ausfallen. Die photometrische Auswertung wird dadurch nicht beeinflußt. 13. Die Kontrollsera sind unter Verwendung nativer Humansera hergestellt. Daher können Trübungen auftreten, die das Testergebnis jedoch nicht beeinflussen. 14. Die Testplatte vor Testbeginn nicht längere Zeit dem direkten Sonnenlicht aussetzen. Leistungsmerkmale des Tests Sensitivität und Spezifität Die Ergebnisse zur Prüfung der Sensitivität und Spezifität sind in den Tabellen ( im Anhang) zusammengefasst. Bei der Ermittlung der Sensitivität wurden insgesamt 515 Anti-HIV 1, 164 Anti-HIV 2, 26 Anti-HIV 1 ( Subtyp O ) und 64 HIV-Antigen positive Proben untersucht. Alle getesteten HIV-Antigen/-Antikörper positiven Proben wurden nach den Kriterien des Enzygnost HIV Integral positiv gefunden. Die Reaktivität des Tests bei Serokonversionsproben wurde anhand von 34 Serokonversionspanel untersucht. Dabei zeigt sich, dass Enzygnost HIV Integral eine verbesserte Sensitivität bzgl. der Erkennung von Serokonversionen gegenüber reinen HIV- Antikörper-Testen aufweist. Unabhängig davon kann nicht ausgeschlossen werden, dass sich bei breiter Anwendung des Tests einzelne Proben dem Nachweis entziehen können. Bei der Testung des SFTS Panel (1996) wurde die mit 250 pg HIV-Antigen/ml deklarierte Probe (Nr. 2024) reproduzierbar positiv gefunden. Durch Testung der mit 100 pg und der mit 250 pg HIV Antigen/ml deklarierten Verdünnungsstufen des SFTS-Panels wurde eine analytische Sensitivität zwischen 100 und 250 pg HIV Antigen/ml ermittelt. Bei der Ermittlung der Spezifität wurden insgesamt 8851 HIV-negative Blutproben untersucht und eine Spezifität von 99,3 bis 99,95 % ( initiale Testung ) bzw. 99,7 bis 100 % (Retestung) ermittelt. Bedingt durch das Untersuchungskollektiv, die Testdurchführung u.a. sind abweichende Werte möglich. Nach derzeitigem Kenntnisstand kann aus einem positiven Ergebnis der HIV-Testung nicht mit Sicherheit abgeleitet werden, dass infektiöses HIV 1 oder HIV 2 im Blut vorhanden ist, wie auch ein negatives Testergebnis keineswegs die Anwesenheit von HIV 1 oder HIV 2 sicher ausschließt. Reproduzierbarkeit Die Ergebnisse zur Intra/Inter-assay-Reproduzierbarkeit sind der Tabelle 4 ( im Anhang ) zusammengefasst. Es handelt sich hierbei um beispielhaft ermittelte Daten. Abhängig von der Testdurchführung u. a. sind durchaus abweichende Werte möglich. Enzygnost und BEP sind eingetragene Marken der Dade Behring Marburg GmbH in den USA, Deutschland und anderen Ländern. * Sapogenat ist eine Marke von Clariant. Triton X 100 ist eine Marke von Merck. Dade Behring Marburg GmbH 0197 Emil-von-Behring-Str. 76 D Marburg OQTO G11 C0541 (1584) H 16

17 Tab. 1 Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen Material/Reagenz Zustand Lagerung Stabilität* Enzygnost HIV Integral Testplatte nach Öffnen +2 bis +8 C 4 Wochen im Beutel mit Trockenpatronen HIV-Konjugat 1 nach +2 bis +8 C 4 Wochen Rekonstitution +15 bis +25 C 2 Tage HIV-Konjugat 2 nach Öffnen +2 bis +8 C 4 Wochen +15 bis +25 C 2 Tage HIV-Probenpuffer nach Öffnen +2 bis +8 C 4 Wochen HIV-Kontrolle, positiv nach Öffnen +2 bis +8 C 4 Wochen -20 C 3 Monate HIV-Kontrolle, negativ nach Öffnen +2 bis +8 C 4 Wochen -20 C 3 Monate Chromogen TMB nach Öffnen +2 bis +8 C Verfalldatum Puffer/Substrat TMB nach Öffnen +2 bis +8 C Verfalldatum Chromogen-Gebrauchslösung verdünnt +2 bis +8 C 5 Tage bis +25 C 8 Stunden geschl. Gefäß, lichtgeschützt Waschlösung POD nach Öffnen +2 bis +8 C Verfalldatum (Konzentrat) verdünnt 1:20 +2 bis +8 C 1 Woche verdünnt 1: bis +25 C 1 Tag Stopplösung POD nach Öffnen +2 bis +8 C Verfalldatum * in keinem Fall länger als bis zum Verfalldatum OQTO G11 C0541 (1584) H 17

