LA CITOMETRIA DE FLUJO

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1 LA CITOMETRIA DE FLUJO José Enrique O Connor Centro de Citometría y Citómica Dpto. de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Medicina

2 LA CELULA COMO UNIDAD FUNCIONAL DEL ORGANISMO DIAGNOSTICO MORFOLOGICO DIAGNOSTICO FUNCIONAL

3 LA CELULA COMO UNIDAD INTEGRADORA DEL ORGANISMO DIAGNOSTICO BIOQUIMICO DIAGNOSTICO GENOMICO

4 LA CELULA COMO UNIDAD INTEGRADORA DEL ORGANISMO Se necesita una técnica de diagnóstico e investigación que permita: Integrar el nivel celular y molecular Resolver la heterogeneidad celular de los tejidos Detectar células muy infrecuentes

5 LA CELULA COMO UNIDAD DE ESTUDIO Y DIAGNOSTICO CITOMETRIA DE FLUJO!!!!

6 ASPECTOS BASICOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO Concepto de citometría de flujo Funcionamiento de un citómetro de flujo Fluorescencia y marcadores fluorescentes Parámetros analizables por citometría de flujo Aplicaciones de la citometria de flujo La citometría del futuro

7 CONCEPTO DE CITOMETRIA DE FLUJO Método analítico por el que se mide la emisión de múltiples fluorescencias y la dispersión de luz de células o partículas microscópicas, alineadas mediante una corriente líquida laminar, cuando son presentadas de una en una y a gran velocidad frente a una o múltiples fuentes de iluminación.

8 CONCEPTO DE CITOMETRIA DE FLUJO Proteínas extracelulares Secuencias de ADN o ARN libres Complejos inmunes circulantes Viriones individuales Liposomas Cromosomas aislados Orgánulos aislados Núcleos aislados Bacterias Hongos unicelulares Células humanas y animales Protoplastos vegetales Hibridomas y fusiones celulares Esferoides Cuerpos embrioides Larvas y embriones Organismos pluricelulares

9 CONCEPTO DE CITOMETRIA DE FLUJO Células o partículas biológicas individuales en suspensión Método analítico que mide la emisión simultánea de múltiples fluorescencias y dispersión de luz CITOMETRIA DE FLUJO Alineadas de forma secuencial por un flujo laminar y presentadas de una en una a gran velocidad en un punto óptimo de iluminación

10 ASPECTOS BASICOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO Concepto de citometría de flujo Funcionamiento de un citómetro de flujo Fluorescencia y marcadores fluorescentes Parámetros analizables por citometría de flujo Aplicaciones de la citometria de flujo La citometría del futuro

11 FUNCIONAMIENTO DE UN CITOMETRO DE FLUJO Sistema de Fluidos Sistema Optico Sistema Electrónico Partículas en suspensión individual que fluyen secuencialmente a través de un volumen iluminado donde dispersan luz y emiten fluorescencia que es dirigida y filtrada y convertida a valores digitales que se almacenan en un ordenador

12 SISTEMA DE FLUIDOS Inyección de la muestra y cámara de flujo

13 SISTEMA DE FLUIDOS La base de la aplicación más común de la Citometría de Flujo es el uso de luz láser enfocada para iluminar células alineadas mediante un sistema de fluidos capaz de enfoque hidrodinámico Líquido envolvente Cámara de Flujo Fluorescencia Laser enfocado

14 SISTEMA DE FLUIDOS Enfoque Hidrodinámico

15 SISTEMA OPTICO Lámparas: Xenon, Mercurio Láser: Refrigerados por aire: Ar, He-Ne Refrigerados por agua: Ar, Kr, He-Cd Diodos Filtros: Bloqueo Dicroicos Paso de Banda Emisión de fluorescencia y bancada óptica: Epics XL

