AGRADECIMIENTOS... VII RESUMEN... XIII RESUM... XV SUMMARY... XVII ABREVIATURAS... XIX ÍNDICE DE CONTENIDO... XXIII ÍNDICE DE FIGURAS...

Transcripción

1 ÍNDICE AGRADECIMIENTOS... VII RESUMEN... XIII RESUM... XV SUMMARY... XVII ABREVIATURAS... XIX ÍNDICE DE CONTENIDO... XXIII ÍNDICE DE FIGURAS... XXXI ÍNDICE DE TABLAS... XXXVII INTRODUCCIÓN La mitocondria Funciones mitocondriales Dinámica mitocondrial Fisión mitocondrial Fusión mitocondrial Procesos celulares relacionados con la dinámica mitocondrial Patologías humanas asociadas a fallos en la dinámica de la mitocondria La levadura como modelo de estudio de la mitocondria Adaptación a estrés de la mitocondria Consideraciones generales sobre el estrés... 20

2 2.2. La mitocondria como orgánulo productor y detoxificador de estrés oxidativo Cambios en el metabolismo mitocondrial ante estrés Señalización por glucosa La ruta retrógrada Cambios adaptativos de la mitocondria durante estrés Caso particular: proteína Mpc Control de calidad mitocondrial Sistemas de control de calidad moleculares Función de la dinámica mitocondrial en el control de calidad Mitofagia La mitofagia en levadura La mitofagia en mamíferos Alternativas a la mitofagia OBJETIVOS MATERIALES Y MÉTODOS Material biológico y condiciones de crecimiento Cepas y condiciones de cultivo de bacterias Cepas y condiciones de cultivo de levadura Plásmidos utilizados Ensayos de sensibilidad Ensayos de crecimiento en medio líquido Ensayos de crecimiento en medio sólido (Goteos) Técnicas de transferencia génica Transformación de bacterias Preparación de bacterias quimiocompetentes... 55

3 Transformación de bacterias quimiocompetentes Preparación de bacterias electrocompetentes Transformación de bacterias electrocompetentes Transformación de levadura Manipulación y análisis de proteínas Obtención de extractos proteicos totales Electroforesis de proteínas Transferencia a membrana de proteínas (Western Blot) y tinción de membranas Detección inmunológica de proteínas y cuantificación Co-inmunoprecipitación de proteínas Co-inmunoprecipitación de proteínas mitocondriales Co-inmunoprecipitación de proteínas citosólicas Técnicas de manipulación génica Purificación de DNA genómico total de levadura Manipulación de fragmentos de DNA Extracción de plásmidos de bacteria y levadura Diseño de construcciones de deleción y amplificación génica Análisis de expresión mediante RT-PCR Obtención de RNA total mediante el método de fenol ácido Purificación y concentración del RNA total Síntesis de cdna mediante transcripción reversa PCR cuantitativa en tiempo real Análisis de las especies reactivas de oxígeno (ROS) Consumo de oxígeno... 69

4 9. Inducción y detección de mitofagia Ensayo de doble híbrido en levadura Análisis de la interacción proteína-proteína en placa Ensayo cuantitativo de la actividad β-galactosidasa Amplificación de una colección de plásmidos pact Transformación y screening de una colección de plásmidos en levadura Comprobación de los clones positivos en el ensayo de doble híbrido Microscopía confocal Aplicaciones bioinformáticas Análisis estadístico RESULTADOS CAPÍTULO 1. Función del transportador de piruvato mitocondrial (MPC) en la adaptación de la actividad mitocondrial Análisis bioinformático de la secuencia proteica de la familia MPC en S. cerevisiae Estudio de la expresión de las proteínas Mpc en respuesta a diferentes tipos de estrés Regulación transcripcional de los genes MPC ante estrés salino y cambio diáuxico Estudio fenotípico de los mutantes mpc Análisis fenotípico de las cepas de sobreexpresión de los genes MPC Análisis del efecto de la pérdida y ganancia de función de los genes MPC en la tasa respiratoria Cuantificación de los niveles de oxidación intracelular... 99

5 8. Caracterización de las interacciones de Mpc3 con otras proteínas de la familia MPC Relación funcional entre las proteínas Mpc y el transportador de carnitina mitocondrial Análisis del efecto de los genes MPC en la morfología mitocondrial CAPÍTULO 2. Caracterización de una mitofagia específica para complejos individuales de la cadena electrónica mitocondrial Análisis de los complejos mitocondriales de la cadena de transporte de electrones en condiciones de elevada tasa respiratoria Análisis de las proteínas de los complejos respiratorios mediante Western Blot Análisis de los genes responsables de la degradación de los complejos de la cadena de transporte electrónico ante una elevada tasa respiratoria Análisis del crecimiento de cepas de levadura mutantes para genes de autofagia Generación de un modelo de estudio de daño mitocondrial específico para levadura Efecto de la valinomicina en las proteínas de los complejos respiratorios mitocondriales Análisis de las proteínas de los complejos mitocondriales por el ensayo de Western Blot Comprobación de la degradación de los complejos I y III mediante microscopía confocal Comprobación de que la degradación controlada de la mitocondria en presencia de valinomicina ocurre en la vacuola en levadura: Sistema mtrosella Análisis de la degradación mitocondrial en diferentes condiciones

6 5.2. Análisis de la mitofagia mediante microscopía confocal en los mutantes atg11 y atg Análisis de crecimiento de mutantes de levadura en presencia de valinomicina Análisis de los genes implicados en la degradación de los complejos de la cadena de transporte de electrones en presencia de valinomicina Análisis de condiciones alternativas en las que se activa la mitofagia en levadura CAPÍTULO 3. Caracterización funcional de la proteína Atg11 en el proceso de mitofagia inducida por daño mitocondrial Estudio de la regulación génica y proteica de Atg Estudio del efecto de la sobreexpresión de Atg Análisis de la localización celular de Atg11 tras su sobreexpresión Efecto de la sobreexpresión de Atg11 en los complejos I y III de la cadena de transporte electrónico analizado por Western Blot Efecto de la sobreexpresión de Atg11 en los complejos I y III de la cadena de transporte electrónico analizado por microscopía confocal Localización de Atg11 en niveles endógenos Estudio de las interacciones proteicas de Atg Comprobación del sistema de doble híbrido: interacción Atg11-Atg Rastreo de proteínas que interaccionan con Atg11 en presencia y ausencia de valinomicina Verificación de los principales genes obtenidos por doble híbrido Estudio de la interacción Atg11-Atg

7 6. Análisis de la conservación de Atg11 en organismos superiores: Arabidopsis thaliana DISCUSIÓN CONCLUSIONES REFERENCIAS FIGURAS SUPLEMENTARIAS TABLAS SUPLEMENTARIAS ANEXO. Timón-Gómez, A., Proft, M., Pascual-Ahuir, A. (2013). Differential regulation of mitochondrial pyruvate carrier genes modulates respiratory capacity and stress tolerance in yeast. Plos one, 8(11): e