18 Tab. 2 Sensitivität Bei den Untersuchungen von Sensitivität wurden folgende Daten ermittelt: Probenkollektiv Probenanzahl Initial reaktiv Anti-HIV 1 pos Anti-HIV 2 pos Anti-HIV 1 (Subtyp O) pos HIV-Antigen pos * Serokonversionspanel 34 HIV Panels Sensitivität gegenüber HIV- Antikörper Testen verbessert * Bei frühen Serokonversionsproben haben HIV-p24-Antigen-Teste für die HIV-Antigen-Detektion eine bessere Nachweisempfindlichkeit. Tab. 3 Spezifität Bei der Untersuchung zur Spezifität wurden folgende Daten ermittelt: Probenkollektiv Probenanzahl Initial reaktiv Retest reaktiv Negative Seren (A) Negative Seren (B) Negative Seren (C) Negative Plasmen (D) Tab. 4 Reproduzierbarkeit Bei der Untersuchung zur Intra-assay-Reproduzierbarkeit wurden die Proben an 5 Tagen in jeweils 8fach-Bestimmung getestet. Die Berechnung des Variationskoeffizienten (VK) erfolgt nach dem Varianzkomponentenmodell. Enzygnost HIV Integral Probe Extinktionsmittelwert % VK P1 0,817 4,4 P2 1,781 5,7 P3 1,202 4,4 P4 0,519 3,8 Bei den Untersuchungen zur Inter-assay-Reproduzierbarkeit wurden die Proben an 5 Tagen in jeweils 8fach-Bestimmung getestet. Die Berechnung des Varationskoeffizienten (VK) erfolgte nach dem Varianzkomponentenmodell. Enzygnost HIV Integral Probe Extinktionsmittelwert % VK P1 0, P2 1,781 5,9 P3 1,202 2,3 P4 0,519 4,1 OQTO G11 C0541 (1584) H 18

19 Tab. 5 Testdurchführung und -programmierung Enzygnost HIV Integral Testdurchführung Menüprogrammierung (BEP II, BEP III, BEP 2000) für den Vorbereitung der Reagenzien BEP 2000 BEP II BEP II 25 µl HIV-Probenpuffer 3 x 100 µl HIV-Kontrolle, negativ 1 x 100 µl HIV-Kontrolle, positiv je 100 µl unverdünnte Probe 1 x 100 µl HIV-Kontrolle, positiv BEP III 30 min ± 2 min teilbestückte Platten mit (37 ± 1 C) Wasserriegeln auf halbe Platten ergänzen 4 x Waschen: BEP II 100 µl HIV-Konjugat 1-Lösung 30 min ± 2 min (37 ± 1 C) 4 x Waschen: BEP II 100 µl HIV-Konjugat 2 30 min ± 2 min (37 ± 1 C) 4 x Waschen: BEP II 75 µl Chromogengebrauchslösung 30 min ± 2 min (+15 bis +25 C, lichtgeschützt) 75 µl Stopplösung nach maximal 1 h Auswertung 450 nm (Referenzwellenlänge: 650 nm) Testergebnis automatische Testabarbeitung Testergebnis MENU NO OPERATE 1 YES Dosierung Probenpuffer WASHINGS 0 DISP VOL 25 CHANNEL NO 3 NO OPERATE 2 YES Waschen und Dosierung Konjugat 1 WASHINGS 4 DISP VOL 100 CHANNEL NO 1 NO OPERATE 3 YES Waschen und Dosierung Konjugat 2 WASHINGS 4 DISP VOL 100 CHANNEL NO 2 NO OPERATE 4 YES Waschen und Dosierung Chromogen WASHINGS 4 DISP VOL 75 CHANNEL NO 4 NO OPERATE 5 YES Dosierung Stopplösung WASHINGS 0 DISP VOL 75 CHANNEL NO 5 YES MEAS WL 450 REF WL 650 BLK COR NO EVAL MODE 1 GEN CUT NO NEG CONT 3 MAX NEG MIN NEG - FACT NEG - MAX POS - THRESH CUT OFF - OQTO G11 C0541 (1584) H 19