16 SISTEMA ELECTRONICO Detección y Amplificación de señal: Transformación de señal luminosa en pulso eléctrico

17 SISTEMA ELECTRONICO Eliminación de señales no deseadas: Discriminador

18 SISTEMA ELECTRONICO Conversión Analógica-Digital

19 SISTEMA ELECTRONICO Clasificación de las señales: Histograma de frecuencias

20 Histogramas SISTEMA INFORMATICO Dot-plots Representación Lineal Representación Logarítmica

21 SISTEMA INFORMATICO Acotamiento de subpoblaciones de interés

22 SISTEMA INFORMATICO Análisis Cinético

23 ASPECTOS BASICOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO Concepto de citometría de flujo Funcionamiento de un citómetro de flujo Fluorescencia y marcadores fluorescentes Parámetros analizables por citometría de flujo Aplicaciones de la citometria de flujo La citometría del futuro

24 FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES LA LUZ ES ENERGIA

25 FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES 1 Un fotón de energía hn EX es absorbido por la molécula fluorescente, creando un estado excitado (S 1) 2 El estado excitado tiene una duración de segundos 3 FLUORESCENCIA Un fotón de energía hn EM es emitido para devolver la molécula fluorescente a su estado basal (S0)

26 FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES LA LUZ ES COLOR

27 FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES EL COLOR ES INFORMACION

28 FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES FLUOROFORO `PROPIEDAD BIOLOGICA `PROPIEDAD BIOLOGICA FLUOROCROMO FLUOROCROMO FLUOROCROMOS, FLUOROFOROS Y MARCADORES FLUORESCENTES

29 FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES MOLECULAS CON REACTIVIDAD QUIMICA MOLECULAS CON ESPECIFICIDAD ESTRUCTURAL INDICADORES Y QUELANTES DE IONES SUSTRATOS DE ENZIMAS Y TRANSPORTADORES MACROMOLECULAS Y POLIMEROS SINTETICOS FLUOROCROMOS INTRACELULARES NATURALES CLASIFICACIÓN FUNCIONAL DE MARCADORES FLUORESCENTES

30 FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES Emisión Excitación Longitud de onda

31 FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES Transferencia de energía entre moléculas vecinas Estado Excitado Energía Estado Basal Molécula Dadora PE Molécula Aceptora Texas Red/Cy5/Cy7 Fluorescencia TRANSFERENCIA DE ENERGIA DE FLUORESCENCIA (FRET)

32 FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES Molecule 1 Molecule 2 Fluorescence DONOR ACCEPTOR Fluorescence Absorbance Absorbance Wavelength TRANSFERENCIA DE ENERGIA DE FLUORESCENCIA (FRET)

33 FLUORESCENCIA The Visible Y Spectrum MARCADORES FLUORESCENTES Fluorocromos en tándem Ficoeritrina + Cianinas 488 nm Argon R-Phycoerythrin Cy 5 Cy 5.5 Cy nm 675 nm 575 nm 760 nm FLUOROCROMOS EN TANDEM: FICOERITRINA +CIANINAS

34 FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES PE-AF APC 660 FITC 520 PE 575 ECD 615 PC5 665 PC7 670 APC-AF < >750 ultra- violeta azul verde amarillo naranja rojo infrarrojo violeta LASER 488 LASER 630 FLUOROCROMOS EN TANDEM PARA ROJO LEJANO

35 ASPECTOS BASICOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO Concepto de citometría de flujo Funcionamiento de un citómetro de flujo Fluorescencia y marcadores fluorescentes Parámetros analizables por citometría de flujo Aplicaciones de la citometria de flujo La citometría del futuro

36 PARAMETROS ANALIZABLES POR CITOMETRIA DE FLUJO Parámetros Nucleares Enzimas Pared celular Proteinas Moléculas de superficie Proteinas Enzimas Moléculas de superficie Enzimas Parámetros de Superficie Parámetros Citoplasmáticos Parámetros Extracelulares Proteinas secretadas

37 ASPECTOS BASICOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO Concepto de citometría de flujo Funcionamiento de un citómetro de flujo Fluorescencia y marcadores fluorescentes Parámetros analizables por citometría de flujo Aplicaciones clínicas de la citometria de flujo La citometría del futuro

38 APLICACIONES CLINICAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS ANALISIS DE PARAMETROS FUNCIONALES

39 INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE: OBJETIVO Determinar la presencia y cuantificar la expresión de proteínas (antígenos) o de regiones de las mismas (epitopos) en la superficie de las células de la sangre, tejidos linfoides, líquidos biológicos o cultivos celulares, usando combinaciones adecuadas de anticuerpos fluorescentes.

