GUÍA RÁPIDA DEL PROCESO DE IDENTIFICACIÓN Y ANÁLISIS FILOGENÉTICO DE RECURSOS GENÉTICOS, BASADO EN LA COMPARACIÓN DE SECUENCIAS DE ADN.

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1 1 GUÍA RÁPIDA DEL PROCESO DE IDENTIFICACIÓN Y ANÁLISIS FILOGENÉTICO DE RECURSOS GENÉTICOS, BASADO EN LA COMPARACIÓN DE SECUENCIAS DE ADN. CASO PARTICULAR DE BACTERIAS. Programas CHROMAS, DNA Star, EZ-TAXON, MEGA y CLUSTAL.

2 2

3 3 I. LIMPIEZA DE LA SECUENCIA EN EL PROGRAMA CHROMAS. Pg ABRIR EL CROMATROGRAMA. Pg ELIMINAR LOS EXTREMOS EN LOS QUE LA IDENTIFICACIÓN DE BASES NO ES FIABLE. Pg VOLTEAR LA SECUENCIA R (REVERSA) Y OBTENER LA COMPLEMENTARIA. Pg. 8 II. OBTENCIÓN DE LA SECUENCIA CONSENSO O CONTIG CON EL PROGRAMA DNASTAR Pg OBTENER AUTOMÁTICAMENTE LA SECUENCIA CONSENSO CON EL SUBPROGRAMA SEQMAN. Pg ABRIR LA SECUENCIA CON EL PROGRAMA Edit Seq. Pg. 16 III. IDENTIFICACIÓN DE LA BACTERIA PROBLEMA POR COMPARACIÓN DE LA SECUENCIA DEL GEN 16S rrna CON LA BASE DE DATOS EN LA QUE FIGURA ESTA SECUENCIA PARA TODAS LAS BACERIAS TIPO, DENOMINADA EZ-TAXON. Pg. 18 IV. ANÁLISIS DE LAS RELACIONES FILOGENÉTICAS ENTRE UBC. Pg REALIZAR EL ALINEAMIENTO MÚLTIPLE UTILIZANDO EL PROGRAMA MEGA. Pg CONSTRUIR EL ÁRBOL FILOGÉNÉTICO CON EL PROGRAMA MEGA. Pg. 29

4 4

5 5 Básicamente la técnica consiste en comparar la secuencia de un determinado gen o espacio intergénico, entre diferentes accesiones (UBC). Normalmente se compara la secuencia de una o varias UBC problema contra la misma secuencia de accesiones depositadas en las bases de datos. En primer lugar hay que limpiar la secuencia, a continuación hacer el contig y finalmente comparar la secuencia con las que están depositadas en las bases de datos, que es lo que se denomina alineación. Esta alineación puede tener una doble finalidad: (i) Por una parte puede tener como objetivo identificar la UBC en estudio por comparación, dos a dos, con las secuencias depositadas en las bases de datos. (ii) El segundo objetivo es realizar un estudio filogenético de la UBC. En este caso se realizarán comparaciones múltiples (lo que se denomina alineamiento múltiple) de la secuencia correspondiente a la UBC problema, con la misma secuencia en otras accesiones que estén filogenéticamente próximas El ejemplo que se presenta corresponde a la secuencia del gen 16S ADN de bacterias de suelo I. LIMPIEZA DE LA SECUENCIA EN EL PROGRAMA CHROMAS. 1. ABRIR EL CROMATROGRAMA. La extensión del cromatograma debe ser *.abi, *.ab1, *.scf, o *.esd. Para observar el cromatograma, no solamente la secuencia en forma de texto, debe pulsarse el icono señalado en la figura.

6 6 2. ELIMINAR LOS EXTREMOS EN LOS QUE LA IDENTIFICACIÓN DE BASES NO ES FIABLE. Es necesario realizar este proceso en ambos extremos. En el extremo izquierdo se selecciona con el ratón, la base a partir de la cual la secuencia es aceptable (leyendo de izquierda a derecha), y en el menú Edit se elige la opción Set Left Cutoff, con lo que la secuencia situada a la izquierda de dicha base queda resaltada en amarillo para su posterior eliminación.

7 7 En el extremo derecho se selecciona con el ratón, la base a partir de la cual la secuencia NO es aceptable (leyendo de izquierda a derecha), y en el menú Edit se elige la opción Set Right Cutoff, con lo que la secuencia situada a la derecha de dicha base queda resaltada en amarillo para su posterior eliminación.

8 8 Para hacer efectivo el corte, dentro del menú Edit se pulsa Delete Cutoff Sequences, con lo que desaparece la secuencia pero no el cromatograma. A continuación se graba la secuencia con el mismo nombre que tenía, pero añadiendo algún sufijo para identificar que corresponde a la secuencia corregida. IMPORTANTE: Esta tarea debe realizarse con las secuencias F y R de cada gen amplificado en cada UBC. 3. VOLTEAR LA SECUENCIA R (REVERSA) Y OBTENER LA COMPLEMENTARIA. Importante!! Esto solo se hace con la secuencia R. Una vez realizado el paso 2 para la secuencia R, antes de guardarla, es necesario voltear esta secuencia y obtener la complementaria, para poder unirla a la anterior y obtener la secuencia consenso o contig en un paso posterior. Para ello, en el apartado Edit se pulsa Reverse+Complement y posteriormente se procede a guardar el archivo, mediante el mismo proceso explicado en el paso 2.