20 Enzygnost HIV Integral Domaine d utilisation et indication Test immunoenzymatique pour la mise en évidence qualitative d une infection à VIH, basée sur la détection de l antigène VIH p24, des anticorps anti-virus de l immunodéficience humaine des classes 1 et 2 (VIH 1 et VIH 2), ainsi que des anticorps anti-vih 1 sous-type O, dans le sérum ou le plasma. La réalisation du test immunoenzymatique se fait à l aide des ELISA Processeurs BEP II, BEP III et BEP Le test a été mis au point pour l analyse d échantillons individuels, et non pas d échantillons poolés ou dilués. Le produit ne doit être utilisé qu'à des fins de diagnostic in vitro. Intérêt diagnostique Le Syndrome d immunodéficience acquise (SIDA) a été reconnu pour la première fois en 1981 comme tableau clinique autonome. Deux virus différents d immunodéficience humaine (VIH 1 et VIH 2) sont aujourd hui considérés comme responsables de la maladie. L isolement du VIH 1 (synonymes : LAV/HTLV III) a réussi dès 1983 (1, 2). En 1986, un deuxième virus (VIH 2), également pathogène pour l Homme, a été isolé (3). Le dosage sérologique des anticorps anti-vih présente un intérêt particulier pour la médecine transfusionnelle, puisqu il permet de prévenir la propagation de la maladie. Depuis 1985, la recherche d anticorps anti-vih 1 sur les dons de sang est obligatoire aussi bien pour les centres de transfusion sanguine que pour les fabricants de produits sanguins. Des informations complémentaires sur le développement d infections à VIH 2 ont depuis généralisé le dépistage en routine des anticorps anti-vih 1 et VIH 2, dans le souci d exclure le transfert possible de la maladie par la transfusion ou l utilisation de préparations sanguines. En 1990, un nouveau VIH a été décrit, auquel il n a tout d abord été attribué qu un faible intérêt sérologique (4). Ce n est qu en 1994 que deux équipes indépendantes ont réussi simultanément à définir la séquence de ce nouveau sous-type (5, 6). Parallèlement aux travaux virologiques, plusieurs équipes de recherche ont pu montrer l intérêt sérologique du virus, aujourd hui appelé VIH 1- sous-type O (7, 8). Un grand nombre de tests anti-vih 1+2 ont alors montré qu ils révélaient difficilement les anticorps anti-sous-type O (9). Le besoin est donc apparu de disposer d un test fiable pour la recherche simultanée de ce nouveau variant VIH et des isolats VIH 1 et VIH 2 déjà établis. Dans quelques cas de séroconversions à VIH, l antigène VIH p24 a été révélé avant l apparition des anticorps anti-vih. Afin de fermer au maximum la fenêtre diagnostique entre l infection à VIH et la première manifestation sérologique, il était donc intéressant d élargir le test d anticorps à une reconnaissance de l antigène VIH p24. Bien que la mise en évidence d anticorps anti-vih spécifiques et/ou de l antigène ne permette pas de dire avec certitude si le sang contient du VIH 1 ou du VIH 2 infectieux au moment du prélèvement, de même qu un résultat négatif ne permet pas d exclure avec certitude la présence de VIH 1 ou de VIH 2, le test combiné antigène/anticorps constitue pourtant actuellement la meilleure solution pour dépister et éliminer avec une grande probabilité les donneurs infectés par le VIH. Principe de la méthode Enzygnost HIV Integral est un test immunoenzymatique, basé sur la recherche simultanée d antigènes VIH et d anticorps anti-vih. Les immunoglobulines HIV-spécifiques contenues dans l échantillon à tester réagissent dans un premier temps avec les protéines recombinantes et peptides synthétiques VIH 1, VIH 2 et/ou VIH 1 (sous-type O) fixés à la surface de la plaque de microtitration. Si l échantillon contient de l antigène VIH p24, celui-ci se fixe simultanément aux anticorps anti- VIH p24 polyclonaux fixés à la surface de la plaque de microtitration. Après élimination par lavage des éléments non liés de l échantillon, et dans une deuxième étape, les anticorps spécifiques liés sont marqués par les protéines recombinantes et peptides synthétiques VIH 1, VIH 2 et/ou VIH 1 (sous-type O) marqués à la biotine (technique sandwich antigène). Simultanément, l antigène VIH lié est marqué aux anticorps anti-vih p24 monoclonaux conjugués à la biotine (technique sandwich anticorps). Après élimination des conjugués à la biotine en excès, et dans une troisième étape, le conjugué 2 (streptavidine/pod) réagit avec les conjugués à la biotine spécifiques, liés à la phase solide. Après élimination du conjugué 2 en excès, l activité enzymatique du conjugué fixé est mesurée (réaction colorée bleue). La transformation enzymatique du chromogène est stoppée par l addition de Solution d arrêt POD (réaction colorée jaune). L intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration d antigène VIH p24 et d anticorps VIH présents dans l échantillon. OQTO G11 C0541 (1584) H 20 Edition Octobre 2003

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