NOVA Lite TM HEp-2 ANA Kit Para Diagnóstico In Vitro Complejidad de CLIA: Alto
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- Álvaro Maestre del Río
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1 NOVA Lite TM HEp-2 ANA Kit Para Diagnóstico In Vitro Complejidad de CLIA: Alto Aplicación NOVA Lite TM HEp-2 es un ensayo por inmunofluorescencia indirecta para el screening y la determinación semicuantitativa de anticuerpos antinucleares (ANA) en suero humano. La presencia de anticuerpos antinucleares puede ser utilizada en conjunción con otros tests serológicos y resultados clínicos para ayudar en el diagnóstico de Lupus Eritematoso Sistémico (LES) y otras enfermedades reumáticas o del tejido conectivo. Sumario y Explicación de la prueba El término anticuerpos antinucleares describe una variedad de autoanticuerpos que reacciona con los constituyentes de los núcleos celulares incluyendo el ADN, ARN y varias proteínas y ribonucleoproteínas. 1 Estos autoanticuerpos aparecen con elevada frecuencia en pacientes con enfermedades reumáticas o del tejido conectivo, y especialmente en el caso del lupus eritematoso sistémico. De hecho, prácticamente todos los pacientes con LES son ANA positivos. Esta sensibilidad diagnóstica ha conducido a la incorporación del ensayo ANA en los Criterios Revisados para la Clasificación de Lupus Eritematoso Sistémico de 1982 realizados por una subcomisión del Colegio Americano de Reumatología. 2 Aunque los ensayos ANA son un excelente test de screening para el LES (un resultado negativo prácticamente permite descartar la presencia de LES 3 activo), no son, de ningún modo, un ensayo específico. Los pacientes con otras enfermedades del tejido conectivo, como la artritis reumatoide, el escleroderma y la dermatomiositis, dan con frecuencia resultados positivos, y también pueden observarse valoraciones de ANA bajas en otros estados patológicos y en la población normal. Pueden obtenerse resultados positivos para ANA en pacientes que han sufrido quemaduras graves o infecciones víricas y también se han dado casos en algunas personas normales sanas, especialmente en las poblaciones de mayor edad. Debido a esta ausencia de especificidad, se recomienda que todas las muestras con resultados positivos para ANA se valoren según el punto final y que se lleven a cabo ensayos más específicos para autoanticuerpos anti-adn de doble cadena (dsdna) y para autoanticuerpos anti-antígeno nuclear extraíble (ENA). La inmunofluorescencia indirecta es el método de referencia para los ensayos de ANA. Los substratos más comunes son secciones finas de órganos de roedor o diversos tipos de líneas celulares. Está generalmente aceptado que los substratos de líneas celulares son preferibles a las secciones de órganos ya que estas células de división rápida tienen niveles más elevados de ciertos antígenos relevantes desde el punto de vista clínico, incluyendo el centrómero, SS-A(Ro), Scl-70 y PCNA/Ciclina. Además del tipo de substrato, existen otros tres factores críticos para el funcionamiento de los ensayos de ANA: 1) el fijador utilizado para la preparación del portaobjetos, 2) la relación fluoresceína/proteína (F/P) y 3) la especificidad de subclase de inmunoglobulina del conjugado. Se conoce que algunos fijadores o combinaciones de los mismos destruyen ciertos antígenos nucleares y, por tanto, debería evitarse su uso. La sensibilidad y la tinción de fondo no específica de un conjugado se determina mediante la relación F/P, mientras que la especificidad patológica de un conjugado se determina mediante la reactividad de la subclase de inmunoglobulina. Prácticamente todos los autoanticuerpos significativos desde el punto de vista clínico muestran especificidad para la subclase IgG incluso en presencia de ANA específicos de la IgM y la IgA. 4 En contraposición, los ANA encontrados en donantes de sangre sanos son solamente de las subclases IgM y IgA. 5 Debido a esto, los conjugados específicos de la IgG son más específicos para la enfermedad. El substrato escogido para el kit NOVA Lite TM HEp-2 ANA es una línea de células epiteliales (HEp-2) humanas fijadas de forma óptima y el conjugado consiste en anticuerpos