40 INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE: METODOLOGIA Se realiza mediante el marcaje de antígenos de la membrana plasmática con anticuerpos mono- o policlonales conjugados con fluorocromos. El proceso de preparación de la muestra es mínimo en la mayoría de las determinaciones (sangre entera) o puede requerir etapas de: Concentración celular: líquidos biológicos (LCR, orina, etc.) Dispersión celular: lavado broncoalveolar, esputo inducido Disgregación mecánica: tejidos linfoides, tejidos mucosos Disgregación enzimática: tejidos sólidos, cultivos en monocapa Estimulación celular controlada: estudios de activación

41 INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE: INFORMACION Las combinaciones de anticuerpos monoclonales y técnicas de análisis permiten identificar subpoblaciones específicas de células y determinar: Linaje celular Grado de maduración Grado de activación Clonalidad de cadenas ligeras de inmunoglobulinas y del receptor TCR Expresión de proteínas de fusión en translocaciones cromosómicas

42 INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE: HEMATOLOGIA Diagnóstico y pronóstico de leucemias, linfomas, síndromes linfoproliferativos y síndromes mielodisplásicos Detección de Enfermedad Mínima Residual Recuento absoluto de células CD34 + viables circulantes o en preparaciones celulares para el auto- o alotransplante de precursores hematopoyéticos Diagnóstico de Hemoglobinuria Paroxística Nocturna Detección de fenotipo MDR (resistencia a fármacos) mediado por la glicoproteína-p

43 INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE: INMUNOLOGIA Determinación de porcentaje y recuento absoluto de subpoblaciones linfocitarias T, B y NK en el seguimiento de inmunodeficiencias y otras alteraciones de la respuesta inmunitaria Recuento absoluto de CD4+ y cociente CD4/CD8 en pacientes con VIH Detección de leucocitos activados en sangre periférica o en preparaciones celulares estimuladas Detección de aloanticuerpos y autoanticuerpos circulantes o unidos a células Diagnóstico de deficiencias en moléculas de adhesión Identificación de basófilos circulantes y detección de la desgranulación provocada por alergenos.

44 INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE: HEMOSTASIA Diagnóstico de deficiencias congénitas de glicoproteínas plaquetarias Detección ex vivo de plaquetas activadas circulantes in vivo Determinación de la reactividad plaquetaria ex vivo Cuantificación de receptores gpiib/iiia ocupados en la terapia antiagregante plaquetaria con antagonistas de gpiib/iiia

45 DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES : OBJETIVO Determinar la presencia y cuantificar la expresión de proteínas (antígenos) o de regiones de las mismas (epitopos) en la cara interna de la membrana plasmática, citoplasma, vesículas o núcleo de las células de sangre, tejidos linfoides, líquidos biológicos o cultivos celulares, utilizando combinaciones de anticuerpos fluorescentes.

46 DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES: METODOS El proceso de preparación de la muestra requiere etapas de fijación y permeabilización para hacer accesibles los epitopos intracelulares. El proceso de preparación de la muestra es menor en la mayoría de las determinaciones (sangre entera) o puede requerir etapas de: Concentración celular: líquidos biológicos (LCR, orina, etc.) Dispersión celular: lavado broncoalveolar, esputo inducido Disgregación mecánica: tejidos linfoides, tejidos mucosos Disgregación enzimática: tejidos sólidos, cultivos en monocapa Estimulación celular controlada: estudios de activación Bloqueo de la exportación de proteínas: proteínas de secreción (citoquinas)

47 DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES: INFORMACION Las combinaciones de anticuerpos monoclonales y técnicas de análisis permiten identificar: Linaje celular Grado de maduración Grado de activación Expresión de enzimas intracelulares Activación de enzimas intracelulares Expresión de proteínas reguladoras del ciclo celular Expresión de antígenos relacionados con la apoptosis Expresión de proteínas de fusión en translocaciones cromosómicas.