9 9 II. OBTENCIÓN DE LA SECUENCIA CONSENSO O CONTIG CON EL PROGRAMA DNASTAR En el apartado I se ha explicado como limpiar y acondicionar las secuencias F y R de cada gen amplificado para cada UBC. En este apartado se va a explicar como unirlas (mediante la zona de solape) para obtener la secuencia consenso o Contig. 1. OBTENER AUTOMÁTICAMENTE LA SECUENCIA CONSENSO CON EL SUBPROGRAMA SEQMAN. Abrir el programa SEQMAN y en el menú File seleccionar New, lo que abre un nuevo proyecto. Inmediatamente se abre una ventana, que debe cerrarse con la opción Skip. Al cerrar esta nueva ventana se abre otra en la que se empieza a trabajar.

10 10

11 En esta nueva ventana se pulsa la Add Sequences 11 Alternativa: otra manera de llegar a la pantalla anterior es, desde la pantalla de inicio, pulsar en el menú principal Sequence y luego Add

12 Para poder recuperar los archivos corregidos con el programa Chormas es necesario señalar como Tipo de archivos: Abi Trace Files w/o Extension(*.*,*.abi,*.ab1) 12 Se seleccionan los dos archivos F y R de una misma accesión, se añaden con Add y luego se pulsa Done 1º 2º

13 Antes de realizar el análisis es preciso cambiar algunos parámetros. Para acceder a ellos se pulsa Project en el menú principal y luego en Parameters 13 En la siguiente figura se indican los parámetros a modificar:

14 Posteriormente se presiona Assemble y se obtiene en la ventan de la derecha la secuencia consenso o Contig. 14

15 Pulsando dos veces en Contig en la ventana de la derecha, aparece una nueva ventana con la secuencia consenso o contig. 15 Pulsando la opción Find conflict del menú desplegable Edit el programa resalta en rojo los conflictos detectados en la zona de solape del contig. Luego se corrigen a mano cada uno de ellos, tomando la decisión que parezca la más adecuada.

16 El último paso es guardar la secuencia consenso o contig, lo que se hace desde la opción Contig del menú principal, en la opción Save Consensus y Single File. Debe guardarse con dos extensiones diferentes: Como el archivo propio del programa (Lasergene DNA file (*.seq) Como archivo FastA (*.fas), para trabajar posteriormente en MEGA ABRIR LA SECUENCIA CON EL PROGRAMA Edit Seq. Para abrir la secuencia, hay que hacerlo en otro subprograma del programa DNA Star que es Edit Seq.

17 En el menú principal, se pulsa File y a continuación en el desplegable que se abre Open. 17

18 18 Para seguir trabajando con una nueva secuencia, primero se cierra con doble click del botón izquierdo del ratón ese contig, para empezar a trabajar en uno nuevo. Luego se siguen los pasos indicados en recuadro de la página 11. cerrado abierto III. IDENTIFICACIÓN DE LA BACTERIA PROBLEMA POR COMPARACIÓN DE LA SECUENCIA DEL GEN 16S rrna CON LA BASE DE DATOS EN LA QUE FIGURA ESTA SECUENCIA PARA TODAS LAS BACERIAS TIPO, DENOMINADA EZ-TAXON. En el caso de haber trabajado con bacterias, lo más probable es que se haya secuenciado el gen 16S rrna, en el que se basa la taxonomía. La identificación consiste en la comparación de dicha secuencia en la bacteria problema, con la secuencia de esa mismo gen para otras bacterias incluidas en la base de datos ez-taxon, que aloja la secuencia del gen 16S rrna para todas las cepas tipo. Se trabaja online, en la dirección web Para tener acceso es necesario registrarse como usuario. Una vez realizado el registro y el acceso, para proceder a identificar la UBC problema se accede en el menú de la izquierda a la opción Identify. A continuación se introduce el nombre asignado a la UBC en estudio y la secuencia consenso o contig que se ha obtenido con el programa Seq Man, para lo que es suficiente copiarla del Edit Seq (página 17) y pegarla en la casilla correspondiente del ez-taxon. Para proceder a la identificación se pulsa el botón Identify.

19 19 1º 2º

20 20 El resultado informa sobre la identidad de la bacteria depositada en la base de datos, que mayor similitud presenta con la bacteria problema, indicando el porcentaje de dicha similitud y el % de la secuencia que ha sido comparada. La página de resultados conserva la información de todas las identificaciones realizadas IV. ANÁLISIS DE LAS RELACIONES FILOGENÉTICAS ENTRE UBC. Se trabaja normalmente con varios programas. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) es una base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information USA), que permite comparar en tiempo real una determinada secuencia con todas las depositadas en dicha base de datos, indicando al mismo tiempo el grado de similitud. Por tanto realiza una tarea similar a la de EzTaxon MEGA. Se trata de un programa para realizar alineamiento múltiples y árboles filogenéticos. Para los alineamientos múltiples recurre a otro programa que es el de mayor difusión para realizar esta tarea, que es CLUSTAL, concretamente la versión CLUSTALW que es la versión que opera online.