anti-igg humana purificados por afinidad con una relación F/P cuidadosamente seleccionada. Estos parámetros de reactivo permiten al test NOVA Lite TM HEp-2 ANA detectar autoanticuerpos relevantes desde el punto de vista clínico (incluyendo SS-A y Scl-70) que otros tests comerciales ANA pueden no detectar. Además, la especificidad del conjugado IgG elimina los resultados fisiológicos positivos falsos producidos por los autoanticuerpos IgM de valoración baja que se encuentran normalmente en personas mayores, pero sanas. Procedimiento de trabajo En la técnica de inmunofluorescencia indirecta, las muestras se incuban con un substrato de antígenos y posteriormente se lavan para eliminar los anticuerpos que no han reaccionado. El substrato se incuba con un conjugado específico marcado con fluoresceína y posteriormente se lava para eliminar el reactivo que no se ha enlazado. Cuando se observan a través de un microscopio de fluorescencia, las muestras positivas para autoanticuerpos mostrarán una fluorescencia de color verde manzana en las áreas de la célula o del núcleo donde se ha enlazado el autoanticuerpo. Reactivos 1. Portaobjetos con substrato HEp-2 (células epiteliales humanas); 12 portaobjetos/pocillos, con desecante 2. Conjugado de anticuerpos anti-igg humana (Cabra) marcados con fluoresceína en tampón con Azul de Evans y un 0.09% de azida sódica, 15mL 3. Control de Patrón ANA Titulable, 1 vial de tampón con un 0.09% de azida sódica y anticuerpos de suero humano anti-hep-2, prediluido, 0.5mL 1
2 4. Control Negativo para Sistemas IFA, 1 vial de tampón con un 0.09% de azida sódica y sin anticuerpos de suero humano anti-hep-2, prediluido, 0.5mL 5. Concentrado de PBS (40x), suficiente para 2000 ml 6. Medio de Montaje, 0.09% de azida sódica, 7mL 7. Cubreobjetos Advertencias 1. Todo material de origen humano usado en la preparación de los controles para este producto se ha examinado resultando negativo para anticuerpos contra HIV, HBsAg, y HCV por métodos aprobados por la FDA. Ningún método puede sin embargo ofrecer garantía completa que HIV, HBV, HCV o otros agentes contagiosos estén ausentes. Por lo tanto, los Control de Patrón ANA Titulable y Control Negativo para Sistemas IFA deben manejarse como si fueran material potencialmente contagioso Dado que se utiliza azida sódica como conservante, este producto puede ser tóxico por ingestión o absorción a través de piel o mucosas. La azida sódica puede reaccionar con el plomo o cobre de las tuberías para formar azidas metálicas potencialmente explosivas. Si se utilizan desagües para la eliminación de reactivos se recomienda lavarlos con abundante agua para prevenir la formación de dichas azidas metálicas. 3. Se recomienda utilizar el equipo protector apropiado al trabajar con este kit. 4. Los reactivos derramados deben limpiarse inmediatamente. Siga las normas aplicables en su laboratorio acerca de la eliminación de residuos. Precauciones 1. Este producto es para ser usado en el Diagnóstico In Vitro. 2. La sustitución de componentes diferentes de los incluidos en el sistema puede generar resultados inconsistentes. 3. Un lavado incompleto o ineficiente de los pocillos puede dar lugar a un fondo elevado. 4. La adaptación de este ensayo para su uso en procesadores automáticos u otros aparatos de manipulación de líquidos, totalmente o en parte, puede producir diferencias en los resultados de la prueba respecto a los obtenidos con el procedimiento manual. Es responsabilidad de cada laboratorio el validar que su procedimiento automático produzca resultados dentro de unos límites aceptables. 5. Una gran variedad de factores puede afectar al rendimiento del ensayo. Entre estos factores pueden incluirse la temperatura de los reactivos al inicio del proceso, la potencia de la lámpara del microscopio, la fiabilidad y reproducibilidad de la técnica de pipeteo usada, las condiciones de lavado y la duración de los tiempos de incubación. Se requiere trabajar de una manera consistente para obtener resultados precisos y reproducibles. 6. El conjugado anti Humano IgG puede experimentar cambios de color con el tiempo debido a la exposición a la luz, estos cambios, sin embargo, no afectan a su rendimiento. 