48 DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES: APLICACIONES Diagnóstico y pronóstico de leucemias, linfomas y síndromes linfoproliferativos Detección de Enfermedad Mínima Residual Detección de leucocitos activados en sangre o preparaciones celulares estimuladas Identificación de células productoras de citociinas Estudio de la polarización TH1/TH2/TH17 en linfocitos TH activados Identificación de células Tregs

49 DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES: APLICACIONES Identificación de células en fase de proliferación Identificación de células tumorales en muestras complejas Identificación y cuantificación de células tumorales circulantes en sangre y líquidos biológicos Estudio de la regulación del ciclo celular Identificación de células en apoptosis temprana o tardía Análisis de los mecanismos reguladores y ejecutores de la apoptosis

50 DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES: APLICACIONES Diagnóstico de deficiencias en moléculas de adhesión leucocitarias Diagnóstico de anomalías congénitas en el citoesqueleto Diagnóstico de deficiencias congénitas de almacenamiento en plaquetas Identificación y cuantificación de eritrocitos con hemoglobina fetal en el adulto

51 ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS : OBJETIVO Determinar la presencia y cuantificar los niveles de ácidos nucleicos (ADN y ARN) en células enteras, células permeabilizadas o suspensiones de núcleos aislados a partir de sangre periférica, tejidos linfoides, líquidos biológicos, biopsias y otras muestras de tejidos sólidos y cultivos celulares, utilizando fluorocromos que se unen a los ácidos nucleicos.

52 ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS: METODOLOGIA La determinación de la ploidía o el ciclo celular, requieren el acceso estequiométrico del fluorocromo al núcleo celular, por lo que utilizan células fijadas y/o permeabilizadas, o suspensiones de núcleos aislados. Según la aplicación, el proceso de preparación de la muestra puede ser mínimo o requerir etapas de fijación y permeabilización. Los fluorocromos permeables de ácidos nucleicos penetran en células en fresco y permiten distinguir las células nucleadas en sangre entera u otras muestras hematológicas o detectar los ácidos nucleicos residuales en eritrocitos y plaquetas inmaduras. Los fluorocromos impermeables de ácidos nucleicos se usan para detectar cambios en la permeabilidad de membrana asociados con apoptosis y necrosis.

53 ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS: INFORMACION Las técnicas de análisis basadas en el uso de fluorocromos específicos de ácidos nucleicos en células permeabilizadas permiten: Determinar la ploidía celular Detectar la presencia de células en proliferación Calcular la distribución en las fases del ciclo celular Identificar células nucleadas en sangre (leucocitos, eritroblastos) Estimar el grado de maduración de precursores de eritrocitos y plaquetas Identificar y cuantificar células vivas, apoptóticas y necróticas

54 ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS: APLICACIONES Pronóstico de leucemias, linfomas y síndromes linfoproliferativos. Cálculo de la ploidía en tumores sólidos y neoplasias hematológicas. Identificación de células en fases de proliferación en tumores sólidos y hematológicos. Determinación del ciclo celular en cultivos celulares in vitro. Determinación de la activación de linfocitos por mitógenos in vitro. Análisis de la proliferación de células tumorales en muestras complejas. Identificación y cuantificación de células tumorales circulantes Estudio de la regulación del ciclo celular Identificación de células en apoptosis temprana o tardía. Análisis de los mecanismos reguladores y ejecutores de la apoptosis. Determinación de la viabilidad celular. Cuantificación de la actividad citotóxica de células NK y linfocitos CD8 activados. Identificación de reticulocitos y cálculo del Indice de Madurez Reticulocitaria (RMI). Identificación de plaquetas reticuladas y cálculo del Indice de Madurez Plaquetaria (PMI).

55 ANALISIS DE PARAMETROS FUNCIONALES: OBJETIVO Analizar, de forma cualitativa o cuantitativa, fenómenos dinámicos o transitorios de la Bioquímica intracelular, cuya alteración sea causa, consecuencia o esté relacionada con situaciones fisiopatológicas de relevancia clínica. +ADP

56 ANALISIS DE PARAMETROS FUNCIONALES: METODOS Se realiza usando fluorocromos, sustratos fluorogénicos específicos o partículas fluorescentes cuyas propiedades varían en función de: Entorno celular: ph, iones, moléculas oxidantes, reductoras Actividad de enzimas intracelulares específicos: oxidasas, peptidasas Transporte a través de membrana plasmática o de orgánulos Acumulación selectiva en compartimentos intracelulares El proceso de preparación de la muestra debe respetar la viabilidad y competencia funcional. En muchas aplicaciones en Inmuno-Hematología, el análisis funcional se puede realizar en muestras de sangre entera, con un grado de manipulación mínima. En estudios de activación, se puede requerir una etapa de estimulación celular controlada.