21 21 1. REALIZAR EL ALINEAMIENTO MÚLTIPLE UTILIZANDO EL PROGRAMA MEGA. En primer lugar hay que abrir un nuevo archivo pulsando la techa Align y luego en el desplegable que se abre Edit/Build Alignment. Sucesivamente aparecen dos avisos a los que hay que responder, según se indica en las siguientes figuras, y a continuación se abre una nueva pantalla, en la que se añaden las secuencias que vayan a ser sometidas a un alineamiento múltiple.

22 En primer lugar se añaden las secuencias consenso o contig de las UBC problema (en el apartado II se ha explicado como se obtiene el contig ), presionado la tecla que se señala en la figura. Lo que se añade son archivos en formato FASTA, pues este fue uno de los formatos en los que se guardó la secuencia consenso o contig en el SeqMan, para poder incorporarlos al MEGA.

23 23 Se pueden añadir todas las secuencias a la vez o de una en una. Es posible que el programa no traslade correctamente el nombre de la UBC, por lo que habrá que corregirla a mano. Esto es especialmente importante, si se añaden todas las secuencias a la vez A continuación se añadirán las secuencias correspondientes a las UBC procedentes de las bases de datos. Una opción es importarlas de la base de datos BLAST. Presionando en la tecla que se señala en la figura, el programa redirecciona a dicha base de datos, abriéndose una nueva ventana. En esa nueva ventana se incluye el número de Locus en el Genebank de la secuencia que queramos recuperar y señalamos que se trata de una base de datos de nucleótidos (ver figura). Para ejecutar la búsqueda se pulsa la tecla BLAST que aparece al final de la pantalla.

24 24 El proceso de búsqueda se realiza online y tarda un cierto tiempo, al final se obtiene una pantalla como la que aparece en la figura. En esta pantalla aparece toda la información que guarda la base de datos BLAST sobre la UBC de la que se ha solicitado información, e indica cuales son los organismos más similares en lo que respecta a la secuencia del gen analizado (para verlo desplazar hacia abajo la ventana que se ha abierto). Para obtener la secuencia es preciso presionar sobre Query ID, obteniéndose la información que se observa en la figura siguiente, en la que como puede apreciarse está la secuencia del gen 16S rrna tal como se depositó en la base de datos BLAST.

25 A continuación se incorpora esta información en el programa MEGA. Para ello primero se presiona en Display Settings y se señala como tipo de formato FASTA (text) y luego se presiona Add To Alignment con lo que automáticamente se incorpora a MEGA: 25

26 26 Nota: Si se está trabajando con ez-taxon, otra manera de incorporar las secuencias de las bacterias procedentes de dicha base de datos, es guardar la información de la accesión y la secuencia en formato FASTA (existe una opción que así lo permite en el ez-taxon). Una vez que se dispone de las secuencias en formato FASTA, la introducción en el MEGA se realizará por el mismo procedimiento indicado en la pág. 22. Una vez que se dispone de todas las secuencias que se quieren alinear en el Alignment Explorer (ver Figura), el siguiente paso es seleccionarlas, lo que se ejecuta entrando en el menú desplegable Edit y seleccionado la opción Select All si se quieren utilizar todas ellas en el alineamiento. El alineamiento se realiza con Clustal W, pero esto puede hacerse directamente desde el programa MEGA, para lo que se entra en el menú desplegable Aligment y se selecciona la opción Align by ClustalW.

27 27 Aparece una pantalla en la que se pueden seleccionar algunos parámetros

28 28 De esta manera se obtiene el resultado del alineamiento múltiple.

29 Es necesario guardar el archivo resultante del alineamiento múltiple para posteriormente poder realizar un árbol filogenético. Para ello hay que recurrir a exportarlo, opción que se encuentra dentro del menú desplegable Data, y dentro de él Export Alignment. Es necesario elegir el formato. Si se va a seguir trabajando en el programa MEGA, la opción mejor es MEGA Format CONSTRUIR EL ÁRBOL FILOGÉNÉTICO CON EL PROGRAMA MEGA. En la página de inicio del programa MEGA se pulsa en la tecla Phylogeny con lo que se abre un menú desplegable, en el que debe elegirse el procedimiento para el cálculo de árbol filogenético.

30 30 Se abre una nueva ventana en la que el programa pide que introduzcamos el archivo a analizar, que es el de alineamiento múltiple obtenido según se ha explicado en el apartado anterior Una vez recuperado dicho archivo, se abra una nueva ventana, en la que hay que pulsar el botón Compute para realizar el análisis.

31 31 El resultado se presenta en una nueva ventana, en la que existen varias opciones para trabajar con este árbol

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