7. Se recomienda seguir estrictamente el protocolo. Condiciones de Almacenaje 1. Guardar todos los reactivos del kit en nevera a 2-8 C. No congelar. Los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad si son almacenados y manipulados correctamente. 2. La solución de lavado diluida es estable 4 semana a 2-8 C. Recolección de Muestras Este kit requiere suero como muestra. La adición de azida u otros conservantes a las muestras puede afectar adversamente los resultados. No deben utilizarse muestras contaminadas, tratadas por calor o que contengan partículas visibles. Deben asimismo evitarse las muestras lipémicas o hemolizadas. Tras la recolección de las muestras de sangre, el suero debe ser separado del coágulo. El documento NCCLS H18-A2 recomienda las siguientes condiciones de almacenaje para muestras: 1) Guardar las muestras a temperatura ambiente no más de 8 horas. 2) Si el ensayo no se va completar en 8 horas, refrigerar la muestra a 2-8 C. 3) Si el ensayo no se va completar entre 48 horas, o para enviar las muestras, congelar a -20 C o a temperatura inferior. Una vez descongeladas las muestras deben agitarse bien antes de utilizarse. Procedimiento Materiales Suministrados pocillos con substrato HEp mL Conjugado de anticuerpos anti-igg 1 0.5mL Control de Patrón ANA Titulable 1 0.5mL Control Negativo para Sistemas IFA 2 25mL Concentrado de PBS (40x) 1 7mL Medio de Montaje 1 20 Cubreobjetos 2
3 Material necesario no incluido Micropipetas con capacidad para pipetear de 15 a 1000μL Agua destilada o desionizada Frascos lavadores o pipetas Pasteur Cámara húmeda Recipiente de 1L de capacidad (para diluir PBS) Cubeta de Coplin Microscopio de fluorescencia con una emisión de fluorescencia de 495nm y un filtro de barrera de 515nm Metodología Antes de empezar 1. Llevar todos reactivos y muestras a la temperatura ambiente (20-26 C) y agitar. 2. Diluya el concentrado de PBS: IMPORTANTE: Diluya el concentrado de PBS a 1:40 añadiendo el contenido de la botella de concentrado de PBS a 975mL de agua destilada o desionizada y mezcle completamente. El tampón de PBS se utiliza para diluir las muestras de pacientes y como tampón de lavado. El tampón diluido puede almacenarse un máximo de 4 semanas a una temperatura de 2-8 C. 3. Diluya las Muestras de los Pacientes: a. Screening Inicial: Diluya las muestras de los pacientes a 1:40 con un tampón de PBS diluido (esto es, añada 50μL de suero a 1.95mL del tampón de PBS). b. Titulación: Realice series de diluciones dobles a partir de la dilución inicial de screening para todas las muestras positivas con el tampón de PBS diluido (p. ej. 1:80, 1:160,... 1:2560). Procedimiento de Ensayo 1. Preparación de los portaobjetos con substrato: Espere a que el portaobjetos con substrato alcance la temperatura ambiente antes de extraerlo de su funda. Etiquételo y colóquelo en una cámara húmeda adecuada. Añada 1 gota (20-25μL) de control positivo y negativo sin diluir en los pocillos 1 y 2 respectivamente. Añada 1 gota (20-25μL) de la muestra del paciente diluida a los pocillos restantes. 2. Incubación del portaobjetos: Incube el portaobjetos durante minutos en una cámara húmeda (una servilleta de papel humedecida colocada plana en el fondo de un recipiente cerrado de plástico o cristal le permitirá mantener las condiciones de humedad adecuadas). No permita que el substrato se seque durante el procedimiento de ensayo. 3. Lavado de los portaobjetos: Tras la incubación, utilice un frasco de lavado o una pipeta para lavar suavemente el suero con el tampón de PBS diluido. Oriente el portaobjetos y el chorro del tampón PBS de forma que le permita evitar, en la medida de lo posible, que la solución pase por encima de varios pocillos a la vez. Evite dirigir el chorro directamente sobre los pocillos para que no se dañe el substrato. Si está deseado, ponga los portaobjetos en un tarro de Coplin del almacenador intermediario diluido de PBS por hasta 5 minutos. 4. Adición de conjugado fluorescente: Expulse el exceso de tampón PBS. Sitúe el portaobjetos de nuevo en la cámara húmeda y cubra inmediatamente cada pocillo con una gota de conjugado fluorescente. Incube los portaobjetos durante otros minutos. 