57 ANALISIS DE PARAMETROS FUNCIONALES: INFORMACION Fluidez y permeabilidad de membrana Fagocitosis de microorganismos Transporte de partículas y moléculas solubles al interior de la célula Retención intracelular de moléculas Extrusión de sustratos a través de bombas de eflujo Potenciales de membrana plasmática y mitocondrial ph intracelular y su regulación dinámica Movimientos de iones a través de membrana o desde depósitos intracelulares, Generación de especies reactivas de oxígeno y óxido nítriconiveles de glutátion Citoenzimología de flujo Síntesis de ADN Niveles de depósitos de lípidos metabólicos y estructurales

58 ANALISIS DE PARAMETROS FUNCIONALES: APLICACIONES Identificación de blastos en el diagnóstico de leucemias. Seguimiento de la activación de leucocitos o plaquetas. Análisis del contenido en iones y la regulación del equilibrio iónico celular. Detección de la expresión de superficie procoagulante en plaquetas. Seguimiento y cuantificación de fagocitosis de microbios o partículas sintéticas. Análisis de la respuesta oxidativa en fagocitos ("Burst oxidativo"). Análisis de la actividad de proteasas intralisosomales en fagocitos. Análisis de la actividad proteolítica intracelular en células tumorales invasivas. Determinación del ph intracelular y su regulación. Análisis del estrés oxidativo inducido y de las defensas antioxidantes celulares. Identificación y cuantificación de células en apoptosis.

59 ASPECTOS BASICOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO Concepto de citometría de flujo Funcionamiento de un citómetro de flujo Fluorescencia y marcadores fluorescentes Parámetros analizables por citometría de flujo Aplicaciones de la citometria de flujo La citometría del futuro

60 LA EVOLUCION DE LA CITOLOGIA ANALITICA CITOLOGIA CITOMETRIA CITOMICA Aumento de complejidad técnica y de información generada Demanda de mejor rendimiento y mayor capacidad de análisis de datos Búsqueda de nuevos parámetros biológicos y nuevas áreas de aplicación

61 NUEVA INSTRUMENTACION Flow Cytometry Confocal Microscopy Laser Scanning Cytometry Mass-Spectrometry Flow Cytometry High Content Analysis by Automated Bioimage Analysis Multispectral Image-in-flow Cytometry

62 CITOMETRIA ACÚSTICA: AUMENTO DE VELOCIDAD Acoustic focusing cytometry uses ultrasound waves (over 2 MHz) to position cells into a single focused line along the central axis of a flow channel without high velocity or high volumetric sheath fluid, which can damage cells. The acoustic focusing actually concentrates the cells in the center of the fluid with sound energy. This means considerable flexibility in the sample concentration. The end result is more accurate and precise data. Acoustic focusing separates the alignment of cells from the particle flow rate. This allows to increase or decrease flow without disrupting the focus of cells in the capillary.

63 CITOMETRIA DE ALTO RENDIMIENTO: SCREENING

64 HERRAMIENTAS BIOINFORMÁTICAS: MAYOR INFORMACION

65 CITOMETRIA DE IMAGEN EN FLUJO: FORMA Y FUNCIÓN Cells are hydrodinamically focused into a core stream and orthogonally illuminated for both darkfield and fluorescence imaging. The cells are simultaneously transilluminated via a spectrally limited source for brightfield imaging. Light is collected from the cells with an imaging objective lens and is projected on a charge coupled detector(ccd). Prior to projection on the CCD, the light is passed through a spectral descomposition optical system that directs different spectral bands to different lateral positions across the detector.

66 CITOMETRIA DE IMAGEN EN FLUJO: FORMA Y FUNCIÓN see every cell flexible viewing enhance & color tag populations virtual cell sort Tabular Data 200+ params/cell population statistics object values Workspace uni + bivariates flexible gating click dot to view cell custom parameters

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