5. Lavado de los portaobjetos: Repita el paso Cubreobjetos: Los procedimientos para los cubreobjetos varían de un laboratorio a otro; sin embargo, recomendamos el siguiente procedimiento: a. Sitúe un cubreobjetos en una toallita de papel. b. Aplique el medio de montaje siguiendo una línea continua en el borde inferior del cubreobjetos. c. Elimine el exceso de tampón PBS y ponga en contacto del borde inferior del portaobjetos con el borde del cubreobjetos. Deje caer suavemente el portaobjetos sobre el cubreobjetos de forma que el medio de montaje fluya hacia el borde superior del portaobjetos sin que se formen burbujas de aire ni se queden atrapadas. Control de Calidad El Control de Patrón ANA Titulable y el Control Negativo para Sistemas IFA deberían ensayarse para cada portaobjetos con el fin de asegurar que todos los reactivos y los procedimientos se han llevado a cabo de la forma adecuada. Los controles adicionales de suero adecuados deberán prepararse alicuotando las mezclas de suero humano y almacenándolo a < -70 o C. Para que los resultados se consideren válidos, deben cumplirse todos y cada uno de los siguientes criterios. Si alguno de ellos no se cumple, el resultado del test se considerará inválido y el ensayo deberá repetirse. 1. El Control de Patrón ANA Titulable sin diluir debe ser > El Control Negativo para Sistemas IFA debe ser negativo. Interpretación de los Resultados Reacción Negativa. Se considerará una muestra como negativa si la tinción específica es igual o inferior al Control Negativo para Sistemas IFA. Las muestras pueden mostrar diversos grados de tinción de fondo 3
4 debido a los anticuerpos heterófilos o a niveles inferiores de autoanticuerpos contra algunos constituyentes del citoplasma, como las proteínas contráctiles. Reacción Positiva. Se considerará una muestra como positiva si la tinción específica es superior al Control Negativo para Sistemas IFA. Determine el patrón de tinción de cada muestra y pondere su intensidad de acuerdo con los siguientes criterios: 4+ Fluorescencia verde manzana brillante 3+ Fluorescencia verde manzana claro 2+ Fluorescencia positiva claramente visible 1+ La menor fluorescencia específica que permite diferenciar claramente una nuclear y/u citoplasmática estructura celular de la fluorescencia de fondo. Interpretación de los patrones. Pueden presentarse diversos patrones de tinción nuclear y/u citoplasmática dependiendo de los tipos y de las cantidades relativas de autoanticuerpos presentes en la muestra. Pueden presentarse los siguientes patrones de tinción: Homogéneo: Tinción sólida del núcleo con o sin enmascaramiento aparente de los nucleolos. Antígenos Nucleares presentes: ADN de doble cadena, ADN de cadena simple, histonas Enfermedad asociada: Las valoraciones elevadas sugieren la presencia de LES; las valoraciones inferiores sugieren la presencia de LES u otras enfermedades del tejido conectivo. Periférico: Tinción sólida, primordialmente alrededor de la región más exterior del núcleo y tinción más débil hacia la parte central del núcleo. Antígenos Nucleares presentes: ADN de doble cadena, ADN de cadena simple, DNP, histonas Enfermedad asociada: Las valoraciones elevadas sugieren la presencia de LES; las valoraciones inferiores sugieren la presencia de LES u otras enfermedades del tejido conectivo. Moteado: Tinción fina o de apariencia granulosa del núcleo, generalmente sin tinción fluorescente de los nucleolos. Antígenos Nucleares presentes: Sm, RNP, Scl-70, SS-A, SS-B, y otros sistemas antígeno/anticuerpo todavía sin caracterizar. Enfermedad asociada: Las valoraciones elevadas sugieren la presencia de LES (anticuerpo anti- Sm), enfermedades combinadas del tejido conectivo (anticuerpo anti-rnp), escleroderma (anticuerpo anti-scl-70), o el complejo síndrome de Sjogren-sicca (anticuerpo anti-ss-b); las valoraciones inferiores sugieren otras enfermedades del tejido conectivo. Nucleolar: Tinción con motas grandes y gruesas en el núcleo, generalmente un número inferior a 6 por célula, con o sin motas finas ocasionales. Antígenos Nucleares presentes: 4-6S ARN y otros antígenos nucleares desconocidos. Enfermedad asociada: Las valoraciones elevadas son frecuentes en el escleroderma y el síndrome Sjogren. Centromérico: Patrón de tinción con motas discretas. Las motas del núcleo son muy discretas y normalmente son múltiplos de 46. Antígenos Nucleares presentes: Centrómeros cromosómicos (cinetocoro). Enfermedad asociada: Altamente indicativa del síndrome de CREST, una variante de la esclerosis sistémica progresiva (PSS). CREST es un tipo de PSS con calcinosis prominente, además del fenómeno Raynaud, dismotilidad esofágica y lesiones limitadas de la piel (frecuentemente confinadas a la cara o los dedos), telangiectasia. Mitocondrial: Moteado discreto del citoplasma y relativamente moderado en el área del núcleo. Antígenos presentes: Varios tipos de antígenos mitocondriales. Enfermedad asociada: Las valoraciones elevadas indican cirrosis biliar primaria. Es importante que el usuario sepa hasta qué punto puede confiar en los patrones para determinar la especificidad de los autoanticuerpos, excepto en el caso del patrón nuclear y el patrón centromérico, en los que cada uno de los antígenos está muy bien definido y sus patrones son característicos. Ya que muchos autoanticuerpos, o combinaciones de los mismos, pueden inducir un patrón moteado u homogéneo, se recomienda la realización de ensayos de seguimiento de los autoanticuerpos (tales como para el ADN de doble cadena o ENA) en todas las muestras moteadas u homogéneas. Limitaciones del Procedimiento 1. Las valoraciones elevadas de ANA sugieren enfermedades del tejido conectivo pero no deberían tener una validez diagnóstica. Los resultados de ANA deberían considerarse en combinación con otros resultados serológicos así como con el historial clínico del paciente. 2. Los patrones de ANA cambian frecuentemente cuando la muestra se valora según el punto final. Este fenómeno se debe a que los anticuerpos con menor valoración están por debajo de la sensibilidad del sistema, puesto que se ensaya con una muestra más diluida. 3. Varios factores externos influyen en la sensibilidad del ensayo, como pueden ser el tipo de microscopio de fluorescencia utilizado, la potencia y antigüedad de la lámpara, los aumentos utilizados, el sistema de filtros y la subjetividad del técnico. 4. Si se utiliza un filtro paso banda en lugar de un filtro de barrera 515, puede observarse un aumento de la tinción de los artefactos. 5. Para etiquetar los portaobjetos utilice solamente un lápiz. La utilización de cualquier otro instrumento de escritura puede ocasionar una tinción de los artefactos. 6. Todas las cubetas de Coplin que se utilicen en el lavado de los portaobjetos deben estar limpias de 4
5 residuos de tintura. La utilización de cubetas de Coplin con residuos de tintura puede provocar la tinción de los artefactos. 7. Los resultados de este ensayo deben utilizarse conjuntamente con hallazgos clínicos y otras pruebas serológicas. 8. La funcionalidad del ensayo no ha sido establecida para matrices diferentes del suero. Valores Esperados Se ensayó una serie de muestras de pacientes con enfermedades del tejido conectivo, así como 200 muestras aleatorias de donantes de sangre, utilizando el kit NOVA Lite TM HEp-2 ANA. Los resultados se muestran a continuación: Grupo de pacientes Número Número de positivos con NOVA Lite TM HEp-2 ANA LES Lupus inducido por la medicación Artritis reumatoide Escleroderma Dermatomiositis Síndrome de Sjogren Normales Referencias 1. Tan EM: Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: , Tan EM, et al.: The 1982 Revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: , Casalo SP, Friou GJ and Myers LL: Significance of antibodies to DNA in systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7: , Gonzalez E and Rothfield N: Immunoglobulin class and pattern of nuclear fluorescence in systemic lupus erythematosus. The New England Journal of Medicine 274: , Wiik A: Antinuclear factors in sera from healthy blood donors. Acta Path Microbiology Scand. 84: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition Fabricante: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service ESP June 2009 Revision 19 5
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